基于分子對接研究獨活寄生湯作用MMP-1、MMP-3的藥效物質基礎

鄭春松，陳春蓉，林平冬，吳廣文，李西海，葉蕻芝，劉獻祥

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122）

·實驗研究·

基于分子對接研究獨活寄生湯作用MMP-1、MMP-3的藥效物質基礎

鄭春松1，2，陳春蓉2，林平冬2，吳廣文2，李西海2，葉蕻芝1，劉獻祥1

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122）

目的探索獨活寄生湯作用基質金屬酶-1（MMP-1）和基質金屬酶-3（MMP-3）的藥效物質基礎。方法運用計算機模擬之分子對接技術，研究獨活寄生湯中化合物與MMP-1、MMP-3的相互作用，從中篩選出比原配體與各自靶蛋白作用的DOCK-SCORE高的化合物。結果以MMP-1為靶點，篩選出獨活寄生湯的潛在活性化合物172個，主要為苷類、黃酮類、有機酸類等化合物，其中，28個化合物也能作用于靶點MMP-3。結論以MMP-1、MMP-3為靶點，計算機模擬出獨活寄生湯的藥效物質基礎為172個化合物，提示其可能是通過有效成分群發揮治療骨關節炎的作用，為其骨關節炎臨床使用提供依據。

獨活寄生湯；骨關節炎；基質金屬酶；藥效物質基礎；分子對接

骨關節炎（osteoarthritis，OA），是一種以關節軟骨的退行性改變及繼發性的骨質增生為主要病理特點的慢性退行性骨關節疾病，已成為威脅人類健康最常見的一種疾病［1］。已有研究表明，正常的關節軟骨是由少量的軟骨細胞和大量的軟骨細胞外基質組成，其中，細胞外基質中主要含有膠原纖維和聚蛋白多糖等大分子物質。在OA中，當軟骨細胞外基質的降解超過其合成時，會降低軟骨基質凈含量，進而引起關節軟骨的部分甚至完全損耗，此為關節軟骨破壞的主要病理表現［2-3］。OA患者關節軟骨中基質金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase，MMP-1）和基質金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinase，MMP-3）表達均顯著高于正常對照組，其是導致軟骨聚蛋白多糖和膠原降解的關鍵酶［3-4］。獨活寄生湯源自唐代醫家孫思邈的《備急千金要方》，由獨活、細辛、防風、秦艽、肉桂和桑寄生等15味藥物組成，具有祛風濕、止痹痛、益肝腎和補氣血的功效［5］。將其用于OA臨床，能保護關節軟骨，發揮緩解疼痛的的效果［6-7］。前期課題組已經研究表明，獨活寄生湯含藥血清可抑制IL-1β誘導的退變關節軟骨細胞中MMP-1、MMP-3的表達［8］。因此，筆者運用分子對接［9-10］，尋找獨活寄生湯作用MMP-1和MMP-3的藥效物質基礎，從分子層面為其臨床治療OA提供依據。

1 材料

1.1 實驗材料獨活寄生湯分子集；MMP-1和MMP-3靶點。

1.2 實驗設備本研究使用北京大學化學與分子工程學院計算機模擬實驗室的Discovery Studio（DS）軟件進行計算，分子對接的模擬過程中涉及到的參數除非特別指明，否則均為默認值。

2 方法

2.1 配體和靶點的數據處理從《中藥原植物化學成分手冊》、北京大學中草藥有效成分三維結構數據庫和文獻［10-13］，收集獨活寄生湯化學成分566個，利用ISIS／Draw 2.5和DS軟件，繪制其化學結構，選用MMFF力場優化，保存為sd文件，建立獨活寄生湯配體分子數據集。根據OA的發病機制［14］和治療靶數據庫［15］，確定與延緩軟骨退變密切相關的靶點MMP-1和MMP-3。在RCSB Protein Data Bank上［16］，下載MMP-1和MMP-3的蛋白質結構，其代碼分別為3AYK和4G9L，見圖1。

圖1MMP-1、MMP-3的結構

2.2 分子對接和打分在DS LigandFit模塊進行獨活寄生湯分子集配體與OA靶點的對接工作［17］。其步驟為：①MMP-1和MMP-3結構去溶劑、去原配體、加氫處理后，用其結合的已知原配體活性化合物來確定活性位點；②使用Monte Carlo方法對獨活寄生湯的化學成分配體進行構象采樣、Dreiding力場下進行打分，保留得分最高的構象；③對對接成功的獨活寄生湯配體化合物按DOCKSCORE高低進行排序，篩選出比原配體與各自靶蛋白作用的DOCK-SCORE高的化合物，視為獨活寄生湯中的活性成分［9，18］，即獨活寄生湯作用于MMP-1和MMP-3的藥效物質基礎。

