吉林省耐多藥結核分枝桿菌異煙肼耐藥基因KatG突變特征分析

楊修軍 張煒煜 張立夫 李可維

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·短篇論著·

吉林省耐多藥結核分枝桿菌異煙肼耐藥基因KatG突變特征分析

楊修軍 張煒煜 張立夫 李可維

采用DNA測序技術對吉林省287株耐多藥結核分枝桿菌進行KatG基因序列檢測，以H37Rv標準株KatG基因DNA序列為參比序列，分析檢測菌株KatG基因突變特征。結果顯示，239株耐多藥結核分枝桿菌KatG基因發生突變，突變率為83.28%(239/287)；共涉及13個突變位點，最常見點突變位點為KatG315，突變率為58.18%(167/287)。

分枝桿菌，結核； 抗藥性，多種，細菌； 異煙肼； 多態性，單核苷酸

異煙肼(INH)是結核病治療中最主要的一線藥物，同利福平(RFP)、吡嗪酰胺(PZA)、鏈霉素(Sm)一樣是現代結核病控制策略短期化療的基礎藥物[1]。KatG基因的突變、部分缺失是INH耐藥的重要機制之一，該基因的完全缺失使得過氧化氫酶-過氧化物酶完全失活，從而導致對INH的高度耐藥。KatG基因是結核分枝桿菌中過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因，該基因全長為2222個核苷酸。本研究旨在探討吉林省耐多藥結核分枝桿菌臨床分離株INH耐藥相關基因KatG基因的突變特征。

材料和方法

1.菌株來源：本實驗所涉及370株結核分枝桿菌菌株，包括耐多藥菌株287株、INH敏感菌株82株和H37Rv標準菌株1株，均由吉林省疾病預防控制中心結核參比實驗室傳代、培養、保存。287株耐多藥菌株來源于吉林省4個結核病耐藥監測地區，收集自2013年9月至2015年6月期間，藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)鑒定為RFP和INH同時耐藥。結核分枝桿菌標準菌株H37Rv(ATCC27294)為質控菌株，由中國疾病預防控制中心饋贈，吉林省疾病預防控制中心結核參比實驗室進行傳代保藏。

2.藥敏試驗：采用比例法進行藥敏試驗[2]，包括INH、RFP、卡那霉素(Km)、氧氟沙星(Ofx)，培養基統一購自珠海貝索公司，且在有效期內使用。含藥培養基內藥物終濃度分別為INH 0.2 μg/ml、RFP 40.0 μg/ml、Ofx 2.0 μg/ml和Km 30.0 μg/ml。

3.細菌基因組DNA的提取：刮取羅氏培養基上的克隆菌1標準環，加入到200 μl TE緩沖溶液[三羥甲基氨基甲烷(Tris)-乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液](10 mmol/L Tris-HCL，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)的EP(Eppendorf)離心管中，85 ℃金屬浴30 min滅活，然后100 ℃金屬浴10 min，13 400×g離心10 min，取上清液轉移至新管中即為DNA模板，-20 ℃保存待用。

4.引物設計：根據GenBank記載的H37Rv菌株katG基因序列(Gene ID： 885638，NC_000968.3)，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，擴增產物片段731 bp(擴增區域為結核分枝桿菌全基因組)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。序列為：上游引物：5′-GATCGTCGGCGGTCACACTT-3′；下游引物：5′-CGTTGACCTCCCACCC-GACT-3′。

5. PCR擴增及序列測定：采用50 μl PCR反應體系，包括DNA模板2 μl，Gene Star預混PCR反應液 20 μl，引物(10 μmol/L)各2 μl，DEPC水(經焦碳酸二乙酯處理高溫滅菌的純水，不含DNA、RNA和蛋白質)24 μl。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物經過Qiagen全自動電泳儀檢測后，目的基因片段陽性產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

6.DNA序列分析：應用Mega 6.06軟件將測序數據與H37Rv的KatG序列進行比對分析。

結 果

1. PCR擴增結果：1株H37Rv菌株和82株INH敏感菌株均擴增到KatG基因；287株耐多藥菌株中270株擴增到KatG基因，檢出率為94.08%(270/287)，17株耐多藥菌株未檢測到KatG基因擴增產物，KatG完全缺失率為 5.92%(17/287)。

2.產物測序和比對分析：將270株耐多藥菌株、82株INH敏感菌株的KatG基因測序結果采用基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)進行分析。

