香煙煙霧水溶液誘導大蒜根尖細胞產生微核

肖星輝，李予霞，徐 亮，王小奎，李文超，李佳馨，劉紅玲,2

（1.石河子大學生命科學學院，新疆 石河子 832000；2.成都師范學院，四川 成都 611130）

香煙煙霧水溶液誘導大蒜根尖細胞產生微核

肖星輝1，李予霞1，徐 亮1，王小奎1，李文超1，李佳馨1，劉紅玲1,2

（1.石河子大學生命科學學院，新疆 石河子 832000；2.成都師范學院，四川 成都 611130）

為了探究香煙煙霧水溶液對大蒜根尖細胞遺傳物質的影響，通過常規的微核技術觀察了香煙煙霧水溶液不同濃度和不同時間處理下根尖細胞中微核的形態和數量。結果表明：在0.5～8支/mL的濃度范圍內，大蒜根尖細胞的微核率隨著濃度的增加而不斷上升，差異極顯著（P＜0.01）；在12～36 h處理時間范圍內，微核率隨著處理時間的增長呈現先升高后降低的趨勢；當處理時間為12和24 h時，微核率隨著濃度的增加而明顯上升，而當處理時間為36 h時，微核率隨著濃度的增加呈現先升后降的趨勢；香煙煙霧水溶液的濃度和處理時間與微核的產生顯著正相關，煙霧濃度對大蒜根尖細胞微核產生的貢獻更大；試驗組的細胞微核率均極顯著高于空白對照組（P＜0.01），微核指數均大于3.5，屬于重度損傷。上述結果表明，香煙煙霧水溶液在較低的濃度（0.5支/mL）和較少的處理時間（12 h）就對植物遺傳物質產生嚴重損傷。

香煙煙霧水溶液； 大蒜根尖；微核；濃度；處理時間

香煙燃燒產生的煙霧中含有5 000余種化學物質，這些化學物質既有植物煙草本身含有的，也有煙草燃燒后產生的[1]。由于燃燒不完全，香煙發生熱裂解和熱化合反應會產生大量的致突變物、致癌物和促癌物等有害物質。這些有害化學成分，進入機體后可嚴重干擾其正常生理功能，繼而對生物體產生多方面的損害[2]。例如卷煙煙氣水溶液對斑馬魚有毒性致死影響[3]；香煙煙氣浸出物能夠使糖尿病惡化[4]；而女性長期接觸香煙煙霧，會使卵巢卵泡儲存量下降、卵巢功能減弱，致使女性生育力下降，并提早進入更年期[5]。香煙煙霧也是引起肺癌的主要原因，目前吸煙已成為我國乃至全世界引起生物早亡和疾病的重要原因[6]。香煙煙霧危害人體健康已經成為公認的事實。因此，采取一定手段研究香煙煙霧水溶液對生物細胞微核遺傳物質的影響，以更好地揭示其致病機理，是非常必要的。

微核（micronucleus，簡稱 MN）是指位于細胞漿中獨立于主核之外的小核，形狀為圓形或橢圓形，可以是整條染色體，也可以是染色體斷片，染色略淺，直徑小于主核的1/3[7-8]。細胞質中微核主要有兩種來源：一種為誘變劑使DNA分子斷裂成DNA片段，DNA片段不能隨染色體分離被拉向兩極，形成獨立于細胞核之外的具有核形狀的微核；另一種為紡錘絲造成的整條染色體落后于核分裂周期形成微核[9]。微核產生的數量與誘變因子濃度呈正比，外界誘變因子越強，細胞的損傷程度越嚴重，因此可以用微核出現的頻率來評價環境誘變因子對生物遺傳物質損傷的程度[10-12]。試驗采用常規的微核技術[13]來觀測香煙煙霧水溶液不同濃度和不同時間處理下大蒜根尖細胞中微核的形態和數量變化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大蒜（購自新疆石河子市金馬市場）、香煙（焦油量0.6 mg，煙氣一氧化碳量11 mg，甘肅煙草工業有限責任公司）。供試藥品有鹽酸、無水乙醇、冰醋酸、堿性品紅、苯酚、山梨醇、甲醛等，均為分析純。主要儀器有烘箱、光學顯微鏡等常規儀器。

