MTB線粒體翻譯控制28蛋白在昆蟲細胞中的表達和純化

卓文基 劉志輝 周琳 陳燕梅 陳濤 孫琦 郭卉欣

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·技術交流·

MTB線粒體翻譯控制28蛋白在昆蟲細胞中的表達和純化

卓文基 劉志輝 周琳 陳燕梅 陳濤 孫琦 郭卉欣

對MTB線粒體翻譯控制(mitochondrial translation control，MTC) 蛋白MTC28基因進行克隆， 構建真核表達質粒并在昆蟲細胞中表達MTC28蛋白。采用PCR技術從MTB H37Rv 標準株基因組中擴增MTC28基因片斷，MTC28基因片斷和質粒pFastbac1經EcoRI和XhoI雙酶切，T4 DNH連接酶連接，構建重組質粒pFastbac1-MTC28，轉染DH5α感受態細菌，在含有氨芐青霉素溶菌肉湯(lysogeny broth，LB)固體培養基中篩選陽性克隆，挑選生長的菌落進而在含有氨芐青霉素的液體LB培養基中進行細菌克隆。PCR鑒定目的基因插入質粒后，陽性克隆細菌進行質粒(pFastbac1-MTC28)的提取。pFastbac1-MTC28質粒轉染DH10 Bac感受態細菌構建重組桿狀質粒(Bacmid-MTC28)，用含有慶大霉素、卡那霉素和四環素的液體LB培養基進行細菌克隆，采取藍白斑技術篩選陽性菌落。PCR鑒定為陽性的細菌進行桿狀重組質粒(Bacmid-MTC28)的提取。利用脂質介導的轉染技術，將桿狀重組質粒(Bacmid-MTC28)轉染sf9昆蟲細胞中，包裝重組桿狀病毒，并表達蛋白質。結果成功構建了MTC28真核表達質粒，建立了桿狀病毒表達MTC28蛋白的表達體系，并表達MTC28蛋白，通過純化獲得了高純度且均一化的MTC28蛋白。

分枝桿菌, 結核； 線粒體蛋白質類； 基因, 線粒體； 轉染； 質粒； 基因, 昆蟲

當前全球面臨的結核病疫情十分嚴峻，但現有結核病疫苗—卡介苗(BCG)免疫保護效果極不穩定，線粒體翻譯控制(mitochondrial translation control，MTC：就是線粒體翻譯控制)28 蛋白存在于MTB、牛分枝桿菌及少數的卡介菌中，該蛋白可被大多數結核病患者和感染者的血清所識別， 因此 MTC28是一種理想的疫苗候選抗原。本研究為了獲得MTC28蛋白，克隆了MTC28基因，并成功首次構建到桿狀病毒表達質粒穿梭載體桿粒(Bacmid)中并獲得Bacmid-MTC28重組桿狀病毒質粒。之后利用昆蟲細胞表達體系，表達了MTC28蛋白，并進一步利用親和層析(鎳柱)和分子篩層析(Superdex 200 PG)純化得到高純度、均質化的MTC28蛋白。

材料和方法

一、材料

pFastbac1載體購自美國Invitrogen公司、大腸桿菌(Escherichiacoli)菌種DH5α為本實驗室保存，菌種DH10 Bac購自美國Invitrogen公司。昆蟲細胞系sf9、High Five購自美國Invitrogen公司；結核分枝桿菌H37Rv標準株(由本實驗室保存)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(購自德國TIANGEN公司)；限制性內切酶EcoRI、XhoI、T4 DNA連接酶、DNA marker(購自大連TaKaRa寶生物公司)；pfu DNA聚合酶(購自美國Promega公司)。親和層析(鎳柱)和分子篩(Superdex 200 PG)購自美國General Electric(GE)公司；AKTA Purifier儀器借用平臺中心儀器。

二、 方法

(一)引物設計

參照美國基因數據庫(Gen Bank)公布的序列(登錄號：U7527.1)，擴增目的基因MTC28編碼區長度為933 bp。上游引物MTC28-F：5′-CCGGAATTCATGATCCAGATCG-CGCGCAC-3′；下游引物1 MTC28-R1：5′-GCGCGGCGGGACTGGT-3′；下游引物2 MTC28-R2：5′-CCCTCGAGCTACATCATCACCATCACCAT(6×His-tag)GCGCGGCGGGACTGGT-3′。其中，CCG：上游引物保護性堿基；GAATTC：EcoRI內切酶位點；CG：下上物保護性堿基；CTCGAG：XhoI內切酶位點。

