γ干擾素釋放試驗檢測頸部淋巴結細胞懸液輔助診斷頸部淋巴結結核的初步報告

許輝 閆廣鵬 馬晶 夏志剛 唐暉 李軍

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·論著·

γ干擾素釋放試驗檢測頸部淋巴結細胞懸液輔助診斷頸部淋巴結結核的初步報告

許輝 閆廣鵬 馬晶 夏志剛 唐暉 李軍

目的 評估γ干擾素釋放試驗(IGRA)檢測頸部淋巴結細胞懸液對頸部淋巴結核的輔助診斷價值。方法 將2015年1月至2016年5月在新疆維吾爾自治區人民醫院收治的48例頸部淋巴結腫大患者采用復合診斷標準分為頸部淋巴結結核組(21例)，非頸部淋巴結結核組(27例)，對48例患者的外周血和頸部淋巴結細胞懸液進行γ干擾素釋放試驗檢測，運用SPSS 19.0軟件進行數據分析，兩組間斑點形成細胞(SFCs)個數的比較采用Mann-WhitneyU檢驗，樣本間率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。結果 IGRA檢測頸部淋巴結細胞懸液和外周血的敏感度分別為90.48%(19/21)、95.24%(20/21)，差異無統計學意義(χ2=0.00，P>0.05)，頸部淋巴結細胞懸液和外周血的特異度分別為70.37%(19/27)、92.59%(25/27)，差異有統計學意義(χ2=4.43，P<0.05)。頸部淋巴結結核組中IGRA檢測外周血和頸部淋巴結細胞懸液的SFCs中位數及上下四分位數[M(Q1,Q3)]分別為109(52，186)個、68(30，156)個，不同標本間檢測的SFCs中位數差異無統計學意義(U=175.00,P>0.05)。非頸部淋巴結結核組中IGRA檢測外周血和頸部淋巴結細胞懸液的SFCsM(Q1,Q3)分別為0(0，18)個、0(0,3) 個,不同標本間檢測的SFCs中位數差異無統計學意義(U=271.00，P>0.05)。頸部淋巴結結核組的淋巴結細胞懸液SFCs明顯高于非頸部淋巴結結核組的淋巴結細胞懸液SFCs，差異有統計學意義(U=45.00，P<0.05)。結論 γ干擾素釋放試驗檢測頸部淋巴結細胞懸液具有可行性，對頸部淋巴結結核的輔助診斷有一定的價值。

結核, 淋巴結； 標本制備； 酶聯免疫斑點檢測； 干擾素γ； 敏感性與特異性

新疆是中國結核病疫情較為嚴重的地區，2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查顯示，全國15歲及以上人群活動性肺結核的患病率為459/10萬，而新疆地區15歲以上人群標化活動性肺結核患病率為1526.12/10萬[1-2]，明顯高于全國平均水平。頸部淋巴結結核作為一種常見的肺外結核，在該地區的發病率也處于較高水平。結核分枝桿菌培養作為頸部淋巴結結核的確認性診斷，該檢查手段特異度高但敏感度低，其陰性結果也無法排除結核分枝桿菌感染，并且結核分枝桿菌培養周期長達數周，給及時確診頸部淋巴結結核帶來了困難。頸部淋巴結穿刺活檢作為一種微創的檢查手段，因其提取的組織量有限往往需要結合其他輔助診斷做出綜合判斷[3]。切取頸部淋巴結進行組織病理學檢查也是目前臨床上常用的確診頸部淋巴結結核的方法，但抗酸染色陽性率低[4]，有時難以與其他淋巴結肉芽腫病病變相鑒別。因此，有時頸部淋巴結結核的診斷需要綜合影像學檢查、臨床表現，以及細胞學和組織病理學檢查做出綜合判斷[5-6]。γ干擾素釋放試驗(γ-interferon release assay，IGRA)通過將2種結核分枝桿菌特異性抗原[早期分泌靶向抗原6(ESAT-6)和培養濾液蛋白10(CFP-10)]做為刺激原去刺激外周血中致敏淋巴細胞，定量檢測經過抗原刺激后分泌γ干擾素的相關效應T細胞數量來判斷是否存在結核分枝桿菌的感染，已被廣泛應用于結核病的輔助診斷。中國屬于結核病的高負擔國家，運用IGRA對我國不同人群所做的結核潛伏感染調查顯示，結核潛伏感染率為13%～33.6%[7-9]。因此，在新疆這一結核病高負擔地區，IGRA對頸部淋巴結結核的輔助診斷價值必然受到該地區較高結核潛伏感染的影響。我們嘗試運用IGRA對頸部腫大淋巴結的細胞懸液進行檢測，探討該方法對頸部淋巴結結核的輔助診斷價值。