1.2 試驗方法

1.2.1 大蒜生根 選取顆粒飽滿、無損傷、大小一致的大蒜放入培養皿中，倒入蒸餾水使大蒜根部沒入水中，置于25℃下培養48 h，待初生根長出1～2 cm，即可用來進行下一步處理。

1.2.2 香煙煙霧水溶液的配制 （1）香煙煙霧簡易吸取器制作：挑選一個槍頭，把槍頭的細端緊密的結合到已經去除針頭的50 mL注射器的注射口，用注射器針頭在瓶蓋上打一個小孔，恰好允許針頭穿過瓶蓋，再把與針頭相配套的針皮管與針頭相接，而皮管另一頭浸入蒸餾水中。裝置圖和實物圖如圖1所示。（2）香煙煙霧水溶液的配制：把煙頭插入槍頭的大端，點燃香煙，迅速吸取煙霧，并快速注入到密封的瓶中，每根香煙固定用50 mL注射器吸取10次（經過預實驗，一根煙大約10次可以完全吸盡），配成0.5支/100 mL、1支/100 mL、2支/100 mL、4支/100 mL、8支/ 100 mL 5個濃度梯度。

圖1 香煙煙霧簡易吸取器示意圖和實物圖

1.2.3 染毒處理 選取等量、長勢一致的大蒜粒分別放入蒸餾水、0.5支/100 mL、1支/100 mL、2支/100 mL、4支/100 mL、8支/100 mL的煙霧水溶液中，分別于12、24、36 h取出大蒜粒，清洗表面的煙霧水溶液，放入清水中，置于25℃的恒溫培養箱中恢復培養24 h。

1.2.4 染色制片 大蒜粒在恢復培養后從根尖頂端部位切下1 cm 左右的幼根；用卡諾氏液在Eppendorf 管中固定，24 h后進行酸解；用蒸餾水漂洗3～5 次，吸去多余水分，將根尖置于載玻片上，加適量改良石炭酸品紅進行染色，染色10～15 min；在染色過程中，用鑷子適當的夾碎根尖，蓋上蓋玻片，包裹吸水紙，然后用鑷子敲打蓋片，使細胞分散開，鋪成薄薄一層。

1.2.5 鏡 檢 選取視野清晰、細胞分散均勻的裝片進行顯微觀察，每張裝片統計大約1 000個細胞，記錄每張裝片產生微核的細胞數。

1.3 數據統計與分析

利用Excel和IBM SPSS 23對鏡檢的數據進行統計分析。

2 結果及分析

2.1 香煙煙霧水溶液處理下大蒜根尖細胞產生微核的形態

顯微觀察發現，不同濃度的香煙煙霧水溶液處理會刺激大蒜根尖細胞產生各種形態的微核，如圖2所示，有單微核、雙微核和鉤形微核；其中，以單微核出現的頻率最高，且微核的大小不一。

2.2 香煙煙霧水溶液處理下大蒜根尖細胞產生微核的數量變化

由圖3可知，隨著香煙煙霧水溶液濃度的增加，大蒜根尖細胞產生的微核越多，微核率越高；而隨著處理時間的延長，大蒜根尖細胞出現微核的幾率呈現先上升后降低的趨勢，以處理24 h時，微核率最高。

由表1可知，不同濃度和不同時間的香煙煙霧水溶液處理，大蒜根尖細胞的微核率差異均達極顯著水平（P＜0.01）。從表2中可以看出，大蒜根尖細胞微核率隨著濃度的增加而不斷升高，不過，當濃度增大到4支/mL時，雖然微核率仍然隨著濃度的增加而增加，但是其增長的幅度明顯降低。

