靶向S1P2基因的siRNA有效片段慢病毒載體的篩選*

晏 蕭， 夏紀毅， 程 波， 朱永生， 姜 睿△

(西南醫科大學附屬醫院 1泌尿外科， 2醫學實驗中心， 四川 瀘州 646000)

·實驗技術·

靶向S1P2基因的siRNA有效片段慢病毒載體的篩選*

晏 蕭1， 夏紀毅2， 程 波1， 朱永生1， 姜 睿1△

(西南醫科大學附屬醫院1泌尿外科，2醫學實驗中心， 四川 瀘州 646000)

目的： 篩選能顯著抑制原代培養的自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR) 陰莖海綿體平滑肌細胞內1-磷酸鞘氨醇受體2(sphingosine-1-phosphate receptor 2，S1P2)基因表達的siRNA慢病毒載體。方法: SHR及SD大鼠各5只用于原代培養陰莖海綿體平滑肌細胞并分成6組，每組5個樣本，每個樣本約1.0×105個細胞，分別為攜帶靶向S1P2基因的siRNA-1～3號靶點的SHR慢病毒轉染組(SHR siRNA-1、SHR siRNA-2和SHR siRNA-3組)、 攜帶慢病毒空載體的SHR轉染組(SHR GFP組)、SHR未轉染對照組(SHR control組)和SD大鼠對照組(SD control組)。將靶向S1P2的siRNA片段的慢病毒載體，以感染復數(MOI)= 60轉染各組SHR陰莖海綿體平滑肌細胞，于轉染72 h后熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況，用Western blot分析各組S1P2、ROCK1、ROCK2和eNOS在陰莖海綿體平滑肌細胞內的表達變化，RT-PCR檢測各組陰莖海綿體平滑肌細胞S1P2、ROCK1和ROCK2的mRNA 的表達。結果: 熒光顯微鏡下觀察SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3和SHR GFP組細胞轉染效率均>80%；SHR GFP組與SHR control組相比，S1P2、ROCK1和ROCK2的mRNA和蛋白表達無明顯差異， SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3和SD control組均顯著低于SHR control組(P<0.05)。而SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3和SHR GFP組eNOS蛋白表達與SHR control組相比均無顯著差別，但SD control組顯著高于SHR control組(P<0.05)。結論: 3組針對S1P2的siRNA慢病毒載體均能顯著抑制SHR陰莖海綿體平滑肌細胞內S1P2的表達，下調ROCK1和ROCK2表達，其中靶向S1P2的siRNA-1抑制效率最高。

自發性高血壓大鼠； 1-磷酸鞘氨醇受體2； 小干擾RNA； 慢病毒載體

陰莖勃起是一個由血管、神經共同調節的復雜生理過程，涉及多條信號通路，其中一氧化氮(nitric oxide，NO)/環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)信號通路障礙、RhoA/Rho激酶信號通路的激活等原因都可導致勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)的發生。40歲以上男性中有近40%患有不同程度的ED，且ED患病率隨著年齡增加[1]。此外，心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)危險因素(如血脂異常、高血壓、糖尿病、吸煙、肥胖、代謝綜合征等)與ED的發生顯著相關[2]。ED與CVD是2種具有不同表現形式的相同的系統性疾病，ED也是心血管疾病的早期臨床表現和導致心血管事件發生的獨立危險因素[3-4]。

