Exendin-4可通過下調內質網應激信號標志蛋白表達改善3T3-L1脂肪細胞的胰島素抵抗*

馬 麗， 官濱斌， 王林曦,， 劉小鶯， 陳 洲， 劉禮斌, 4△

(福建醫科大學 1附屬協和醫院內分泌科，福建省內分泌研究所， 2附屬協和醫院老年病科，3藥學院， 4老年健康科學研究院，福建 福州 350001)

Exendin-4可通過下調內質網應激信號標志蛋白表達改善3T3-L1脂肪細胞的胰島素抵抗*

馬 麗1， 官濱斌1， 王林曦1,2， 劉小鶯2， 陳 洲3， 劉禮斌1, 4△

(福建醫科大學1附屬協和醫院內分泌科，福建省內分泌研究所，2附屬協和醫院老年病科，3藥學院，4老年健康科學研究院，福建 福州 350001)

目的： 探討胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體激動劑exendin-4對內質網應激(ERS)誘導劑衣霉素(TM)介導的3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗(IR)的影響。方法: 體外培養3T3-L1脂肪細胞，分別用TM、內質網應激抑制劑?；切苊撗跄懰?TUDCA)及exendin-4進行干預，以MTT法檢測不同干預條件下脂肪細胞的存活情況，以葡萄糖氧化酶法檢測不同干預條件下脂肪細胞的葡萄糖消耗量情況，利用Western blot法檢測不同干預條件下p-Akt、Akt及ERS關鍵信號標志蛋白肌醇需求蛋白1(IRE1)、p-IRE1、c-Jun末端激酶(JNK)、p-JNK、蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)、p-PERK、真核生物翻譯起始因子2的α亞單位(eIF2a)、p-eIF2a和轉錄激活因子(ATF)-6的蛋白水平。結果: 單獨TUDCA或exendin-4作用，可協同胰島素作用，增加胰島素刺激的脂肪細胞葡萄糖消耗量(P<0.05)。TM(5 mg/L)作用5 h后可減少胰島素刺激的3T3-L1脂肪細胞萄糖消耗量(P<0.05)及p-Akt的蛋白水平(P<0.05)。TUDCA(1 mmol/L)或exendin-4(100 nmol/L)預處理24 h后，均可拮抗TM對胰島素刺激的3T3-L1脂肪細胞萄糖消耗量(P<0.05)及p-Akt蛋白水平的改變(P<0.05)，二者效價相當。TM(5 mg/L)作用5 h后可顯著提高ERS標志蛋白的表達。而exendin-4(100 nmol/L)預處理24 h后，可降低TM誘導的ERS標志蛋白的表達，其效價與應用內質網應激抑制劑TUDCA(1 mmol/L)預處理24 h相當。不同的處理因素對于總IRE1、JNK、PERK及eIF2a的表達情況并無顯著性影響。結論: Exendin-4可改善內質網應激介導的3T3-L1脂肪細胞的胰島素抵抗。

Exendin-4； 內質網應激； 3T3-L1脂肪細胞； 胰島素抵抗

目前已有大量研究證實，胰島素(insulin，INS)抵抗(insulin resistance，IR)常常與肥胖、糖尿病、心血管疾病、高脂血癥相伴隨，被認為是滋生多種代謝性疾病的“共同土壤”[1-2]。而肥胖常伴有炎癥反應和全身代謝絮亂，是引起IR最常規的原因。近年來研究發現[3]，內質網應激(endoplasmic reticulum stress， ERS)與胰島素抵抗密切相關，減輕細胞的內質網應激將是治療胰島素抵抗的新靶點。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)作為近年來備受關注的糖尿病治療藥物，具有促進胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌、延緩胃排空、保護胰島β細胞、促進骨骼肌及脂肪組織中胰島素刺激的糖轉運活動、促進糖原合成及改善外周組織的胰島素敏感性等諸多優點?，F已有報道在體外研究中，GLP-1的類似物exendin-4(EX-4)可以減輕內質網應激[4-5]。但對于脂肪細胞中，GLP-1類似物是否可以通過減輕內質網應激改善胰島素抵抗，目前國內外文獻鮮見報道。本研究將以3T3-L1脂肪細胞為研究對象，利用內質網應激誘導劑衣霉素(tunicamycin，TM)誘導3T3-L1脂肪細胞發生胰島素抵抗，并從exendin-4對內質網應激未折疊蛋白質應答相關的IRE1-JNK、PERK-eIF2a和ATF-6 這3條通路的作用入手，探討exendin-4改善TM誘導的3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗的分子機制，為更好地理解exendin-4的抗糖尿病作用提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 材料