3.KatG基因多態性分析：H37Rv標準菌株KatG基因測序數據與參比序列比對結果一致。82株INH敏感菌株KatG基因測序數據與參比序列比對，有16株發生KatG基因第463位點突變，突變形式為精氨酸(Arg)→亮氨酸(Leu)，即CGG→CTG，突變率為 19.51%(16/82)。270株耐多藥菌株KatG基因測序數據與參比序列比對，共涉及13個突變位點，21種突變類型，包含3種同義突變。KatG基因總突變率為83.28%(239/287)；KatG基因第315位點突變率為58.18%(167/287)，突變以絲氨酸(Ser)→蘇氨酸(Thy)，即AGC→ACC為主，占50.52%(145/287)。另外，178株發生ArgKatG463Leu突變，其中56株僅發生KatG基因第463位點突變，突變率為19.51%(56/287)。具體見表1。

討 論

INH為一種藥物前體，在KatG基因編碼的過氧化氫酶-過氧化物酶作用下，生成異煙酸，作用于結核分枝桿菌代謝的各個環節，尤其是抑制分枝菌酸的合成。有研究發現，90.7%的耐INH菌株存在KatG基因突變或缺失，特別是KatG基因第315位點發生率高且與耐藥程度密切相關[3]。本研究中，KatG基因突變率為83.28%；KatG完全缺失率為5.92%，與現有報道一致[4-5]。采用測序手段檢測發現，約有10%～20%耐INH菌株katG基因完全丟失，表明katG基因完全丟失可能是結核分枝桿菌耐藥產生的機制之一[6]。

表1 270株耐多藥結核分枝桿菌異煙肼耐藥相關基因KatG 基因突變特征

研究表明，KatG基因315位點突變致使KatG基因活性位點甲基化，使得過氧化氫酶-過氧化物酶失去活化INH的能力。臨床INH耐藥菌株中的KatG基因的突變以KatG315Ser→Thr為主，發生率高達45%～75%[7-10]。耐多藥菌株KatG基因第315位點突變率各地報道均不相同，俄羅斯地區突變率為93%[11]，南非地區突變率為97%[12]，中國東部地區報道的突變率為72.7%[13]。本研究中，吉林省耐多藥菌株KatG基因第315位點突變率為58.18%，包括堿基突變、堿基缺失和位點聯合突變等共計9種突變類型；其中KatG基因315位點突變以Ser→Thr(AGC→ACC)為主，其次為Ser→Asn、Ser→Arg、Ser→Gly，突變率為4.53%、1.05%、0.35%。本研究中INH耐藥基因KatG基因突變除315位點突變外，還涉及12個位點突變，分別為第298、300、321、322、340、344、345、358、368、463、481、491位點，含有3個位點的同義突變，合計突變率為25.78%。

本研究顯示，有16株INH敏感菌株發生KatG基因463位點突變，突變形式為Arg→Leu(CGG→CTG)，突變率為 19.51%；287株耐多藥菌株中178株發生KatG基因463位點突變，56株僅為KatG基因第463位點單獨突變。KatG基因463位點被認為是除了第315位點以外最常見的突變位點，國外學者通過動力學聯合光譜學對含KatG463Leu和KatG463Arg兩種蛋白的特性進行了研究，發現二者沒有區別，而且這兩種純化蛋白在生物體內或氧化氫酶-過氧化物酶的參數未見差別，說明KatG基因第463位點密碼子Arg→Leu 的突變與菌株INH耐藥性沒有關系[14]，只是一個和耐藥無關的多態性位點。本研究中KatG基因擴增區域為全基因組，涵蓋KatG基因第261、289、315、428、463等熱點位點，研究中有31株耐多藥菌株未檢測到KatG基因突變，這些菌株可能存在其他的耐藥位點或耐藥機制，有待于進一步研究。

綜上所述，吉林省耐多藥結核分枝桿菌INH耐藥相關基因KatG基因的高突變率和突變類型的多樣性，提示通過檢測KatG基因高突變位點可以更好地預測本省結核病中耐INH情況，為進一步建立耐多藥菌株的快速檢測方法提供理論和數據支持。

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(本文編輯：李敬文)

Mutation characteristics of theKatGgene of multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from Jilin province

YANGXiu-jun,ZHANGWei-yu,ZHANGLi-fu,LIKe-wei.

DepartmentofMicrobiologyTesting,JilinProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Changchun130062,China

ZHANGWei-yu,Email: 81637146@qq.com

Mutations characteristics ofkatGgenes in 287 multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from Jilin province were analyzed by DNA sequencing technique, H37Rv standard strain was selected as control. The results showed that mutation ofkatGgene occurred in 239 multi-drug-resistantMycobacteriumtuberculosis(83.28% (239/287)), involving 13 mutation sites. The most common mutation site wasKatG315 (58.18% (167/287)).

Mycobacteriumtuberculosis; Drug resistance, multiple, bacterial; Isoniazid; Polymorphism, single nucleotide

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.022

吉林省衛生計生委科研課題(2015ZC037)

130062 長春，吉林省疾病預防控制中心微生物檢驗所

張煒煜，Email：81637146@qq.com

2017-01-09)