懷牛膝莖葉多糖提取及生物活性

郭 寧，郭 婕

（周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南周口466001）

懷牛膝莖葉多糖提取及生物活性

郭 寧，郭 婕＊

（周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南周口466001）

通過微波輔助提取和熱水浸提兩種方法，提取懷牛膝莖葉多糖.并測定樣品提取液對農(nóng)桿菌、大腸桿菌的抑菌作用，同時測定其對超氧陰離子自由基和羥自由基的清除率，研究其抗氧化活性.結(jié)果表明，微波輔助提取和熱水浸提法對懷牛膝莖葉多糖提取率分別為103.79mg／g、89.58mg／g.微波輔助提取液對農(nóng)桿菌及大腸桿菌抑菌效果較好，抑菌圈直徑分別為10mm、11mm.且樣品提取液有明顯的清除自由基活性，微波輔助法提取的多糖對超氧陰離子自由基的清除率為77.38%，對羥自由基的清除率為60.23%.

懷牛膝；莖葉；多糖；生物活性

牛膝作為一種中草藥，具有“苦、酸、平，歸肝、腎經(jīng)”［1］的性質(zhì).中國的不同地區(qū)均有種植，主產(chǎn)于河南、四川，分別稱為懷牛膝和川牛膝.牛膝多糖是從其根莖葉中提取的一種多糖，現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)證實，牛膝多糖有提高免疫力、抑制腫瘤生長等功效［2－4］.牛膝多糖還具有分子量小、水溶性好、毒性低的優(yōu)點，不但可以口服，還可以注射，將會成為一種很有前景的多糖藥物.

目前對懷牛膝莖葉中的多糖研究比較少，導(dǎo)致懷牛膝莖葉不能合理利用而大量浪費，故筆者以懷牛膝的莖葉為材料，采用微波輔助提取和熱水浸提兩種方法研究懷牛膝莖葉多糖的含量；進一步研究懷牛膝多糖對常見致病菌大腸桿菌、農(nóng)桿菌的抑制作用；并測定懷牛膝多糖提取液對超氧陰離子自由基和羥自由基的清除率，研究懷牛膝莖葉多糖的抗氧化活性.以期為更好地開發(fā)和利用懷牛膝莖葉多糖提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗所用儀器、材料及試劑

材料：懷牛膝莖葉，采于周口市公園內(nèi).

試劑：氯仿、正丁醇、乙醚、苯酚、鹽酸、濃磷酸、雙氧水、丙酮、乙醇、甲醇等.

主要儀器：分光光度計、萬能粉碎機、電子天平、微波爐、循環(huán)水式真空泵、恒溫振蕩器、生化培養(yǎng)箱、不銹鋼壓力蒸汽滅菌器等.

1.2 懷牛膝莖葉多糖的提取及含量測定

以蒸餾水作為溶劑，提取懷牛膝莖葉多糖.采用苯酚－硫酸法［5］測定多糖的含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品.

1.2.1 懷牛膝莖葉多糖的提取工藝流程

參照文獻［6］并稍加修改，利用微波輔助法和熱水浸提法提取懷牛膝莖葉中的多糖.

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別移取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9mL濃度為100μg／mL的葡萄糖溶液，置于各個試管中，參照文獻［7］測定多糖含量的常用方法并適當(dāng)修改，490nm處測定吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)方程式y(tǒng)＝0.027x－0.009，R2＝0.995.y為吸光度，x為葡萄糖濃度（μg／mL）.

1.3 懷牛膝莖葉多糖提取液的抑菌活性

1.3.1 活化菌種

在無菌工作臺上把低溫保存的菌種用移液管吸取一定量放入滅菌好的液體培養(yǎng)基里，把錐形瓶放在恒溫搖床上過夜增殖.增殖大腸桿菌時恒溫搖床的轉(zhuǎn)速設(shè)定為180r／min，溫度為37℃.增殖農(nóng)桿菌時恒溫搖床的轉(zhuǎn)速設(shè)定為180r／min，溫度為28℃.

1.3.2 抑菌液的制備

取適量的懷牛膝莖葉多糖提取液和蒸餾水放于小燒杯中，于紫外燈光下滅菌40min，然后取濾紙片在上述溶液中浸泡5min.

1.3.3 實驗操作

將滅菌好的固體培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，水平放置待凝固.用無菌吸管吸取0.3～0.5mL菌懸液加入到凝固的培養(yǎng)皿上，用無菌三角涂布棒涂布均勻.將涂布好的培養(yǎng)皿分成3等份，在培養(yǎng)皿的下面用記號筆做標(biāo)記.用無菌鑷子將已滅菌的小圓濾紙片置于每個培養(yǎng)皿對應(yīng)的部位，一個用無菌水對照，另外兩個為不同方法的多糖提取液.每個菌種做四個重復(fù)和一個空白對照.大腸桿菌和農(nóng)桿菌分別置于37℃和28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察是否產(chǎn)生抑菌圈，并測量抑菌圈的直徑.

1.4 懷牛膝莖葉多糖提取液的抗氧化活性

1.4.1 懷牛膝莖葉多糖對超氧陰離子自由基清除活性測定

參照文獻［8］并稍加修改.