3T3-L1前脂肪細胞由上海瑞金醫院內分泌研究所惠贈；高糖DMEM、胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco)；低糖DMEM(Hyclone)；IBMX、地塞米松和衣霉素(Sigma)；優泌林R(Lilly)；?；切苊撗跄懰?tauroursodeoxycholic acid，TUDCA；Calbiochem)；葡萄糖測定試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司)；抗p-JNK多克隆抗體、抗JNK多克隆抗體、抗肌醇需求酶1(inositol requirirg enzyme-1，IRE1)多克隆抗體、抗磷酸化的真核生物翻譯起始因子2的α亞單位(eukaryotic initiation factor 2 alpha,eIF2a)單克隆抗體、抗p-Akt單克隆抗體(CST)；抗p-IRE1多克隆抗體、抗轉錄激活因子(activating transcription factor，ATF)-6多克隆抗體和抗p-PERK單克隆抗體(Abcam)；抗蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)單克隆抗體和抗eIF2a單克隆抗體(Santa Cruz)；抗Akt多克隆抗體(武漢博士德)；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG(中杉金橋生物科技公司)；蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術研究所)。二氧化碳細胞培養箱(SANYO)；酶標儀ELX8(Bio-Tek)。

2 方法

2.1 細胞的培養與誘導分化 3T3-L1前脂肪細胞以含10%小牛血清的高糖DMEM培液在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。細胞融合達80%～90%時，以0.25%胰蛋白酶消化、傳代接種至6孔培養板上。待細胞融合2 d后，加含0.5 mmol/L異丁基-甲基-黃嘌呤、1 μmol/L地塞米松和10 mg/L胰島素的10%小牛血清高糖DMEM培養48 h，換液，以含10 mg/L胰島素的10%小牛血清高糖DMEM培養液再培養48 h，隨后換單純10%小牛血清高糖DMEM繼續培養，2 d換培養液1次，誘導分化8～12 d，細胞內可見明顯脂滴，可用于實驗[6]。

2.2 油紅O染色法鑒定脂肪細胞 以10%多聚甲醛固定細胞10 min，PBS 洗去后晾干。加油紅O染液(0.25 g油紅O加入100 mL異丙醇，56 ℃溶解1 h，冷卻后，過濾作為儲存液；使用時，取6份上述儲存液，加4份ddH2O混勻，靜置10 min，即為使用液)10 min后棄去，以異丙醇洗細胞2次，用蘇木精染細胞核2 min。水洗5～10 min，倒置顯微鏡下觀察結果，拍攝照片[5]。細胞內的脂滴被染成紅色，說明誘導成功。

2.3 實驗分組 將誘導分化成熟的3T3-L1脂肪細胞分為空白對照(control)組、INS組、TM組、TM+TUDCA組、TUDCA組、TM+EX-4組、EX-4組。(1)空白對照組：不加任何干預因素；(2)INS組：僅胰島素處理30 min；(3)TM組：TM(5 mg/L)作用5 h后，胰島素作用30 min；(4)TM+TUDCA組：以TUDCA(1 mmol/L)預處理24 h后，以TM(5 mg/L)作用5 h，胰島素作用30 min；(5)TUDCA組：TUDCA(1 mmol/L)預處理24 h后，胰島素作用30 min；(6)TM+EX-4組：exendin-4(100 nmol/L)預處理24 h后,以TM(5 mg/L)作用5 h，胰島素作用30 min；(7)EX-4組：以exendin-4(100 nmol/L)預處理24 h，胰島素作用30 min。

2.4 細胞存活率的檢測 于96孔培養板中每孔接種100 μL的細胞，按 2.1所述方法誘導細胞為成熟的脂肪細胞，按照上述分組予以不同的干預條件，每孔加入5 g/L MTT溶液10 μL，37 ℃孵育4 h，吸凈上清，每孔加入DMSO 150 μL，室溫振蕩10 min，混勻后置于酶標儀測定490 nm處吸光度(A)值，以監測細胞活力。

2.5 測定3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗量 將96孔板中誘導分化成熟的3T3-L1脂肪細胞按上述分組中的不同條件予以干預，用葡萄糖氧化酶法檢測培養液中的葡萄糖含量，與未接種細胞空白復孔的糖含量均值相減，算出各孔細胞的葡萄糖消耗量[7]。