3 結果

在DS LigandFit模塊中，配體和靶點的作用遵循能量互補、幾何互補以及化學環境互補等原則，尋找各自最佳的DOCK-SCORE。以蛋白結構中已知的原配體活性化合物的DOCK-SCORE為閾值，發現獨活寄生湯潛在的活性成分172個，其中與MMP-1和MMP-3結合較好的化合物分別為172和28個，見表1和表2。結果顯示以MMP-1、MMP-3為靶點的藥效物質基礎主要由苷類、黃酮類和有機酸類成分組成。

表1 以MMP-1為靶點的分子對接結果

4 討論

方劑的藥效物質基礎是指中藥復方中發揮治療作用的化學成分，是闡明方劑藥效作用的關鍵［19］。而且，其有效成分是通過與體內的生物靶點相互作用而產生藥效的，藥物-受體結合時，存在靜電、范德華力、氫鍵和疏水等相互作用。這些性質可用分子模擬方法來計算［20］。分子對接計算作為最常用的分子模擬方法之一，它是將配體化合物置于受體活性位點，遵循幾何互補、能量互補以及化學環境互補的原則，來實時評價配體與受體相互作用的好壞，從中找到配體與受體之間最佳的結合模式，該方法在中醫藥研究中已有很多成功的應用。如曾茂貴等［21］利用分子對接LigandFit和Ligplot軟件研究扶正抑瘤復方中槲皮素、木犀草素、芹菜素與大豆黃素對環氧化酶-2的作用，結果發現槲皮素、木犀草素、芹菜素均有氫鍵作用，而大豆黃素沒有，從而揭示含有間二苯酚結構的化合物更有可能對環氧化酶-2起作用。此外，龍偉等［22-24］也成功應用分子對接技術揭示了黃連解毒湯、青風藤、白芷的藥效物質基礎。中藥復方是天然組合化學庫，如果應用“中藥到活性成分”的傳統途徑來研究中藥的藥效物質基礎，常常會出現篩選時間較長、假陽性的干擾、漏篩的缺點［25－26］。因此，本文將獨活寄生湯看作組合化合物庫，運用分子對接研究其藥效物質基礎。

表2 以MMP-3為靶點的分子對接結果

OA的特點是關節軟骨的進行性破壞，而MMPs的表達異常，會降解關節軟骨細胞外基質，引起關節軟骨腫脹，抵抗外力作用下降，進而造成關節軟骨的進行性破壞［1，27］。其中，MMP-1和MMP-3在OA退變軟骨中高表達，前者可使Ⅱ型膠原變性裂解，后者對蛋白聚糖有高度的裂解變性，還可激活前者，加速膠原的降解，使軟骨降解退變加劇［27-28］，提示MMP-1和MMP-3在關節軟骨的進行性破壞中起到重要作用。而且，治療肝腎虧虛、風濕痹阻痹證最常用且有效的古方獨活寄生湯已經證實能介導Wnt／β-catenin-BMP信號通路，能延緩關節軟骨的退行性病變［7，29］。由此本研究以MMP-1和MMP-3為靶點，以獨活寄生湯為研究對象，借助分子對接平臺，開展獨活寄生湯的藥效物質基礎研究。表1和表2顯示獨活寄生湯中黃酮類（扁蓄苷、異槲皮苷等）、苷類（大葉苷D、地黃苷A等）、有機酸（綠原酸、京尼平苷酸等）等化合物能與MMP-1、MMP-3有很好的作用。有些化合物活性文獻已經報道［30］，如綠原酸對高強度運動引起的膝關節軟骨損傷的保護作用等。因此，獨活寄生湯作用于MMP-1和MMP-3的藥效物質基礎為苷類、黃酮類和有機酸等組成的有效成分群，是未來我們開展獨活寄生湯治療OA的重點研究對象。

總之，本實驗從“活性成分到中藥”的反向途徑出發，建立了獨活寄生湯的化學成分分子數據集，以MMP-1和MMP-3為靶點來建立OA軟骨退變的虛擬藥理模型，借助分子對接平臺，研究了獨活寄生湯的藥效物質基礎。但該實驗也存在2個不足：①由于現有文獻對方中藥材的成分研究的局限，造成有些藥材的成分不全，進而無法闡釋各組成藥材在獨活寄生湯復方中所各自起到的作用；②由于本研究的靶點僅局限于軟骨退變，進而無法揭示獨活寄生湯中對于OA的治療起著關鍵性作用的化合物分子。后續本課題組將根據國內外學者對獨活寄生湯中各藥材成分的陸續報道，進一步完善其配體分子數據集，也會增加OA的靶點數目，開展獨活寄生湯治療OA的網絡藥理學研究［31］，無疑有助于解決以上問題。

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R285.5

B

1000-338X（2017）03-0037-03

2017-03-23

福建省自然科學基金項目（2015J01338），福建省中青年教師教育科研項目（JA14152）

鄭春松（1982—），男，醫學博士，主要從事骨關節炎研究。