1.4.2 懷牛膝莖葉多糖對羥自由基清除活性測定

參照文獻［9］并稍加修改.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取方法對懷牛膝莖葉多糖提取率的影響

實驗采用微波輔助法和熱水浸提法提取懷牛膝莖葉中的多糖，并以苯酚－硫酸法測定多糖的含量.由圖1可以看出，微波輔助提取法對懷牛膝莖葉多糖的提取率較高，為103.79mg／g，熱水浸提法的提取率為89.58mg／g.微波提取的原理［9］是物質(zhì)吸收微波能，細胞內(nèi)溫度迅速上升，壓力超過細胞壁膨脹承受能力使細胞破裂，使多糖流出.優(yōu)點是提取時間短、提取率高、條件溫和、不易破壞多糖的立體結(jié)構(gòu)，從而保持其生物活性.而熱水提取法所需溫度一般較高，提取時間較長.

2.2 懷牛膝莖葉多糖提取液的抑菌活性

采用濾紙片法研究懷牛膝多糖對大腸桿菌、農(nóng)桿菌的抑制效果，以抑菌圈的有無和抑菌圈直徑的大小為指標(biāo)，實驗結(jié)果見表1.

圖1 不同方法提取懷牛膝莖葉多糖

表1 抑菌圈直徑／mm

通過觀察培養(yǎng)24h之后的菌體發(fā)現(xiàn)，各培養(yǎng)基上均有明顯的抑菌圈.表明懷牛膝莖葉多糖提取物對各實驗菌株均表現(xiàn)出一定的抑制效果，但微波輔助浸提液要優(yōu)于熱水提取液.

2.3 懷牛膝莖葉多糖提取液的抗氧化活性

由圖2、圖3可知，提取的懷牛膝莖葉多糖對超氧陰離子和羥自由基均有良好的清除效果.微波輔助法提取的多糖對超氧陰離子自由基的清除率為77.38%，對羥自由基的清除率為60.23%.熱水浸提法提取的多糖對超氧陰離子自由基的清除率為48.24%，對羥自由基的清除率為39.45%.正常情況下，體內(nèi)維持自由基代謝的平衡對于防止疾病的發(fā)生和保持機體的健康是十分有益的.

圖2 懷牛膝莖葉多糖提取液對超氧陰離子自由基的清除率

3 結(jié)論

微波輔助法對懷牛膝莖葉多糖的提取率較高，為103.79mg／g.懷牛膝莖葉多糖提取液對農(nóng)桿菌及大腸桿菌有一定的抑菌活性.微波輔助浸提液的抑菌效果較好，抑菌圈直徑分別為10mm、11mm.懷牛膝多糖具有明顯的抗氧化活性，微波輔助法多糖提取液的自由基清除活性較好，對超氧陰離子自由基、羥自由基的清除率分別為77.38%和60.23%.

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：49.

［2］李祖?zhèn)悾ズ椋惣t，等.川牛膝多糖的免疫活性研究［J］.中藥材，1998，21（2）：90－92.

［3］宋軍，楊金蓉，李祖?zhèn)?川牛膝多糖對小鼠肝癌細胞抑制作用研究［J］.四川生理科學(xué)雜志，2002，24（3）：118－119.

［4］陳紅，劉友平.川牛膝多糖抗腫瘤作用初探［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2001，24（1）：49－50.

［5］徐光域，顏軍，郭曉強，等.硫酸-苯酚定糖法的改進與初步應(yīng)用［J］.食品科學(xué)，2005，26（8）：342－346.

［6］郭婕，胡春紅，袁淑培，等.車前草多糖微波提取工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（16）：223－225，230.

［7］李玲，陳常秀.大棗多糖的分離及抗氧化性研究［J］.食品研究與開發(fā)，2009，30（9）：49－51，64.

［8］聶凌鴻，寧正祥.廣東淮山水溶性多糖的分離純化及體外抗氧化活性的研究［J］.食品科學(xué)，2003，24（11）：129－133.

［9］劉青梅，楊性民，鄧紅霞，等.采用微波技術(shù)提取紫菜多糖的工藝研究［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2005，21（2）：153－156.

Study on the polysaccharide extraction from stems and leaves of Achyran thes b iden tata Bl.and its bioactivity

GUO Ning，GUO Jie
（College of Life Science and Agronomy，Zhoukou Normal University，Zhoukou 466001，China）

The polysaccharide was extracted by microwave-assisted and hot-water extraction from stems and leaves of Achyranthes bidentata Bl..The antibacterial effects on bacterials such as Agrobacterium tumefacien and Escherichia coli were detected.At the same time，the antioxidant activity of the extracts was detected.The results showed that the extraction ratio of the polysaccharide through microwaveassisted and hot-water extraction were 103.79mg／g and 89.58mg／g，respectively.It was also found that microwaveassisted extracts had better inhibition effects on Agrobacterium tumefacienand Escherichia coli with 10mm and 11mm respectively of the inhibition zone diameter for the two bacterials.And the microwave-assisted extracts had obvious antioxidant activity with the clearance rate of 77.38%for superoxide anion radical and 60.23%for hydroxyl radical.

Achyranthes bidentata Bl.；stems and leaves；polysaccharide；bioactivity

R284.2

A

1671-9476（2017）02-0120-03

10.13450／j.cnkij.zknu.2017.02.030

2016-11-28；

2016-12-23

2015年河南省高等學(xué)校重點科研項目（No.15A180065）

郭寧（1985－），女，河南周口人，助教，碩士，主要從事植物分子生物學(xué)研究.

＊通信作者簡介：郭婕（1984－），女，河南周口人，講師，碩士，主要從事天然藥物化學(xué)研究.

圖3 懷牛膝莖葉多糖提取液對羥自由基的清除率