資料和方法

一、研究對象

選擇2015年1月至2016年5月新疆維吾爾自治區人民醫院收治的48例頸部淋巴結病變患者，研究對象的入選標準是以頸部淋巴結腫大為診斷收治的新疆本地常住居民患者，患者需要并同意行頸部淋巴結活檢。

排除標準：伴有未經治愈的肺結核和(或)除外頸部淋巴結結核的肺外結核病變；接受免疫調節治療，無病理學或細菌學檢查結果而臨床診斷為頸部淋巴結結核，原發灶明確的頸部轉移癌。

依據組織病理學和(或)微生物學診斷結果將患者分為頸部淋巴結結核組和非頸部淋巴結結核組。

頸部淋巴結結核組有21例，其中女14例，男7例，年齡中位數及上下四分位數[M(P25,P75)]為35(15,76)歲。

非頸部淋巴結結核組27例，其中女13例，男14例，年齡M(P25, P75)為46(17,78)歲，該組頸部淋巴結病變包括：頸部淋巴結反應性增生24例，頸部神經鞘瘤并發頸部淋巴結反應性增生1例，頸部淋巴結轉移癌1例，濾泡性淋巴瘤1例。

所有研究對象簽署知情同意書，本研究經過新疆維吾爾自治區人民醫院倫理委員會審查并被核準執行。

二、方法

1. 外周血結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)檢測：選擇T-SPOT.TB試劑盒(Oxford Immunotec公司產品)進行IGRA檢測。以肝素抗凝真空采血管采集患者8 ml的外周靜脈血，置于室溫環境內并于4 h內進行外周血單個核細胞分離，并制備成濃度為2.5×106個/ml的單個核細胞懸液。50 μl細胞培養液加入到空白對照孔；將50 μl抗原B(CFP-10)加入至檢測孔B；將50 μl抗原A(ESAT-6)加入至檢測孔A；將50 μl陽性對照(植物血凝素，PHA)加入至陽性對照孔。然后在預包被好γ干擾素抗體的平板中，每孔依次加入100 μl濃度為2.5×106個/ml的單個核細胞懸液。 放入CO2培養箱(37 ℃，5% CO2)培養16～20 h。先根據標本量計算好酶結合物工作液所需的量，以1∶200的比例將酶結合物原液與磷酸鹽緩沖液(PBS)混合，制成酶結合物工作液，每孔加50 μl，4～8 ℃孵育1 h。每孔用200 μl PBS液洗滌4次，拍干，然后加顯色液50 μl，暗處靜置7 min，用蒸餾水終止反應。將板孔內液體拍干，晾至底膜干透后行斑點形成細胞(SFCs)個數讀取，并記錄報告結果。

陽性結果判斷標準為：空白對照孔SFCs個數為 0～5 個、且抗原 A 或抗原 B 孔的SFCs個數-空白對照孔SFCs個數≥6個；空白對照孔SFCs個數為 6～10 個、且抗原 A 或抗原 B 孔的SFCs個數≥2×空白對照孔SFCs個數。陰性結果判斷標準：如果不符合上述標準且陽性對照孔正常時，檢測結果判斷為陰性。若空白對照孔內SFCs個數≥10個或陽性對照孔內SFCs個數<20個，試驗結果判斷為無效試驗。

2.淋巴結細胞懸液T-SPOT.TB檢測：選擇與外周血檢測相同的試劑盒。淋巴細胞懸液制備所用器械用品均經過滅菌處理或為一次性無菌包裝。頸部病變淋巴結均經手術摘取，如果頸部病變淋巴結發生液化則取臨近腫大淋巴結。頸部淋巴結手術摘取后隨即切取約0.5 cm3～1 cm3大小淋巴結組織，用以制備淋巴結細胞懸液，其余送病理檢查。以生理鹽水反復沖洗淋巴結后剝離并去除淋巴結包膜，隨后置于15 ml玻璃勻漿器內加8 ml 0.9%氯化鈉注射液制備勻漿，制備過程中緩慢用力至無肉眼可見淋巴結組織團塊后以70 μm細胞過濾器過濾，抽取6 ml過濾后的淋巴結細胞懸液注入肝素抗凝真空采血管內，并于2 h內進入檢測環節。檢測前用注射器緩慢吸入上述懸液至離心管中，加入1640培養液至10 ml，以700×g離心7 min。棄上清液，重復此步驟一次。再加入1640培養液，定容到7～8 ml 左右，混勻，將該混懸液加到裝有3～4 ml淋巴細胞分離液的離心管中，以1000×g離心22 min。將管中離心后的呈云霧狀白膜的淋巴細胞層由上向下慢慢吸取加入到新的15 ml離心管中，并加1640培養液定容至10 ml，顛倒混勻一次后以600×g離心7 min。離心后盡快倒掉上清，先加少量 1640培養液，吹打將細胞打開，再加1640培養液至10 ml，混勻，以350×g離心7 min。離心后倒掉上清，加入500 μl AIM-V培養液，用移液器吹打重懸細胞沉淀，另取1.5 ml離心管，按標本號編號，離心管中加入100 μl細胞懸液+100 μl 1640培養液, 混勻后上機(三分類/五分類計數儀工程師模式)并行涂片人工計數復核。按照方案將每個標本的淋巴細胞數稀釋至2.5×106個/ml。其余步驟及結果判定同外周血檢測方案。陽性檢測結果示例見圖1。整個研究過程中由病理科醫生及檢驗科醫生獨立做出結果判斷。