2.6 Western blot檢測內質網應激相關通路蛋白(p-Akt、Akt、p-IRE1、IRE1、p-JNK、JNK、p-PERK、PERK、p-eIF2a、eIF2a和ATF-6)的水平 用細胞裂解法抽提蛋白，分別配制8%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，每孔上樣30 μg，30 V恒壓預跑10 min，80 V恒壓電泳跑至濃縮膠和分離膠分界線，120 V恒壓電泳90 min。電泳完成采用300 mA恒電流轉膜90 min。50 g/L脫脂奶粉封閉2 h。I 抗孵育過夜。TBST洗脫10 min、3次；II 抗孵育1 h。TBST洗脫10 min、3次。ECL發光法顯色，在暗室中曝光，并以β-actin作為內參照。蛋白條帶灰度值運用Image J軟件進行半定量分析。

3 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。所有實驗獨立3次完成，結果用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用完全隨機設計的單因素方差分析，其中組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各處理因素對3T3-L1脂肪細胞活性的影響

與未經任何處理的空白對照組比較，各處理因素組細胞存活率無顯著差異，表明各處理因素對細胞活力無影響，見圖1。

2 TM誘導3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗及exendin-4對葡萄糖消耗量的影響

與空白對照組比較，經10 nmol/L胰島素處理30 min后，3T3-L1脂肪細胞萄糖消耗量明顯升高(P<0.05),說明誘導分化的3T3-L1脂肪細胞對胰島素敏感，適用于建立IR模型。與INS組相比，TM(5 mg/L)作用5 h后可減少胰島素刺激的3T3-L1脂肪細胞萄糖消耗量，較INS組減少了 63%(P<0.05)。經過TUDCA(1 mmol/L)以及exendin-4(100 nmol/L)預處理24 h后，均可增加胰島素刺激的3T3-L1脂肪細胞萄糖消耗量，較TM組分別增加了62%及63%(P<0.05)，二者效價相當。單獨TUDCA或exendin-4作用，可協同胰島素作用，增加胰島素刺激的3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗，較INS組分別增加了18%及17%(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.The cell viability of 3T3-L1 adipocytes in different groups. TU: TUDCA. Mean±SD.n=3.

圖1 不同處理因素對3T3-L1脂肪細胞存活率的影響

Figure 2.Glucose consumption in the 3T3-L1 adipocytes with different treatments. TU: TUDCA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsINS group;&P<0.05vsTM group.

圖2 不同處理因素對3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗量的影響

3 Western blot檢測p-Akt/Akt在各組間的變化情況

INS組較空白組的p-Akt蛋白水平升高(P<0.05)，而TM組較INS組的p-Akt蛋白水平降低(P<0.05)。而TUDCA(1 mmol/L)或exendin-4(100 nmol/L)預處理24 h后，可升高TM誘導的p-Akt蛋白水平 (P<0.05)。結果說明，TM組存在胰島素抵抗，exendin-4可能通過激活p-Akt，減輕TM介導3T3-L1脂肪細胞產生的胰島素抵抗，見圖3。

Figure 3.The ratio of phosphorylated Akt (p-Akt)/Akt in the 3T3-L1 adipocytes with different treatments. TU: TUDCA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsINS group;&P<0.05vsTM group.

圖3 Western blot顯示各組3T3-L1脂肪細胞中p-Akt和Akt的蛋白表達情況

4 Western blot檢測內質網應激相關通路蛋白在各組間的變化情況

TM作為內質網應激誘導劑可顯著提高內質網信號通路分子p-IRE1、p-JNK、p-eIF2a、p-PERK和ATF-6的水平(P<0.05)。而exendin-4(100 nmol/L)預處理24 h后，可抑制TM誘導的p-IRE1、p-JNK、p-eIF2a、p-PERK和ATF-6蛋白水平(P<0.05)，其效價與應用內質網應激抑制劑TUDCA(1 mmol/L)預處理24 h相當。不同的處理因素對于總IRE1、JNK、eIF2a和PERK的表達情況并無顯著影響。結果說明exendin-4可減輕TM誘導的3T3-L1脂肪細胞產生的內質網應激，見圖4、5。

