植物和真菌雙重?zé)晒馊旧椒ㄑ芯?/h1>
2017-08-07 09:24:33張杰，劉軍"
周口師范學(xué)院學(xué)報(bào) 2017年2期 關(guān)鍵詞：方法
張 杰，劉 軍"
（1.周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南周口466001；2.鄧州市成人教育教學(xué)研究室，河南鄧州474100）
植物和真菌雙重?zé)晒馊旧椒ㄑ芯?/p>
張 杰1，劉 軍2"
（1.周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南周口466001；2.鄧州市成人教育教學(xué)研究室，河南鄧州474100）
雙重?zé)晒馊旧阌谟^察細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)，它具有精確、穩(wěn)定、可靠的優(yōu)勢(shì).通過改進(jìn)透化細(xì)胞壁和增加抗熒光淬滅劑的方法研究了植物細(xì)胞和真菌孢子的雙重?zé)晒馊旧姆椒?實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：改進(jìn)雙重?zé)晒馊旧襟E后能夠使植物細(xì)胞和真菌孢子在熒光顯微鏡下顯示出清晰的雙重?zé)晒?
雙重?zé)晒馊旧恢参铮徽婢?/p>
隨著生物技術(shù)工作的不斷拓展和深入，雙重?zé)晒馊旧ㄔ絹碓绞艿缴飳W(xué)研究者的重視.雙重?zé)晒馊旧椒ㄓ兄谏飳W(xué)工作者簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地了解研究對(duì)象［1］.由于兩種染料有不同的熒光光譜，可以在熒光顯微鏡下顯示不同的顏色，因此能夠更加準(zhǔn)確、可靠地顯示出研究對(duì)象靜態(tài)或動(dòng)態(tài)的變化［2］.雙重?zé)晒馊旧ㄒ褟V泛用于觀察細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞凋亡、蛋白互作［3］.由于在實(shí)際應(yīng)用中存在一些問題而受到一定限制，例如染色后內(nèi)細(xì)胞團(tuán)成云霧狀，導(dǎo)致無法準(zhǔn)確分辨結(jié)構(gòu)；染色后細(xì)胞內(nèi)的亞顯微結(jié)構(gòu)界限模糊，不能清晰地區(qū)分；試驗(yàn)步驟繁瑣，所需時(shí)間較長(zhǎng)等［4］.用雙重?zé)晒馊旧姆椒ㄓ^察植物細(xì)胞和真菌細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的研究尚未見報(bào)道，鑒于此，該試驗(yàn)在前人試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，簡(jiǎn)化雙重?zé)晒馊旧牟襟E，確定了適合植物和真菌的最佳染料濃度與處理時(shí)間，同時(shí)增加了抗熒光淬滅的雙重?zé)晒馊旧椒ǎ纱藝L試建立了一種針對(duì)植物和真菌的雙重?zé)晒馊旧椒?
1 材料與方法
材料：洋蔥表皮細(xì)胞和綠僵菌孢子.
試劑：羅丹名標(biāo)記actin抗體染色劑，核染色劑DAPI，PBS緩沖液pH 6.8.
改進(jìn)方法：P______BS清洗細(xì)胞2次→0.5%曲拉通室溫透化細(xì)胞10min→5μg／mL的FITC－鬼筆環(huán)肽37oC染色60min→PBS清洗細(xì)胞2次→DAPI染色10min→PBS清洗細(xì)胞2次→滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上→蓋玻片封片→指甲油封邊→熒光顯微鏡觀察.
2 結(jié)果與分析
2.1 洋蔥表皮細(xì)胞染色結(jié)果
圖1 處理前洋蔥表皮細(xì)胞雙重?zé)晒馊旧Ч麍D
由圖1可知，用未改進(jìn)的方法處理洋蔥細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下拍攝不到羅丹明標(biāo)記的紅色actin（圖1B），而只拍攝DAPI標(biāo)記的藍(lán)色細(xì)胞核的熒光信號(hào)（圖1C），細(xì)胞壁也呈現(xiàn)了藍(lán)色熒光，表明其專一性不強(qiáng)，進(jìn)行整合后不能清晰顯示細(xì)胞核與actin結(jié)構(gòu)關(guān)系圖（圖1D）.