空白對照：空白對照孔；陽性對照：PHA檢測孔；抗原B:抗原CFP-10檢測孔； 抗原A：抗原ESAT-6檢測孔圖1 頸部淋巴結細胞懸液IGRA檢測陽性結果示例

3.統計學處理：運用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，非正態分布的計量資料采用“M(Q1,Q3)”表示，兩組樣本間率的比較采用χ2檢驗， SFCs的比較用Mann-WhitneyU檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1. IGRA檢測頸部淋巴結細胞懸液和外周血結果：IGRA檢測頸部淋巴結細胞懸液和外周血的敏感度分別為90.48%(19/21)，95.24%(20/21)，兩者差異無統計學意義(χ2=0.00，P>0.05)；檢測外周血和頸部淋巴結細胞懸液的特異度分別為70.37%(19/27)、92.59%(25/27)，頸部淋巴結細胞懸液的特異度高于外周血，差異有統計學意義(χ2=4.43，P<0.05)，詳見表1。非頸部淋巴結結核組中有2例患者的外周血及淋巴結細胞懸液IGRA均為陽性。1例為頸部神經鞘瘤并發頸部淋巴結反應性增生患者(SFCs外周血為109個，淋巴組織懸液為 239個)，另1例為濾泡性淋巴瘤患者(SFCs 外周血為114個，淋巴組織懸液為40個)。

頸部淋巴結結核組和非頸部淋巴結核組外周血及淋巴細胞懸液SFCs比較：頸部淋巴結結核組中IGRA檢測外周血和頸部淋巴結細胞懸液的SFCs個數M(Q1，Q3)分別為109(52，186)個、68(30，156)個，兩者差異無統計學意義(U=175.00,P>0.05)。非頸部淋巴結結核組中IGRA檢測外周血和頸部淋巴結細胞懸液的SFCs個數M(Q1,Q3)分別為0(0，18)個、0(0，3)個，兩者差異無統計學意義(U=271.00，P>0.05)。但頸部淋巴結結核組的淋巴結細胞懸液的SFCs個數明顯高于非頸部淋巴結結核組，差異有統計學意義(U=45.00，P<0.05)。

討 論

目前有2種IGRA檢測方法：一種是采用酶聯免疫吸附試驗法，該方法檢測全血中致敏淋巴細胞受到結核分枝桿菌特異性抗原刺激后釋放的γ干擾素水平；另一種方法是采用酶聯免疫斑點技術檢測外周血單個核細胞中致敏淋巴細胞受到結核分枝桿菌特異性抗原刺激后釋放的γ干擾素水平，兩種檢測方法的檢驗原理和效能相似[10]。因酶聯免疫斑點技術檢測的是經分離的單個核細胞，重點檢測活細胞的功能[11]，能排除懸液中其他成分對試驗結果產生不可預測的影響，因此本研究采用酶聯免疫斑點技術進行檢測。

表1 48例患者頸部淋巴結細胞懸液和外周血進行IGRA檢測的結果分析

注 敏感度(%)=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值(%)=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值(%)=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%；陽性似然比=敏感度/(1-特異度)；陰性似然比=(1-敏感度)/特異度

2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告顯示,新疆肺結核患者中男性是女性患病概率的1.31倍[12]，而納入本研究的頸部淋巴結結核病患者中女性患者較多(14/21)，女性較男性更易患頸部淋巴結結核這一現象也被其他相關研究所證實[13-14]，但相關原因仍有待進一步分析。