高血壓作為常見的CVD危險因素，高血壓人群中ED的發病率超過正常血壓人群發病率的2倍[5]。高血壓可通過下調陰莖海綿體內一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)表達，使NO合成減少，抑制內皮型一氧化氮(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)/NO 信號通路，以及通過激活RhoA/Rho激酶信號通路，增加陰莖海綿體平滑肌張力，從而導致ED[6-8]。5型磷酸二酯酶抑制劑(phosphodiesterase type 5 inhibitor, PDE5I)作為當前治療ED的一線用藥，具有與cGMP類似的結構，可通過競爭性結合PDE5的催化位點從而抑制eNOS/NO 信號通路中cGMP降解，以維持陰莖的勃起[9]。但部分糖尿病、心血管疾病引起的難治性ED在單獨應用PDE5I治療時無效，其中西地那非在治療高血壓性ED時有效率僅為83.2%[5],表明包括RhoA/Rho激酶信號通路在內的其它分子信號在高血壓性ED的發生中具有重要作用。我們前期研究發現自發性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rats，SHR)陰莖海綿體平滑肌細胞中RhoA/Rho激酶信號通路激活，導致陰莖海綿體平滑肌張力增加[6-7]。此外，還發現高血壓導致的ED與1-磷酸鞘氨醇受體2(sphingosine-1-phosphate receptor 2，S1P2)上調相關[8]，認為高血壓可通過上調S1P2激活RhoA/Rho激酶信號通路，從而引起ED。因此抑制SHR的S1P2表達，有望改善勃起功能，成為治療高血壓引起的ED新的治療方式。本研究通過構建3條針對大鼠S1P2的小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)慢病毒載體，轉染至SHR陰莖海綿體平滑肌細胞中，篩選出能夠顯著抑制S1P2表達的siRNA慢病毒載體，并觀察S1P2基因沉默對RhoA/Rho激酶信號通路的影響。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

10周齡健康雄性SHR、SD大鼠各5只，分別購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號為SCXK(京)2012-0001]、西南醫科大學實驗動物中心[許可證號為SCXK(川)2013-17]。

2 材料

攜帶靶向S1P2基因的siRNA慢病毒載體(上海吉凱基因化學技術有限公司)；兔抗大鼠S1P2多克隆抗體和兔抗大鼠ROCK2多克隆抗體(Santa Cruz)；兔抗大鼠ROCK1多克隆抗體和小鼠抗大鼠eNOS多克隆抗體(Abcam)；小鼠抗大鼠GAPDH多克隆抗體、辣根過氧化物酶(horseradish piroxidase，HRP)標記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG(碧云天公司)；總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；RT-PCR 試劑盒(TaKaRa)；DMEM 高糖培養液、胎牛血清、青-鏈霉素混合液和0.25%胰蛋白酶液(HyClone)；倒置熒光顯微鏡(Olympus)；恒溫細胞孵箱(Thermo)；紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)； PCR 擴增儀(MyCycler)；凝膠成像系統(Bio-Rad)。

3 方法

3.1 大鼠陰莖海綿體平滑肌培養與鑒定 采用本課題組前期實驗方法對SHR和SD大鼠陰莖海綿體平滑肌進行原代培養[10]，培養并純化至第4代，采用α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)標記陰莖海綿體平滑肌細胞，應用免疫熒光法與流式細胞術進行細胞的性質及純度鑒定。用臺盼藍染色計數法對細胞存活率進行細胞活力測定。

3.2 siRNA 慢病毒載體的制備 由上海吉凱基因化學技術有限公司針對大鼠S1P2基因合成3條特異性siRNA。siRNA序列1為5’-GCTCTACGGCAGTGACAAA-3’，siRNA序列2為5’-GTGCCATCGTGGTGGAGAA-3’，siRNA序列3為5’-TGGAGAGAGGCTTGCATAT-3’，空載體為5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。并以此構建、包裝3種慢病毒載體及空病毒載體。

3.3 慢病毒轉染 將5只SHR和5只SD大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞隨機分為6個組，分別為攜帶靶向S1P2基因siRNA-1～3號靶點的SHR慢病毒轉染組(SHR siRNA-1、SHR siRNA-2和SHR siRNA-3組)、 攜帶慢病毒空載體的SHR轉染組(SHR GFP組)、SHR未轉染對照組(SHR control組)和SD大鼠對照組(SD control組)。在病毒轉染前1 d消化細胞，并制成密度為5.0×107/L的細胞懸液，以2 mL每孔接種在6孔板上。接種后第2天，觀察細胞若細胞生長良好，長至約40%融合時可行慢病毒轉染。-80 ℃冰箱取出病毒，于冰上融化，按照每孔病毒轉染液最終體積1 mL，在完全培養基中加入Polybrene，使其最終濃度為50 mg/L, 以感染復數(MOI)=60加入病毒原液。用吸管洗盡每孔中培養基，將制備好的病毒轉染液混勻后加入相應孔中，轉染12 h后吸出病毒轉染液，用完全培養基洗2次，加入含20%胎牛血清的完全培養基2 mL后繼續于5% CO2培養箱中繼續培養。轉染72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況，轉染效率低于80%的孔重新進行轉染，轉染效率大于80%的孔繼續培養4 d后進行下一步實驗。