圖2 處理后洋蔥表皮細(xì)胞雙重?zé)晒馊旧Ч麍D
處理方法改進(jìn)后，在熒光顯微鏡下拍攝得到兩種信號(hào)（圖2），紅色的羅丹明標(biāo)記的actin（圖2 B），藍(lán)色為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核（圖2C），然后進(jìn)行整合，可以得到如圖2D所示的細(xì)胞核與actin結(jié)構(gòu)關(guān)系.由圖2可知經(jīng)過上述方法處理后，洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞核部位能夠被羅丹明標(biāo)記的actin抗體染上清晰的紅色熒光；細(xì)胞核能夠被DAPI染上清晰的藍(lán)色；經(jīng)過整合后，可以看到actin不僅作用于細(xì)胞核，而且在細(xì)胞壁部位也含有大量的actin.該結(jié)果表明經(jīng)過上述方法處理后能夠使兩種染色劑穩(wěn)定地結(jié)合到目標(biāo)部位.
2.2 真菌孢子染色結(jié)果
由圖3可知，用未改進(jìn)的方法處理綠僵菌孢子后，在熒光顯微鏡下拍攝不到羅丹明標(biāo)記的紅色actin（圖3B），而只拍攝到DAPI標(biāo)記的藍(lán)色細(xì)胞核的熒光信號(hào)（圖3C），進(jìn)行整合后不能清晰顯示細(xì)胞核與actin結(jié)構(gòu)關(guān)系圖（圖3D）.
圖3 處理前綠僵菌孢子雙重?zé)晒馊旧Ч麍D
圖4 處理后綠僵菌孢子雙重?zé)晒馊旧Ч麍D
處理方法改進(jìn)后，由圖4可知在熒光顯微鏡下拍攝得到兩種熒光信號(hào)，紅色的羅丹明標(biāo)記的actin（圖4B），藍(lán)色為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核（圖4C），然后進(jìn)行整合，可以得到如圖4D所示的細(xì)胞核與actin結(jié)構(gòu)關(guān)系.由圖4可知經(jīng)過上述方法處理后，真菌孢子細(xì)胞質(zhì)能夠被羅丹明標(biāo)記的actin抗體染上清晰的紅色熒光；細(xì)胞核能夠被DAPI染上清晰的藍(lán)色；經(jīng)過整合后，可以看到actin與細(xì)胞核部位重合，但是不能清晰地標(biāo)記細(xì)胞壁部位.該結(jié)果表明經(jīng)過上述方法處理后能夠使兩種染色劑穩(wěn)定地結(jié)合到真菌孢子的目標(biāo)部位，但是不能清晰地標(biāo)記真菌細(xì)胞壁.
3 討論
雙重?zé)晒馊旧夹g(shù)是細(xì)胞組織學(xué)研究最基本的技術(shù)，借助于染料與細(xì)胞特定的生化成分，使細(xì)胞內(nèi)的不同組織呈現(xiàn)出不同的熒光顏色，以便觀察.通過雙重?zé)晒馊旧治瞿軌驕?zhǔn)確可靠地定位細(xì)胞核和actin的位置.羅丹明標(biāo)記actin抗體染色時(shí)首先要通過0.5%曲拉通室溫透化細(xì)胞，否則該染料不能透過細(xì)胞膜導(dǎo)致染色失敗.曲拉通透化后能夠使羅丹明標(biāo)記的actin抗體結(jié)合到actin上，actin能夠在熒光顯微鏡下顯示出清晰的紅色熒光，并且不影響下一步的復(fù)染結(jié)果（圖1和圖2）.該方法比通過水解細(xì)胞壁的方法縮短了染色時(shí)間［2，5］.與吖啶橙染色細(xì)胞核相比［6］，DAPI復(fù)染細(xì)胞核結(jié)果是結(jié)構(gòu)更加清晰，易于觀察.DAPI染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的AT堿基區(qū)，用紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射出明亮的藍(lán)色熒光.DAPI染色并不影響植物細(xì)胞和真菌孢子細(xì)胞中actin的裝配（圖1和圖2）.在染色后封片時(shí)加上抗熒光淬滅劑能夠長(zhǎng)時(shí)間地保持熒光而不淬滅.這樣更便于在顯微鏡下尋找理想的視野.