本研究中將分離后得到的頸部淋巴結組織單個核細胞和外周血單個核細胞濃度均調整為2.5×106個/ml，然后行IGRA檢測。白雪娟等[15]采用IGRA檢測結核性胸膜炎患者胸腔積液時發現，需要將分離得到的胸腔積液中單個核細胞的濃度進行重新調整，否則影響結果判定。而本研究采用制備相同濃度的外周血及頸部淋巴結組織單個核細胞進行IGRA檢測，并未發現影響結果判定。然而，IGRA檢測的γ-干擾素是由活化的 T淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)、樹突狀細胞、單核細胞組成的細胞群經結核特異性抗原刺激后分泌的[11]，目前尚不清楚外周血單個核細胞和淋巴組織單個核細胞中上述細胞群在經結核特異性抗原刺激后的表現是否具有同質性，再加之本研究樣本量的局限性，因此能否采用相同的臨界值進行結果判斷仍需更多的樣本數據進行進一步研究來驗證。

本研究中IGRA檢測頸部淋巴結細胞懸液和外周血對診斷頸部淋巴結結核的特異度分別為92.59%、70.37%，IGRA檢測頸部淋巴結細胞懸液診斷頸部淋巴結結核的特異度明顯高于外周血檢測結果(P<0.05)。我國新疆地區的結核病負擔水平較高導致該地區存在較多的潛伏結核感染者,在本研究中非頸部淋巴結結核組外周血IGRA檢測的陽性率為29.63%(8/27)，這使得本研究中IGRA檢測外周血對診斷頸部淋巴結結核的特異度較低。正常情況下機體在感染結核分枝桿菌后會產生相應的致敏T淋巴細胞,由于致敏T淋巴細胞有在結核感染區域富集的特性[16-17]，被結核分枝桿菌感染的頸部淋巴結內富集有針對結核分枝桿菌的致敏淋巴細胞，通過提取頸部淋巴結細胞懸液中的單個核細胞進行IGRA檢測可判斷該淋巴結是否存在結核致敏淋巴細胞，從而判斷該淋巴結是否存在結核分枝桿菌感染。因此，本研究中IGRA檢測頸部淋巴結細胞懸液診斷結核病的特異度明顯高于IGRA檢測外周血。

納入本研究的非頸部淋巴結結核病患者中有2例患者的外周血及淋巴結細胞懸液IGRA檢測均為陽性。1例為頸部神經鞘瘤并發頸部淋巴結反應性增生患者(SFCs外周血檢測為109個，淋巴組織懸液檢測為 239個)， 來自屬于新疆結核病的高發區之一的和田地區，但否認與結核病患者有密切接觸史，術后隨訪22個月未見頸部出現異常腫大淋巴結。另1例為濾泡性淋巴瘤患者，該患者2年前曾經病理活檢確認為右頸部淋巴結結核，行抗結核藥物治療9個月，因左頜下淋巴結腫大血液科要求行切除活檢，術后病理報告為濾泡性淋巴瘤，該患者SFCs外周血檢測為114個，淋巴組織懸液檢測為40個。頸部淋巴結結核的組織病理特征性病變是干酪樣壞死及肉芽組織形成，但在這些特征性病變形成之前，結核分枝桿菌進入淋巴結后就會引起淋巴結內效應淋巴細胞針對結核分枝桿菌產生細胞免疫，即使淋巴結已被淋巴瘤細胞浸潤，仍有相應的致敏淋巴細胞。而且，目前尚無診斷與鑒別診斷潛伏性結核感染和活動性結核病的金標準，IGRA可以用作檢測結核感染的手段但不能區分潛伏性結核感染和活動性結核病[18]，因此，即使淋巴結細胞懸液IGRA檢測結果為陽性，因組織病理學缺乏特征性的病變或被其他病變所掩蓋，這些淋巴結難以被病理學診斷為淋巴結結核。

在納入本研究的頸部淋巴結結核患者中有2例患者的外周血IGRA結果為陽性而淋巴結細胞懸液IGRA為陰性。分析該2例患者的病歷資料，發現其中1例患者的頸部淋巴結結核病變均發生大面積液化壞死并波及皮下組織,術中切取液化壞死區邊緣部分的可疑頸部淋巴結病變組織制備淋巴結懸液，可能未切取到淋巴結組織或切取的有效淋巴結組織過少而導致陰性結果。另1例切取液化壞死區周圍腫大頸部淋巴結標本的病理檢查結果為淋巴結反應性增生，我們推測該淋巴結的增生不是由于感染了結核分枝桿菌而引起，而是淋巴結液化壞死后引起周圍組織炎癥從而引起的周圍淋巴結反應性增生，因該淋巴結并未有結核分枝桿菌侵入而產生相應的致敏淋巴細胞，所以該淋巴結制備的淋巴結細胞懸液IGRA檢測結果為陰性。但上述推測是否正確仍需要進一步驗證。