3.4 RT-PCR檢測胞內S1P2、ROCK1和ROCK2的mRNA水平 (1)引物設計合成：由上海生工生物有限公司采用Beacon Designer 2軟件設計并合成S1P2、ROCK1、ROCK2和GAPDH引物，序列見表1。(2)總RNA提取：病毒轉染細胞后第7天，按照RNAsimple總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說明書提取各組細胞總RNA。每個樣本取1 μL，用紫外分光光度儀檢測RNA純度和濃度，吸光度(A)值介于1.8～2.0，濃度>84.22 μg/L為合格，并行逆轉錄反應。(3)逆轉錄：按RT-PCR試劑盒說明書，加入dNTP Mixture 1 μL、Oligo dT Primer(2.5 μmol/L)1 μL和總RNA 1 μg，加RNase-free dH2O至10 μL，在PCR儀上進行65 ℃ 5 min變性、退火反應；再向以上變性退火反應液中加入5× PrimeScript buffer 4 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、PrimeScript RTase 0.5 μL和RNase-free dH2O 5 μL，在PCR儀上按30 ℃ 10 min、42 ℃ 25 min、95 ℃ 5 min進行反轉錄反應，將總RNA逆轉錄為穩定的cDNA。(4)PCR擴增反應及凝膠電泳：配制10× PCR buffer Ⅱ 5 μL、dNTP Mixture 2 μL、TaKaRa Ex Taq HS 0.5 μL、反轉錄反應液5 μL、上游引物和下游引物各0.5 μL、H2O 36.5 μL的50 μL體系，94 ℃ 1 min、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30個循環進行擴增反應。配制2%的瓊脂糖凝膠，加入0.1 mg/L Godview，PCR擴增反應后在110 V恒壓下電泳30 min。使用凝膠成像系統照相，并分析各組指標灰度值。

表1 用于RT-PCR的引物序列

3.5 Western blot測定S1P2、ROCK1、ROCK2和eNOS在大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞中的表達 吸出6孔板內培養液后，PBS洗滌3次，每孔加入200 mL提前配置好的裂解液，將6孔板置于冰上充分裂解30 min，用刮棒將細胞刮于每孔一側，吸入EP管。4 ℃下15 000 r/min離心5 min，取上清液并加入5×上樣緩沖液后開水煮沸5 min。制10%分離膠，取上述蛋白液上樣，電泳初始電壓80 V，當溴酚藍染料的前緣進入分離膠上緣后提高電壓至120 V，繼續電泳至溴酚藍到分離膠的下緣。0.4 A 恒流轉膜120 min，PVDF 膜以5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，兔抗大鼠ROCK1(1∶1 000)、ROCK2 (1∶500)，以及小鼠抗大鼠S1P2(1∶500)、eNOS(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，羊抗兔IgG及羊抗小鼠IgG(1∶2 000)室溫孵育1 h。ECL化學發光，以Quantity One軟件進行分析，結果以S1P2、ROCK1、ROCK2和eNOS灰度值與GAPDH灰度值進行比較。

4 統計學處理

統計分析用SPSS 19.0軟件處理。實驗數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，各組間均數比較采用單因素方差分析，S1P2與ROCK1、ROCK2表達量的相關性采用Pearson相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 大鼠陰莖海綿體平滑肌鑒定