該實(shí)驗(yàn)所用染色方法在植物細(xì)胞和真菌孢子中染色都能得到良好的效果，但是對(duì)真菌孢子染色時(shí)由于真菌孢子太小而不能清晰地區(qū)分出真菌孢子的細(xì)胞壁.故在該熒光染色方法的基礎(chǔ)之上，可以進(jìn)一步地用細(xì)胞壁特異結(jié)合的熒光染料進(jìn)行第三次染色進(jìn)而觀察細(xì)胞壁的顯微結(jié)果.熒光染色方法雖然具有精確、穩(wěn)定、可靠等優(yōu)點(diǎn)，但是實(shí)驗(yàn)周期比較長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)試劑比較昂貴，而且對(duì)于實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高［7］.通過改進(jìn)操作方法和實(shí)驗(yàn)流程能夠保持熒光染色方法的精確、穩(wěn)定、可靠等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)降低了對(duì)于實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求，進(jìn)而能夠使熒光染色方法在生物學(xué)研究領(lǐng)域普及推廣.
［1］劉甜甜，周倩，吳秋云，等.馬鈴薯晚疫病菌侵染的Solophenyl Flavine熒光染色方法研究［J］.植物科學(xué)學(xué)報(bào)，2016（02）：316－324.
［2］喬飛，曹晶瀟，江雪飛，等.香蕉葉片微管免疫熒光染色方法的建立與應(yīng)用［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，2012（08）：1409－1411.
［3］王萍，欒非時(shí)，陳克農(nóng)，等.4種染色方法對(duì)甜瓜白粉病菌染色效果的觀察比較［J］.菌物學(xué)報(bào)，2008（05）：673－678.
［4］孫尉峻，于學(xué)穎，胡庭溪，等.一種同時(shí)進(jìn)行牛囊胚差異染色和凋亡染色的方法［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，16（11）：1967－1973.
［5］Millanes Ana María，F(xiàn)ontaniella Blanca，Legaz María Estrella，et al.Glycoproteins from sugarcane plants regulate cell polarity of Ustilago scitaminea teliospores［J］.Journal of Plant Physiology，2005，162（3）：253－265.
［6］張雪英，尹增芳.毛竹組織熒光染色顯微觀察方法的研究［J］.竹子研究匯刊，2008，27（04）：26－29.
［7］蔡欣.標(biāo)記減數(shù)分裂遺傳重組的免疫熒光染色方法［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2010，26（11）：1068－1071.
S865.1
A
1671-9476（2017）02-0114-03
10.13450／j.cnkij.zknu.2017.02.028
2016-10-20；
2016-11-16
河南省教育廳自然科學(xué)資助項(xiàng)目（No.2011B180061）
張杰（1975－），男，河南太康人，講師，在讀博士，主要研究方向：分子生物學(xué)與生物工程.
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張 杰，劉 軍"
（1.周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南周口466001；2.鄧州市成人教育教學(xué)研究室，河南鄧州474100）
植物和真菌雙重?zé)晒馊旧椒ㄑ芯?/p>
張 杰1，劉 軍2"
（1.周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南周口466001；2.鄧州市成人教育教學(xué)研究室，河南鄧州474100）
雙重?zé)晒馊旧阌谟^察細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)，它具有精確、穩(wěn)定、可靠的優(yōu)勢(shì).通過改進(jìn)透化細(xì)胞壁和增加抗熒光淬滅劑的方法研究了植物細(xì)胞和真菌孢子的雙重?zé)晒馊旧姆椒?實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：改進(jìn)雙重?zé)晒馊旧襟E后能夠使植物細(xì)胞和真菌孢子在熒光顯微鏡下顯示出清晰的雙重?zé)晒?
雙重?zé)晒馊旧恢参铮徽婢?/p>
隨著生物技術(shù)工作的不斷拓展和深入，雙重?zé)晒馊旧ㄔ絹碓绞艿缴飳W(xué)研究者的重視.雙重?zé)晒馊旧椒ㄓ兄谏飳W(xué)工作者簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地了解研究對(duì)象［1］.由于兩種染料有不同的熒光光譜，可以在熒光顯微鏡下顯示不同的顏色，因此能夠更加準(zhǔn)確、可靠地顯示出研究對(duì)象靜態(tài)或動(dòng)態(tài)的變化［2］.雙重?zé)晒馊旧ㄒ褟V泛用于觀察細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞凋亡、蛋白互作［3］.由于在實(shí)際應(yīng)用中存在一些問題而受到一定限制，例如染色后內(nèi)細(xì)胞團(tuán)成云霧狀，導(dǎo)致無法準(zhǔn)確分辨結(jié)構(gòu)；染色后細(xì)胞內(nèi)的亞顯微結(jié)構(gòu)界限模糊，不能清晰地區(qū)分；試驗(yàn)步驟繁瑣，所需時(shí)間較長(zhǎng)等［4］.用雙重?zé)晒馊旧姆椒ㄓ^察植物細(xì)胞和真菌細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的研究尚未見報(bào)道，鑒于此，該試驗(yàn)在前人試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，簡(jiǎn)化雙重?zé)晒馊旧牟襟E，確定了適合植物和真菌的最佳染料濃度與處理時(shí)間，同時(shí)增加了抗熒光淬滅的雙重?zé)晒馊旧椒ǎ纱藝L試建立了一種針對(duì)植物和真菌的雙重?zé)晒馊旧椒?