IGRA通過檢測頸部淋巴結細胞懸液中結核分枝桿菌致敏的淋巴細胞數量，起到了判斷被檢頸部淋巴結是否存在結核分枝桿菌感染的作用，彌補了外周血IGRA檢測無法定位結核感染部位的不足，特別是當其他輔助方法提供的診斷證據不充分時，為頸部淋巴結結核的診斷可提供有力的支撐。但IGRA檢測作為一種間接檢測手段，并不能區分潛伏性結核感染和活動性結核病，也不能夠檢測結核分枝桿菌的數量，特別是懷疑頸部淋巴結腫瘤性病變并發結核分枝桿菌感染時，頸部淋巴結細胞懸液IGRA檢測結果需要結合其他輔助診斷方法(如GeneXpert MTB/RIF[19]等方法)來綜合判斷是否為頸部淋巴結結核。

本研究采用頸部淋巴結細胞懸液進行IGRA檢測也存在一定的局限性：由于頸部淋巴結標本需要手術切取獲得, 因此該方法更適用于對經無創或微創檢查手段無法確診頸部淋巴結結核而需要行頸部淋巴結切取活檢的患者；頸部淋巴結細胞懸液標本無法如外周血標本那樣批量采集、集中處理，其操作程序也較復雜，檢測價格較高，在低收入結核高負擔地區推廣有一定難度。另外，因本研究樣本量所限，相關結論還需進行大樣本量的研究來做進一步驗證。

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(本文編輯：薛愛華)

Preliminary report on the value of cervical lymph node cells suspensions performed with interferon-gamma release assay for diagnosing tuberculous lymphadenitis

XUHui,YANGuang-peng,MAJing,XIAZhi-gang,TANGHui,LIJun.

DivisionofOralandMaxillofacialSurgery,People’sHospitalofXinjiangUyghurAutonomousRegion,Urumqi830001,China

XUHui,Email:omsxuhui@139.com

Objective The aim of the study was to evaluate the value of cervical lymph node cells suspensions performed with interferon-gamma release assays (IGRA) for diagnosing cervical tuberculous lymphadenitis (CTL). Methods Of the 48 patients with cervical lymphadenitis, 21 were confirmed as CTL, and 27 were diagnosed as non-CTL. IGRA using peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and cervical lymph node cell suspensions were performed to examine the IFN-γ response to the ESAT-6 and CFP-10 antigens. Spot forming cells (SFCs) in diffe-rent groups were compared using the Mann-WhitneyUtest. Categorical variables were compared using the Pearson Chi-squared test. The criterion for statistical significance wasP<0.05. Results The IGRA sensitivity of Cervical lymph node cell suspensions and PBMC was 90.48% (19/21) and 95.24% (20/21)，respectively．The specificity of cervical lymph node cell suspensions and PBMC was 70.37% (19/27) and 92.59% (25/27)，respectively．There was no significant difference of between sensitivity peripheral blood mononuclear cells and cervical lymph node cell suspensions (χ2=0.00，P>0.05).The specificity of cervical lymph node cell suspensions IGRA was significantly higher than that of peripheral blood mononuclear cells (χ2=4.43，P<0.05). In CTL group, SFCs median of PBMC and cervical lymph node cell suspensions performed IGRA were 109 (52,186) and 68 (30,156), respectively. There was no statistical difference in the SFCs median of PBMC and cervical lymph node cell suspensions (U=175.00,P>0.05). In non-CTL group, SFCs median of PBMC and cervical lymph node cell suspensions performed IGRA were 0 (0, 18) and 0 (0,3),respectively. There was no statistical difference in the SFCs median of PBMC and cervical lymph node cell suspensions. However, the SFCs of cervical lymph node cell suspensions in CTL group was significantly higher than that in non-CTL group (U=45.00,P<0.05). Conclusion Cervical lymph node cells suspensions performed with IGRA can be used as a tool to detect cervical tuberculous lymphadenitis.

Tuberculosis, lymph node； Specimen handling； Enzyme-linked immunospot assay； Interferon-gamma； Sensitivity and specificity

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.011

新疆維吾爾自治區人民醫院科研基金 (20150118)，國家自然基金 (81160210)

830001 烏魯木齊，新疆維吾爾自治區人民醫院口腔頜面外科(許輝、閆廣鵬、李軍)，檢驗科(馬晶、夏志剛、唐暉)

許輝， Email: omsxuhui@139.com

2017-05-31)