培養、純化至第4代的SHR及SD大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞用α-SMA免疫熒光鑒定。在熒光顯微鏡下觀察，SHR和SD大鼠的細胞綠色熒光染色陽性分別為(94.140±1.640)%和(94.180±1.281)%，見圖1。流式細胞術純度鑒定顯示，SHR和SD大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞純度分別達(95.382±1.383)%和(94.620±2.910)%，見圖2。臺盼藍進行細胞染色，鏡下可見SHR和SD大鼠活細胞率分別為(98.280±0.691)%和(97.760±0.832)%。

Figure 1.Observation of the corpus cavernosum smooth muscle cells of the SHR and SD rats by immunofluorescence staining (×200). The experiments were repeated for 5 times.

圖1 SHR和SD大鼠的陰莖海綿體平滑肌細胞免疫熒光鑒定

Figure 2.Identification of the corpus cavernosum smooth muscle cells of the SHR and SD rats by flow cytometry. The purity of the SHR and SD rat corpus cavernosum smooth muscle cells was 98.49% and 97.04%， respectively. Mean±SD.n=5.

圖2 SHR和SD大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞的FCM鑒定

2 病毒轉染后胞內綠色熒光蛋白表達

在病毒轉染后72 h于熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光蛋白表達情況，可見SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3和SHR GFP組細胞均能激發綠色熒光，且熒光陽性細胞大于80%，說明本實驗構建的慢病毒載體能成功轉入SHR陰莖海綿體平滑肌細胞內。SHR control和SD control組細胞不能激發綠色熒光，此外，可見SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3和SHR GFP組細胞間雜質增多，部分細胞出現皺縮，細胞呈多角形，形態不規則，少量細胞脫落，以SHR siRNA-3組最為明顯，見圖3。

Figure 3.Green fluorescence of the corpus cavernosum smooth muscle cells after transfection (×100).

圖3 轉染后細胞內綠色熒光表達情況

3 RT-PCR測定各組大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞胞內S1P2、ROCK1和ROCK2的mRNA表達

RT-PCR所測得SHR GFP組與SHR control組間S1P2、ROCK1和ROCK2的mRNA表達水平差異無統計學顯著性，但均顯著高于SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3及SD control組，SHR siRNA-1組被抑制效率最高(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The mRNA expression of S1P2, ROCK1 and ROCK2 in the corpus cavernosum smooth muscle cells after transfection. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsSHR control.

圖4 轉染后陰莖海綿體平滑肌細胞內S1P2、ROCK1和ROCK2 mRNA表達的變化

4 Western blot測定S1P2、ROCK1、ROCK2和eNOS在各組大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞中的表達

S1P2、ROCK1、ROCK2和eNOS蛋白在6組細胞中均有表達，其中S1P2、ROCK1和ROCK2在SHR GFP組與SHR control組間表達水平的差異無統計學顯著性，但顯著高于SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3及SD control組，SHR siRNA-1組抑制效率最高(P<0.05)。與SHR control組相比，eNOS在SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3和SHR GFP組表達水平的差異無統計學顯著性，但顯著低于SD control組(P<0.05),見圖5。

Figure 5.The protein expression of S1P2, ROCK1, ROCK2 and eNOS in the corpus cavernosum smooth muscle cells after transfection. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsSHR control.

圖5 轉染后陰莖海綿體平滑肌細胞內S1P2、ROCK1、ROCK2和eNOS蛋白表達的變化

5 Western blot中S1P2與ROCK1、ROCK2表達量的相關性分析

S1P2與ROCK1的蛋白表達量進行相關性分析，相關系數r=0.887(P<0.05)。S1P2與ROCK2的蛋白表達量進行相關性分析，相關系數r=0.894(P<0.05)。