討 論

目前研究認為，胰島素抵抗與多種疾病相關，它是糖尿病、高血壓、肥胖、動脈粥樣硬化等多種代謝相關疾病的共同發病基礎[8]。改善胰島素抵抗或能延緩或逆轉相關疾病的發生和發展。因此，研究IR的發生機制及治療措施已成為當前的重要課題。

目前已有不少研究發現內質網應激與IR密切相關。ERS是指由于某種原因使細胞內質網生理功能發生紊亂的一種病理狀態，在血糖和能量改變、蛋白質合成增加、中毒、病毒感染及內質網內鈣穩態失調時，內質網的功能出現紊亂，導致蛋白質折疊障礙和錯誤折疊，進而觸發ERS，在這種情況下，內質網激活一系列復雜的反應來重新恢復它的整體功能，這個過程稱為未折疊蛋白質反應[9-10]。目前研究發現，脂肪細胞內質網應激可能通過以下幾個途徑阻礙胰島素信號通路轉導引起胰島素抵抗：(1)內質網應激發生未折疊蛋白反應時IRE-1α磷酸化水平升高，通過募集腫瘤壞死因子受體相關因子-2及凋亡信號調節激酶-1，這3者形成復合物共同激活JNK進而活化絲氨酸激酶，促進胰島素受體底物-1 關鍵位點的絲氨酸殘基磷酸化，從而抑制磷脂酰肌醇-3-激酶介導的胰島素信號轉導通路，降低靶組織對胰島素的敏感性[11]；(2)PERK可以直接降解NF-κB的抑制因子IκB蛋白，繼而激活NF-κB通路，從而上調TNF-α、IL-6和MCP-1等炎癥基因的表達，導致IR[12]；(3)在3T3-L1脂肪細胞中，內質網應激還可導致葡萄糖轉運子-4表達下降，減少脂肪細胞中葡萄糖的轉運產生胰島素抵抗[13]。可見，ERS可以影響胰島素信號轉導，進而導致IR和代謝異常。在本研究中，首先經MTT法檢測顯示，各分組的不同干預條件并未引起細胞凋亡；但經內質網應激誘導劑TM處理的3T3-L1脂肪細胞，胰島素刺激的葡萄糖攝取量減少， Western blot檢測p-Akt的分子水平下降，而ERS相關信號通路蛋白IRE1、JNK、PERK、eIF2a及ATF-6表達均上調。TUDCA作為一種能減輕細胞ERS的化學分子伴侶，在實驗中，發現經其預處理后的3T3-L1脂肪細胞，TM誘導的上述葡萄糖消耗量增多、p-Akt表達的升高及內質網應激標志蛋白的表達下降，此結果也與Ozcan等[14]的結果相一致。由此推測，TM可能通過介導脂肪細胞的內質網應激，引起下游的胰島素受體信號通路相關信號分子表達下調，導致IR，而TUDCA能通過減輕ERS，改善IR。

Figure 4.The ratio of p-IRE1/IRE1 and p-JNK/JNK in the 3T3-L1 adipocytes with different treatments. TU: TUDCA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsINS group;#P<0.05vsTM group.

圖4 Wester blot跡顯示各組3T3-L1脂肪細胞中p-IRE1、IRE1、p-JNK和JNK的蛋白水平

Figure 5.The ratio of p-eIF2a/eIF2a, p-PERK/PERK and ATF-6/β-actin in the 3T3-L1 adipocytes with different treatments. TU: TUDCA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsINS group;#P<0.05vsTM group.