此外，合成M13引物進行桿狀病毒重組質粒Bacmid-MTC28鑒定，上游引物M13-F：CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG；下游引物M13-R：AGCGGATAACAATTT-CACACAGG。上述所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司負責合成。

(二)目的基因的擴增

按曲拉通法(略有改進:根據MTB臨床標本的特點，筆者對TE-Triton法中原有的裂解液進行了改進，改進后的配方為：三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) (pH 8.0)10 mmol, 乙二胺四乙酸(EDTA) 1 mmol, 聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100) 1%,chelex-100(一種聚苯乙烯基體離子交換樹脂) 1%,乙基苯基聚乙二醇(NP-40) 10%。提取結核分枝桿菌H37Rv標準株的DNA，以此為模板擴增MTC28全長基因。PCR反應體系：超純水24.25 μl，50%甘油5 μl，二甲基亞砜(DMSO) 2.5 μl，三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNTPs) 4 μl，pfu緩沖液(pfu buffer)5 μl，上游引物MTC28-F 2 μl，下游引物MTC28-R1 2 μl，模板DNA 5 μl，pfu DNA聚合酶0.25 μl，總體積50 μl。PCR反應程序：94 ℃ 預變性5 min，進入循環，94 ℃變性55 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃終延伸10 min。產物經瓊脂糖凝膠電泳后采用TIANGEN試劑盒純化回收。

上述回收的片段用MTC28-F和MTC28-R2繼續進一步PCR，以便連入6×His-tag標簽，目的是便于后期表達的MTC28蛋白的純化。

(三)真核表達載體的構建

堿裂解法提取質粒DNA，用EcoRI和XhoI雙酶切真核表達載體pFastbac1(pFastbac1經過改造加入GP67分泌信號肽)和目的基因MTC28。上述雙酶切產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳分離后的目的條帶用TIANGEN試劑盒進行純化回收，回收后的目的條帶用T4 DNA連接酶連接，連接產物轉染DH5α感受態細胞。

(四)真核表達載體的鑒定

經氨芐青霉素培養基篩選，挑取陽性菌落進行PCR鑒定。當菌液渾濁時，取1 μl菌液進行PCR鑒定，反應條件和反應程序同前。陽性菌液轉接至4 ml玻璃管中進行搖菌，提取重組質粒pFastbac1-MTC28。

(五)昆蟲表達載體的構建

將上述重組質粒pFastbac1-MTC28轉化至DH10 Bac感受態細菌中，利用藍白斑篩選技術進一步篩選陽性桿狀重組穿梭載體桿粒(Bacmid-MTC28)。轉染后的感受態細菌放置溫箱中培養，待白斑明顯后挑取白斑轉接到4 ml含有卡那霉素、慶大霉素和四環素的溶菌肉湯(LB)液體培養基中進行細菌克隆。

(六)昆蟲表達載體的鑒定和提取

用M13引物對上述菌液進行PCR測定，鑒定重組質粒Bacmid-MTC28。陽性條帶大小為3300 bp，其中300 bp處為陰性條帶。陽性菌液利用異丙醇沉淀法提取重組質粒Bacmid-MTC28。

(七)桿狀病毒的制備

上述重組質粒Bacmid-MTC28轉染對數生長期的草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda，Sf9)細胞，包裝重組桿狀病毒。在超凈臺中，膠原凝集素Ⅱ(CellfectinⅡ) 6～8 μl + unsupplemented Grace’s Medium 200 μl，輕輕混勻，然后加入重組質粒Bacmid-MTC28 2 μg后輕輕混勻，靜置孵育30 min。然后加至用sf9細胞貼壁鋪盤的六孔板中，并補加800 μl unsupplemented Grace’s Medium至6孔板。放入27 ℃培養箱中靜置孵育4～6 h。棄去6孔板中的培養混合液，每孔加2 ml Sf-900 Ⅲ 無血清培養基(serum free medium,SFM)(Thermo Fisher Scientific公司)(含50 U/ml 青霉素、50 μg/ml 鏈霉素和0.125 μg/ml Fungizone?Antimycotic)。27 ℃)培養箱中孵育，隨時注意觀察轉染現象。72 h后收取病毒上清至無菌的EP管，4 ℃避光保存，這就是P1病毒。P1病毒拉梯度轉染擴增P2病毒，3 d后收取P2病毒并擴增P3病毒。病毒成功包裝擴增的現象為宿主細胞sf9變大、變圓，且細胞呈現顆粒化狀態。