討 論

在高血壓人群中ED發病率高于正常血壓人群，約為35%～50.6%，且高血壓引起的ED比正常血壓人群ED嚴重程度更嚴重，ED的發病率也隨高血壓病程的增加而增加[5, 11-12]。高血壓引起ED的機制包括：海綿體動脈的部分功能和結構異常，管壁增厚和膠原沉積使管腔直徑的減小是常見的結構變化[13]；海綿體血管平滑肌細胞增殖和纖維化[13]；高血壓導致陰部內動脈狹窄或閉塞導致其對陰莖的供血減少[14]；抗高血壓藥物的使用也是導致高血壓患者ED患病率增加的因素[11]；高血壓引起NO/cGMP、RhoA/Rho激酶、HO/CO等信號通路障礙是導致ED的重要機制[7-8, 15]。同時，ED也是高血壓患者血管損傷的臨床征兆，還意味著未來心血管事件的發生風險增加[16]。

RhoA/Rho激酶是種絲氨酸/蘇氨酸激酶,其有2種亞型：ROCKα[Rho關聯含卷曲螺旋蛋白激酶2(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2, ROCK2)]和ROCKβ[Rho關聯含卷曲螺旋蛋白激酶1(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1, ROCK1)]。平滑肌細胞收縮主要是通過增加胞內Ca2+濃度，使胞內Ca2+與鈣調蛋白結合，活化肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase, MLCK)使肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)磷酸化，導致肌球蛋白與肌動蛋白發生交聯，從而引起平滑肌的收縮。而肌球蛋白輕鏈磷酸酯酶(myosin light chain phosphatase, MLCP)使磷酸化的MLC脫磷酸，轉化為MLC，引起平滑肌的舒張[17]。RhoA/Rho激酶可通過Ca2+增敏途徑抑制MLCP，增加MLC磷酸化，使平滑肌維持收縮狀態[18]。此外，動脈粥樣硬化和血管炎的發展也涉及到調節平滑肌張力的RhoA/Rho激酶途徑[19]。我們前期研究發現在SHR陰莖海綿體平滑肌細胞中RhoA/Rho激酶通路激活，參與高血壓性ED發生機制[6-7]。我們采用Rho激酶抑制劑法舒地爾通過抑制RhoA/Rho 激酶信號通路表達和降血壓作用，使SHR勃起功能得到改善[20]，還使用針對RhoA/Rho激酶亞型ROCK2基因的siRNA轉染至SHR海綿體平滑肌細胞后Rock2蛋白的表達受到抑制，顯著改善SHR勃起功能[6]。另一方面，我們還發現在SHR陰莖海綿體平滑肌細胞中S1P2表達上調，而S1P2可通過激活RhoA/Rho激酶信號通路導致ED[8]。S1P2是一種與S1P高度親和的G蛋白偶聯受體，其最初從大鼠主動脈血管平滑肌細胞中克隆分離出來[21]，主要參與炎癥、腫瘤、動脈粥樣硬化、平滑肌收縮及血管通透性等病理生理過程[22]。S1P2同時也是介導RhoA/Rho激酶信號通路激活的主要S1P受體[23]，S1P與S1P2結合后可通過誘導細胞內鈣離子濃度增加和激活RhoA/Rho激酶信號通路引起不同類型的平滑肌收縮，包括血管、支氣管、腸和膀胱平滑肌[24-26]。敲除S1P2基因的小鼠與正常小鼠相比平均動脈壓和左心室的功能及血管形態無明顯改變異，但腎臟和腸系膜血管阻力降低，使血流增加[27],說明S1P2能增加血管平滑肌的收縮性。S1P2同樣在陰莖海綿體組織中表達，且主要表達在陰莖海綿體平滑肌和血管內皮細胞胞膜[8,16]。海綿體神經損傷后陰莖組織纖維化就與S1P2活化，導致RhoA/ROCK1途徑上調相關[28]。在低雄激素狀態下，海綿體內S1P2/RhoA/Rho激酶信號通路上調，引起大鼠ICPmax/MAP下降，導致ED[29]。血管內皮細胞中S1P2抑制可通過操作磷酸化調節eNOS活性的蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)，使通過eNOS產生的NO減少，從而降低血管屏障的破壞[30]。