圖5 各組3T3-L1脂肪細胞中p-eIF2a、eIF2a、p-PERK、PERK及ATF-6的蛋白水平

GLP-1是一種重要的腸促胰島素，除葡萄糖依賴性的降低血糖，刺激胰島β細胞分化、增殖以及抑制食欲、延緩胃排空外，亦有部分研究發生其還參與外周組織包括肝臟、骨骼肌和脂肪組織的葡萄糖代謝，并增加脂肪合成及分解，改善細胞的胰島素敏感性[15]。GLP-1在體內半衰期極短，分泌入血后1～2 min即被二肽基肽酶IV所降解。而exendin-4 作為GLP-1 類似物，具有GLP-1相似的生物學作用，同時不易被二肽基肽酶IV降解，血漿半衰期長，在臨床及科研的應用中更具優勢。目前亦有體外及動物實驗報道，exendin-4可通過PI3K-PKB信號通路或增加葡萄糖轉運子的表達增加其轉運效率、協同胰島素作用并提高胰島素刺激的葡萄糖攝取，改善大鼠骨骼肌及肝臟的胰島素抵抗[16-17]。本實驗結果也顯示，exendin-4可提高TM誘導的3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型鼠的葡萄糖攝取量及p-Akt蛋白的表達水平，提示exendin-4可改善脂肪細胞的胰島素抵抗。另外，還有一些體外研究發現，exendin-4對人臍靜脈內皮細胞的內質網應激損傷起拮抗作用[4]；在嚙齒動物體內研究中發現，exendin-4的治療減少胰腺中CHOP、XBP-1及BiP等內質網應激標志物的表達[5]。鑒于內質網應激與胰島素抵抗的相關性，本實驗還進一步觀察了內質網應激相關信號通路蛋白IRE1、JNK、PERK、eIF2a及ATF-6表達情況，發現exendin-4降低TM誘導的p-IRE1、p-JNK、p-PERK、p-eIF2a及ATF-6的蛋白水平，且其效價與ERS抑制劑TUDCA相當，而對總IRE1、JNK、PERK和eIF2a表達影響不大。由此推測exendin-4可能通過下調上述內質網應激信號通路分子來發揮其改善外周脂肪組織胰島素抵抗的作用。

總之，exendin-4可能通過減輕內質網應激改善脂肪細胞的胰島素抵抗作用。但具體的作用機制如胰島素受體信號通路的變化情況以及是否還可以通過影響炎癥信號通路NF-κB等發揮改善胰島素抵抗的作用，仍有待進一步的研究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Exendin-4 improves insulin resistance by declining expression of endoplasmic reticulum stress markers in 3T3-L1 adipocytes

MA Li1, GUAN Bin-bin1, WANG Lin-xi1, 2, LIU Xiao-ying2, CHEN Zhou3, LIU Li-bin1, 4

(1DepartmentofEndocrinology,FujianInstituteofEndocrinology,2DepartmentofGeriatrics,FujianMedicalUniversityUnionHospital,3CollegeofPharmacy,4InstituteoftheElderlyHealthSciences,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China.E-mail：libin.liu@hotmail.com)

AIM: To explore the effects of exendin-4 (EX-4) on endoplasmic reticulum stress (ERS)-mediated insulin resistance in the 3T3-L1 adipocytes. METHODS:Invitro3T3-L1 pre-adipocytes were differentiated into adipocytes, and the cells were treated with tunicamycin (TM), tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) or EX-4， respectively. The cell viability was measured by MTT assay. The glucose consumption was determined by glucose oxidase assay to evaluate insulin sensitivity of the 3T3-L1 adipocytes with different interventions. The protein levels of p-Akt, Akt and endoplasmic reticulum stress markers, including inositol requiring enzyme-1 (IRE1)， p-IRE1, JNK, p-JNK, protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK), p-PERK, eukaryotic initation factor 2 alpha (eIF2a)， p-eIF2a, activating transcription factor-6(ATF-6) were detected by Western blot. RESULTS: The insulin-stimulated glucose consumption and the protein level of p-Akt were inhibited by TM at 5 mg/L for 5 h (P<0.05), while they were increased when the cells were treated with TUDCA at 1 mmol/L or EX-4 at 100 nmol/L for 24 h (P<0.05). The effects above induced by TM (5 mg/L for 5 h) were also blunted by pretreating with TUDCA at 1 mmol/L or EX-4 at 100 nmol/L for 24 h (P<0.05). The protein levels of ERS markers such as p-IRE1, p-JNK, p-PERK, p-eIF2a and ATF-6 were significantly increased by treating with TM at 5 mg/L for 5 h, whereas 24 h pre-treatment with TUDCA or Ex-4 alleviated the ERS of the 3T3-L1 adipocytes induced by TM. The expression of total IRE1, JNK, PERK and eIF2a was not changed in different groups. CONCLUSION: Exendin-4 improves endoplasmic reticulum stress mediated insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes.

Exendin-4; Endoplasmic reticulum stress; 3T3-L1 adipocytes; Insulin resistance

1000- 4718(2017)07- 1258- 06

2016- 06- 23

2017- 05- 22

福建省科技重點項目(No. 2013Y0041)； 福建省衛生廳青年課題(No. 2009-2-24)； 國家重點學科老年醫學項目資助(No. 2015-GJLN-2-04)； 福建省衛計委青年項目(No. 2014-1-43； No. 2015-1-38)

R587.1； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.017

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