1 材料與方法
材料：洋蔥表皮細(xì)胞和綠僵菌孢子.
試劑：羅丹名標(biāo)記actin抗體染色劑，核染色劑DAPI，PBS緩沖液pH 6.8.
改進(jìn)方法：P______BS清洗細(xì)胞2次→0.5%曲拉通室溫透化細(xì)胞10min→5μg／mL的FITC－鬼筆環(huán)肽37oC染色60min→PBS清洗細(xì)胞2次→DAPI染色10min→PBS清洗細(xì)胞2次→滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上→蓋玻片封片→指甲油封邊→熒光顯微鏡觀察.
2 結(jié)果與分析
2.1 洋蔥表皮細(xì)胞染色結(jié)果
圖1 處理前洋蔥表皮細(xì)胞雙重?zé)晒馊旧Ч麍D
由圖1可知，用未改進(jìn)的方法處理洋蔥細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下拍攝不到羅丹明標(biāo)記的紅色actin（圖1B），而只拍攝DAPI標(biāo)記的藍(lán)色細(xì)胞核的熒光信號(hào)（圖1C），細(xì)胞壁也呈現(xiàn)了藍(lán)色熒光，表明其專一性不強(qiáng)，進(jìn)行整合后不能清晰顯示細(xì)胞核與actin結(jié)構(gòu)關(guān)系圖（圖1D）.
圖2 處理后洋蔥表皮細(xì)胞雙重?zé)晒馊旧Ч麍D
處理方法改進(jìn)后，在熒光顯微鏡下拍攝得到兩種信號(hào)（圖2），紅色的羅丹明標(biāo)記的actin（圖2 B），藍(lán)色為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核（圖2C），然后進(jìn)行整合，可以得到如圖2D所示的細(xì)胞核與actin結(jié)構(gòu)關(guān)系.由圖2可知經(jīng)過上述方法處理后，洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞核部位能夠被羅丹明標(biāo)記的actin抗體染上清晰的紅色熒光；細(xì)胞核能夠被DAPI染上清晰的藍(lán)色；經(jīng)過整合后，可以看到actin不僅作用于細(xì)胞核，而且在細(xì)胞壁部位也含有大量的actin.該結(jié)果表明經(jīng)過上述方法處理后能夠使兩種染色劑穩(wěn)定地結(jié)合到目標(biāo)部位.
2.2 真菌孢子染色結(jié)果
由圖3可知，用未改進(jìn)的方法處理綠僵菌孢子后，在熒光顯微鏡下拍攝不到羅丹明標(biāo)記的紅色actin（圖3B），而只拍攝到DAPI標(biāo)記的藍(lán)色細(xì)胞核的熒光信號(hào)（圖3C），進(jìn)行整合后不能清晰顯示細(xì)胞核與actin結(jié)構(gòu)關(guān)系圖（圖3D）.
圖3 處理前綠僵菌孢子雙重?zé)晒馊旧Ч麍D
圖4 處理后綠僵菌孢子雙重?zé)晒馊旧Ч麍D
處理方法改進(jìn)后，由圖4可知在熒光顯微鏡下拍攝得到兩種熒光信號(hào)，紅色的羅丹明標(biāo)記的actin（圖4B），藍(lán)色為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核（圖4C），然后進(jìn)行整合，可以得到如圖4D所示的細(xì)胞核與actin結(jié)構(gòu)關(guān)系.由圖4可知經(jīng)過上述方法處理后，真菌孢子細(xì)胞質(zhì)能夠被羅丹明標(biāo)記的actin抗體染上清晰的紅色熒光；細(xì)胞核能夠被DAPI染上清晰的藍(lán)色；經(jīng)過整合后，可以看到actin與細(xì)胞核部位重合，但是不能清晰地標(biāo)記細(xì)胞壁部位.該結(jié)果表明經(jīng)過上述方法處理后能夠使兩種染色劑穩(wěn)定地結(jié)合到真菌孢子的目標(biāo)部位，但是不能清晰地標(biāo)記真菌細(xì)胞壁.