在本研究中，SHR較SD大鼠對照組陰莖海綿體平滑肌細胞中S1P2、ROCK1和ROCK2的mRNA和蛋白表達均顯著增加， eNOS蛋白表達顯著降低，通過針對大鼠S1P2設計的3條不同的siRNA慢病毒轉染SHR陰莖海綿體平滑肌細胞，發現均能顯著抑制S1P2表達，而eNOS表達無顯著差異，表明高血壓對NO/cGMP通路影響不通過S1P2途徑；同時ROCK1和ROCK2表達均受到顯著抑制，并且S1P2 與ROCK1、ROCK2具有正相關性，表明高血壓可通過上調S1P2的表達而激活RhoA/Rho激酶信號，并且采用針對大鼠S1P2基因的siRNA可顯著抑制SHR海綿體平滑肌細胞S1P2/RhoA/Rho激酶信號通路，其中靶向S1P2基因的siRNA1慢病毒抑制效率最高，可作為抑制RhoA/Rho激酶信號通路而改善高血壓引起的ED的潛在靶點。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Screening of lentiviral vectors carrying effective siRNA targetingS1P2 gene

YAN Xiao1, XIA Ji-yi2, CHENG Bo1, ZHU Yong-sheng1, JIANG Rui1

(1DepartmentofUrology，2CenterofExperimentalMedicine,TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China.E-mail:jiangrui@126.com)

AIM: To screen the lentiviral vector carrying siRNA with higher efficiency of suppressing the sphingosine-1-phosphate receptor 2 (S1P2) gene expression in the primarily cultured corpus cavernosum smooth muscle cells of spontaneously hypertensive rats (SHR). METHODS: SHR and SD rats (n=5 each) were used for primarily culturing corpus cavernosum smooth muscle cells. The cells were randomly divided into 6 groups： SHR siRNA-1, SHR siRNA-2, SHR siRNA-3, SHR GFP, SHR control (SHR non-transfection group), and SD control (SD rat control group). Each group had 5 samples with 1.0×105cells of each sample. At 72 h after transfection (MOI=60) with lentiviral vectors carryingS1P2 siRNA into the SHR corpus cavernosum smooth muscle cells, the expression of GFP was observed under fluorescence microscope. The protein expression of S1P2, ROCK1, ROCK2 and eNOS in the corpus cavernosum smooth muscle cells， and the mRNA expression of S1P2, ROCK1 and ROCK2 were determined by by Western blot and RT-PCR. RESULTS: The transfection efficiency of the corpus cavernosum smooth muscle cells in SHR siRNA-1, SHR siRNA-2, SHR siRNA-3 and SHR GFP groups were>80%. Compared with SHR control group， the mRNA levels and the protein expression of S1P2, ROCK1 and ROCK2 in SHR GFP group showed no remarkable changes, while those in SHR siRNA-1, SHR siRNA-2, SHR siRNA-3 and SD control groups were significantly lower than those in SHR control group (P<0.05). The protein expression of eNOS in SHR siRNA-1, SHR siRNA-2, SHR siRNA-3 and SHR GFP groups were not significantly changed as compared with SHR control group, but that in SD control group was significantly higher than that in SHR control group. CONCLUSION: Three groups of siRNA lentiviral vectors targetingS1P2 inhibit the expression of S1P2 in the corpus cavernosum smooth muscle cells of SHR, and by silencing theS1P2 expression, the expression of ROCK1 and ROCK2 is inhibited. Among them， siRNA-1 has the highest inhibitory efficiency.

Spontaneously hypertensive rats; Sphingosine-1-phosphate receptor 2; Small interfering RNA; Lentiviral vector

1000- 4718(2017)07- 1338- 07

2016- 11- 18

2017- 05- 05

四川省科技廳基金資助項目(No. 14JC0803)；四川省教育廳基金資助項目(No. 15ZA0164)；四川省人力資源和社會保障廳留學回國人員科技項目(川人社辦發[2016-64]號)

R698： R393； Q-33

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.031

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