由表3可知，大蒜根尖細胞微核率隨著染毒時間的不斷延長而呈現先增加后降低的趨勢。從圖3中可以看出，當處理時間為12 和24 h時，微核率均以香煙煙霧水溶液濃度為8支/mL處理的最高，分別為96.2%和136.5%；而當處理時間為36 h時，微核率以2支/mL處理的最高，為93.8%；不同香煙煙霧處理的微核率均大于空白對照組，且微核指數均大于3.5，屬于重度損傷。

另外，從表1中還可以看出，染毒時間和煙霧水溶液的濃度對微核率的影響是具有交互作用的，且交互效應極顯著（P＜0.01），表明處理時間和煙霧水溶液濃度共同作用引發植物細胞微核的產生。

圖2 香煙煙霧水溶液處理大蒜根尖細胞產生的微核形態

圖3 香煙煙霧不同濃度和不同時間處理大蒜根尖細胞微核率的比較

表1 不同濃度和處理時間的主體間效應檢驗

表2 不同濃度對微核率的影響

表3 不同處理時間對微核率的影響

2.3 處理濃度和處理時間與大蒜根尖細胞微核率的相關性分析

采用IBM SPSS23軟件對數據進行相關性分析，由表4可知，控制濃度對微核率和處理時間進行偏相關分析得出，相關系數r=0.084，P=0.432，因此可以得出處理時間與微核率相關性不顯著。由表5可知，在控制處理時間對微核率和濃度進行偏相關分析時，相關系數r=0.816，P＜0.01，因此可以得出煙霧水溶液的濃度與微核率顯著正相關。

表4 處理時間與微核率的相關性分析

對處理12和24 h的試驗組數據進行分析可知（表6），控制濃度對微核率和處理時間進行偏相關分析得出，相關系數r=0.775，P＜0.01，因此可以得出處理時間與微核率呈現顯著正相關關系；由表7可知，在控制處理時間對微核率和濃度進行偏相關分析時，相關系數r=0.972，P＜0.01，因此可以得出香煙煙霧水溶液濃度與微核率呈現顯著正相關關系。由兩者的相關性系數對比可知，煙霧水溶液濃度與微核率的相關性更高。

表6 處理時間與微核率的相關性分析（12和24 h試驗組）

表7 濃度與微核率的相關性分析（12和24 h試驗組）

3 結論與討論

該研究顯示，煙霧水溶液濃度越高，對大蒜根尖細胞遺傳物質的損傷越嚴重，在一定處理時間范圍內（24 h以內），處理時間越長，大蒜根尖細胞的產生的微核越多，遺傳物質損傷也就越嚴重。但如果處理時間超過24 h，且香煙煙霧濃度≥2 支/100 mL時，微核率反而會隨著濃度的增大而呈現下降的趨勢。這可能是因為當處理時間過長，處理劑量達到一定濃度時，植物根尖細胞被殺死，導致統計到的細胞數目和微核變少，微核率隨之降低。另外一種可能是處理時間過長，在高濃度的香煙煙霧水溶液處理下植物細胞通過一系列的生理調節對高濃度產生一定的適應性，從而使得煙霧水溶液對根尖細胞中染色體的表觀損傷減小，微核率降低。儀慧蘭等[14]在研究SO2對蠶豆根尖細胞微核的誘導作用時也認為蠶豆可以在短時間內適應環境中低濃度的SO2，并通過較長時間適應較高濃度的SO2，從而使得SO2對根尖細胞中染色體的表觀損傷減小。另外，任子蓓等[15]認為高濃度處理將強烈抑制植物細胞有絲分裂，使分裂細胞顯著減少，使處于間期的細胞容易發生畸變而不形成微核，從而間接導致細胞微核率降低。王五香等[16]的研究也表明，污染物的濃度較高，影響蠶豆根尖細胞分裂時其微核率反而降低。而王蘭君等[17]通過研究4 種典型PPCPs對蠶豆和大蒜根尖細胞微核率的影響時指出，低濃度范圍內隨著處理劑濃度的增加，對根尖細胞染色體DNA的毒性隨之增強，微核率呈增加趨勢；隨著濃度的進一步增大，微核率反而呈下降趨勢；有可能是因為高濃度處理劑的毒性增強，使細胞的正常分裂活動受到減緩、抑制、甚至終止，導致高濃度脅迫下微核出現的頻率降低。但這些都只是人們的猜測，確切的機理有待于進一步的研究。