3 討論
雙重?zé)晒馊旧夹g(shù)是細(xì)胞組織學(xué)研究最基本的技術(shù)，借助于染料與細(xì)胞特定的生化成分，使細(xì)胞內(nèi)的不同組織呈現(xiàn)出不同的熒光顏色，以便觀察.通過雙重?zé)晒馊旧治瞿軌驕?zhǔn)確可靠地定位細(xì)胞核和actin的位置.羅丹明標(biāo)記actin抗體染色時(shí)首先要通過0.5%曲拉通室溫透化細(xì)胞，否則該染料不能透過細(xì)胞膜導(dǎo)致染色失敗.曲拉通透化后能夠使羅丹明標(biāo)記的actin抗體結(jié)合到actin上，actin能夠在熒光顯微鏡下顯示出清晰的紅色熒光，并且不影響下一步的復(fù)染結(jié)果（圖1和圖2）.該方法比通過水解細(xì)胞壁的方法縮短了染色時(shí)間［2，5］.與吖啶橙染色細(xì)胞核相比［6］，DAPI復(fù)染細(xì)胞核結(jié)果是結(jié)構(gòu)更加清晰，易于觀察.DAPI染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的AT堿基區(qū)，用紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射出明亮的藍(lán)色熒光.DAPI染色并不影響植物細(xì)胞和真菌孢子細(xì)胞中actin的裝配（圖1和圖2）.在染色后封片時(shí)加上抗熒光淬滅劑能夠長(zhǎng)時(shí)間地保持熒光而不淬滅.這樣更便于在顯微鏡下尋找理想的視野.
該實(shí)驗(yàn)所用染色方法在植物細(xì)胞和真菌孢子中染色都能得到良好的效果，但是對(duì)真菌孢子染色時(shí)由于真菌孢子太小而不能清晰地區(qū)分出真菌孢子的細(xì)胞壁.故在該熒光染色方法的基礎(chǔ)之上，可以進(jìn)一步地用細(xì)胞壁特異結(jié)合的熒光染料進(jìn)行第三次染色進(jìn)而觀察細(xì)胞壁的顯微結(jié)果.熒光染色方法雖然具有精確、穩(wěn)定、可靠等優(yōu)點(diǎn)，但是實(shí)驗(yàn)周期比較長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)試劑比較昂貴，而且對(duì)于實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高［7］.通過改進(jìn)操作方法和實(shí)驗(yàn)流程能夠保持熒光染色方法的精確、穩(wěn)定、可靠等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)降低了對(duì)于實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求，進(jìn)而能夠使熒光染色方法在生物學(xué)研究領(lǐng)域普及推廣.
［1］劉甜甜，周倩，吳秋云，等.馬鈴薯晚疫病菌侵染的Solophenyl Flavine熒光染色方法研究［J］.植物科學(xué)學(xué)報(bào)，2016（02）：316－324.
［2］喬飛，曹晶瀟，江雪飛，等.香蕉葉片微管免疫熒光染色方法的建立與應(yīng)用［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，2012（08）：1409－1411.
［3］王萍，欒非時(shí)，陳克農(nóng)，等.4種染色方法對(duì)甜瓜白粉病菌染色效果的觀察比較［J］.菌物學(xué)報(bào)，2008（05）：673－678.
［4］孫尉峻，于學(xué)穎，胡庭溪，等.一種同時(shí)進(jìn)行牛囊胚差異染色和凋亡染色的方法［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，16（11）：1967－1973.
［5］Millanes Ana María，F(xiàn)ontaniella Blanca，Legaz María Estrella，et al.Glycoproteins from sugarcane plants regulate cell polarity of Ustilago scitaminea teliospores［J］.Journal of Plant Physiology，2005，162（3）：253－265.
［6］張雪英，尹增芳.毛竹組織熒光染色顯微觀察方法的研究［J］.竹子研究匯刊，2008，27（04）：26－29.
［7］蔡欣.標(biāo)記減數(shù)分裂遺傳重組的免疫熒光染色方法［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2010，26（11）：1068－1071.
S865.1
A
1671-9476（2017）02-0114-03
10.13450／j.cnkij.zknu.2017.02.028
2016-10-20；
2016-11-16
河南省教育廳自然科學(xué)資助項(xiàng)目（No.2011B180061）
張杰（1975－），男，河南太康人，講師，在讀博士，主要研究方向：分子生物學(xué)與生物工程.
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