(八) MTC28蛋白的表達

P3病毒轉染對數生長期的High Five昆蟲細胞，P3病毒按照1∶3的比例轉染High Five昆蟲細胞進行MTC28蛋白的表達。

(九)MTC28蛋白的純化

3天后收取High Five昆蟲細胞表達的上清，上清液經過0.22 μm孔徑抽濾后結合到鎳柱上，然后用梯度咪唑洗脫目的蛋白。經過試驗，發現用10 mmol Tris-Hcl，200 mmol NaCl，350 mmol Imidazole可以洗脫下來MTC28蛋白。

洗脫下來的蛋白繼續用Superdex 200 PG分析篩進一步純化，最終得到高純度且均質化的MTC28蛋白。

結 果

一、目的基因的擴增

擴增的MTC28的全長結構基因為933 bp，PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳顯示，在預期部位出現目的條帶。連入6×His-tag標簽后條帶大小有所增加，但不明顯(圖 1)。

M：DNA分子標準marker；1：MTC28-6×His-tag PCR條帶；2：MTC28 PCR條帶圖1 PCR擴增MTC28基因電泳結果

二、桿狀病毒表達載體的構建

重組質粒pFastbac1-MTC28轉染DH10 Bac感受態細菌后，利用同源重組構建重組質粒Bacmid-MTC28。M13引物鑒定后發現重組基因大小為3300 bp左右(圖 2)。

M：DNA分子標準marker；1：陰性重組質粒Bacmid-MTC28 PCR條帶；2：陽性重組質粒Bacmid-MTC28 PCR條帶圖2 PCR鑒定重組質粒Bacmid-MTC28基因電泳結果

三、MTC28蛋白的純化

重組質粒Bacmid-MTC28轉染處于對數生長期的sf9昆蟲細胞后，包裝并擴增P3病毒，之后利用P3病毒轉染對數生長期的High Five昆蟲細胞進行MTC28蛋白的表達。表達后的蛋白上清液，先后經過親和層析(鎳柱)和分子篩純化，最終獲得高純度均質化的MTC28蛋白。親和層析發現，用10 mmol Tris-Hcl，200 mmol NaCl，350 mmol Imidazole可以洗脫下來MTC28蛋白，為進一步獲得高純度和均質化的MTC28蛋白，繼續用分子篩Superdex 200 PG進一步純化，結果顯示MTC28在100 ml左右出峰，MTC28蛋白相對分子質量約為28 000(28 kDa)(圖 3)。

左側第一泳道為標準蛋白marker；右側4個泳道為MTC28蛋白純化后的樣品泳道圖3 MTC28分子篩純化，以及SDS-PAGE(二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)鑒定

討 論

據世界衛生組織統計顯示，全球有近1/3人口感染結核分枝桿菌，每1秒鐘都會新增1例患者，尤其是多重耐藥菌株的出現及與艾滋病共同感染的發生，更加重了結核病對人類健康的危害[1-2]。快速、有效和靈敏的診斷是控制結核病的關鍵之一。目前，常用的診斷試劑結核菌素純蛋白衍生物(PPD)是一種未被明確成分的結核分枝桿菌抗原混合物，其普遍存在于結核分枝桿菌及環境中的非結核分枝桿菌等菌株中，檢測時常將卡介苗接種者及活動性肺結核治愈者誤檢為陽性，而且不能將活動性肺結核與潛伏感染相區別，限制了PPD的臨床應用[3]。MTC28是新近從結核分枝桿菌H37Rv株培養濾液中純化分離出的蛋白抗原，蛋白質編碼區(CDS)全長為933個堿基，相對分子質量約為28 000[4]，由310個氨基酸組成。存在于結核分枝桿菌、牛型結核分枝桿菌及少數的卡介菌中，且該蛋白可被大多數結核病患者和結核病感染者的血清所識別。因此，結核分枝桿菌中的MTC28蛋白是一種理想的疫苗候選抗原[5]，有望成為結核病血清學診斷的候選抗原之一[5]。