另外，通過12、24 h試驗組可以得出，煙霧水溶液濃度、處理時間都與微核率呈現顯著的正相關關系，但煙霧水溶液濃度與微核率的相關性更高。這顯示煙霧水溶液的濃度與微核的產生關系更加密切，煙霧水溶液濃度對微核產生的貢獻更大。這可能是隨著煙霧水溶液濃度的增加，溶液中損害植物遺傳物質的顆粒也就越多，進入細胞的毒性物質隨之增加，故對細胞染色體DNA的損傷也就越嚴重。

煙霧水溶液的濃度和處理時間對微核的產生有較強的交互效應（P＜0.01）。這可能與煙霧水溶液中有毒顆粒進入細胞的速度有關，在單位時間內，只有一定數量的有毒顆粒能夠進入細胞，損害植物細胞遺傳物質。在煙霧水溶液濃度一定的情況下，也只有經過一定的時間才能對植物細胞的遺傳物質造成影響。

研究結果還顯示，微核指數均大于3.5，屬于重度損傷[18]。這表明香煙的煙霧水溶液確實能嚴重損害植物細胞的遺傳物質。

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（責任編輯：成 平）

Influence of Water-soluble Fraction of Cigarette Smoke on the Micronucleus Root-Tip Cells of Garlic

XIAO Xing-hui1，LI Yu-xia1，XU Liang1，WANG Xiao-kui1，LI Wen-chao1，LI Jia-xin1，LIU Hong-ling1,2
（1. College of Biology Science, Shihezi University, Shihezi 832000, PRC; 2. Chengdu Normal University, Chengdou 611130, PRC）

In order to explore the infuence of the water-soluble fraction of cigarette smoke on the micronucleus of plant cells, choosing the garlic rooy tip as the experimental material and extracting water-soluble fraction of different concentrations, this study analyses the infuence of different concentration and treatment time on the genetic material of cells of root tip of Garlic. The results indicated that micronucleus rate increased with the concentration increases when the range of water-soluble fraction of cigarette smoke is 0.5 to 8. The rate of micronucleus increases frst and then decreases at last when treatment continued12-36 h. however, when the treatment continued 12 or 24 hours, the rate of micronucleus increases quickly with the growth of concentration. While the treatment continued 36 hour, the rate of micronucleus increases frst and then decreases at last. the concentration and treatment time have an interaction on producing micronucleus, and the concentration of water-soluble fraction of cigarette smoke contributes more to producing micronucleus than the treatment time. All the rate of micronucleus of experimental group exceeds that of control group (P＜0.05), and the index of micronucleus is bigger than 3.5, belonging to severe damage. In conclusions, under the quite low concentration (0.5/mL) and less treatment time , the water-soluble fraction of cigarette smoke has severe damage to the genetic material of plant.

water-soluble fraction of cigarette smoke; root tip of Garlic; micronucleus; concentration; treatment time

Q355; X171. 5

：A

：1006-060X（2017）06-0007-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.006.003

2017-03-25

石河子大學高層次人才啟動項目（RCZX201546）；石河子大學3152人才項目（3152SFXY04027）；石河子大學教改項目（SJ-2015-13）

肖星輝（1995-），男，湖南新化縣人，本科生，生物技術專業。

劉紅玲