桿狀病毒表達系統是昆蟲表達系統中的一種，具有安全性高，對外源基因克隆容量大，重組病毒易于篩選，具有完備的翻譯后加工修飾系統和高效表達外源基因的能力等特點[6]，它能對多種目的蛋白進行修飾和加工，使其高效表達且具有一定的生物學活性，在近年得到較為廣泛的應用。草地貪夜蛾卵巢組織來源的細胞(Sf9和Sf21)是應用最廣泛的桿狀病毒表達載體系統(baculovirus ex-pression vector system，BEVS)，可以用于表達多種體外重組的蛋白質[7]。

本試驗昆蟲表達載體Bacmid-MTC28的成功構建及高純度均質化MTC28蛋白的獲得，較之前原核表達體系和pcDNA3.1(+)-MTC28真核表達質粒的構建有著本質的區別。昆蟲細胞更類似于哺乳類細胞，能對蛋白質完成翻譯后修飾(如磷酸化、脂肪酸酰化、糖基化等)，其表達的MTC28重組蛋白和天然蛋白更接近，具有更高的生物活性[8]。昆蟲細胞懸浮培養極易生長，很快即可適應無血清培養基，用于生物發酵罐的大規模培養。鑒于桿狀病毒的宿主細胞僅限于昆蟲，其生物安全性更好[9]。目前，重組桿狀病毒的構建、細胞培養和蛋白質表達的方法已應用多年，大部分試劑和儀器較易獲得，較為經濟[10]。

本研究首次在昆蟲表達載體中表達并獲得了可溶性的MTC28蛋白，經過親和層析和分子篩Superdex 200 PG純化，結果顯示MTC28蛋白在100 ml左右出峰，MTC28蛋白相對分子質量約為28 000。實驗的整體性比較完善，接下來的工作可以重點研究分析MTC28蛋白的結構與其他靶標分子的相互作用。利用昆蟲細胞表達體系，經過階段性純化獲得可溶性的高純度及均質化的MTC28蛋白，為進一步研究該蛋白的免疫保護效果和相應的結核病疫苗及免疫學研究奠定了重要的實驗基礎。

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(本文編輯：范永德)

Expression and purification of the MTC 28 protein in insect cells

ZHUOWen-ji*,LIUZhi-hui,ZHOULin,CHENYan-mei,CHENTao,SUNQi,GUOHui-xin.

*CenterforTuberculosisControlofGuangdongProvince,Guangzhou510630,China

ZHOULin,Email:gdtb@vip.163.com

To clone theMycobacteriumtuberculosis(MTB) mitochondrial translation control (MTC) gene, construct the Bacmid-MTC28 eukaryotic expression plasmid and express MTC28 protein in insect cells. MTC28 gene fragment was amplified from the genome of the MTB H37Rv standard strain by PCR. Then the PCR products and plasmid pFastbac1was digested with EcoRI and XhoI, linked with T4 ligase, the recombinant plasmid pFastbac1-MTC28 was constructed. The pFastbac1-MTC28 was transfected into DH5α competent cells, positive clone was screened by Ampicillin L-B medium and biological amplified by LB liquid medium.The plasmid (pFastbac1-MTC28) extracted from positive clone was identified by PCR and transfected into DH10 Bac competent cells to construct Bacmid-MTC28. The competent cells was amplified with liquid LB medium containing gentamicin, kanamycin and tetracycline, positive clone was screened by blue-white technique. The positive bacteria was amplified by LB liquid medium, extracted the plasmid (Bacmid-MTC28) and identified the target genes by PCR. By liposome transfection, the recombinant plasmid Bacmid-MTC28 was transfected into Sf9 insect cells in logarithmic growth phase, packaged recombinant baculovirus and expressed protein. We successfully constructed the eukaryotic expression plasmid of Bacmid-MTC28, established a baculovirus expression vector and expressed the corresponding proteins. High purity and homogenized MTC28 protein was obtained by purification.

Mycobacteriumtuberculosis； Mitochondrial proteins； Genes, mitochondrial； Transfection； Plasmid； Insect cells

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.021

廣東省省級科技計劃項目(2014A020212238、2016A020216021);廣州市科技計劃項目(201604020006)

510630 廣州，廣東省結核病控制中心(卓文基、周琳、陳燕梅、陳濤、孫琦、郭卉欣)；廣州市胸科醫院肺部疾病研究所(劉志輝)

周琳,Email:gdtb@vip.163.com

2017-06-19)