84株廣泛耐藥結核分枝桿菌對新型氟喹諾酮類藥物的耐藥情況分析

宗兆婧 荊瑋 霍鳳敏 董玲玲 馬異峰 逄宇 黃海榮

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·論著·

84株廣泛耐藥結核分枝桿菌對新型氟喹諾酮類藥物的耐藥情況分析

宗兆婧 荊瑋 霍鳳敏 董玲玲 馬異峰 逄宇 黃海榮

目的 研究廣泛耐藥結核分枝桿菌臨床分離株對新型氟喹諾酮類藥物的耐藥特征以及氟喹諾酮類藥物耐藥相關基因突變的特點。 方法 選取2012年4月至2014年4月在北京胸科醫院住院治療的84例廣泛耐藥結核病患者的臨床分離菌株，應用微孔板阿爾瑪藍顯色法(micro-plate alamar blue assay，MABA) 檢測菌株對左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)，所有菌株都進行了gyrA基因和gyrB基因的耐藥決定區(QRDR)的序列測定。 結果 84株廣泛耐藥結核分枝桿菌臨床分離株經MABA 檢測，分別以1 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml作為耐藥判讀標準，左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星3種氟喹諾酮類藥物的耐藥率分別是88.1%(74/84)、44.0%(37/84)、61.9%(52/84)。89.3%(75/84)的臨床分離株發生了gyrA基因耐藥決定區突變，其中以第94位點突變最為常見，Asp94Gly突變菌株的MIC值較高，而所有菌株的gyrB基因均為野生型。 結論 廣泛耐藥結核分枝桿菌對新型氟喹諾酮類藥物耐藥形勢嚴峻，耐藥基因突變形式以gyrA基因突變為主，第94位點的Asp94Gly突變可能和高水平耐藥有關。

泛耐藥結核病； 分枝桿菌，結核； 喹諾酮類； 微生物敏感性試驗； 多藥耐藥相關蛋白質類； 點突變

結核病耐藥形勢日趨嚴重，新型抗結核藥物的開發和針對耐藥結核病治療的新方案制定迫在眉睫。氟喹諾酮類藥物 (fluoroquinolones，FQs) 抗菌譜廣、殺菌效果好、半衰期長，并且對結核分枝桿菌同樣有效，因此被認為是一類治療耐藥結核病的有效藥物[1]。包含氟喹諾酮類藥物的抗結核治療方案可提高痰菌轉陰率，縮短抗結核治療周期，對減少結核病的傳播和耐藥結核病的發生有重要意義[2]。第三代氟喹諾酮類藥物左氧氟沙星在我國已被廣泛應用于耐藥結核病的治療，擁有更強抗分枝桿菌活性的第四代氟喹諾酮類藥物莫西沙星和加替沙星，近年來也逐步在臨床得到使用。氟喹諾酮類藥物與常用的一線、二線抗結核藥物無交叉耐藥[3]，莫西沙星和加替沙星不僅有強大的殺菌活性，對人體內持留菌也有殺菌作用[4]，因此對耐藥結核病的治療顯示出良好的應用前景。在WHO耐藥結核病指南[5]和我國耐藥結核病診療指南[6]中，都推薦第三代和第四代氟喹諾酮類藥物用于耐藥結核病的治療，但氟喹諾酮類藥物對廣泛耐藥(extensive drug resis-tance，XDR)結核病的應用價值，無論是技術指南還是臨床實踐，都缺乏針對性的數據。

氟喹諾酮類藥物通過與細菌的DNA旋轉酶(拓撲異構酶Ⅱ)結合，阻止DNA的復制和轉錄，導致DNA降解和細菌死亡，進而達到殺滅結核分枝桿菌的作用。結核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物發生耐藥的分子機制主要是編碼DNA促旋酶的基因突變[7]。DNA促旋酶由gyrA和gyrB編碼的A亞基和B亞基組成，A亞基是多數氟喹諾酮類藥物的作用靶點，因此不同氟喹諾酮類藥物之間容易出現交叉耐藥[8]。由于氟喹諾酮類藥物的不合理使用和抗生素濫用，結核分枝桿菌復合群對該類藥物的耐藥情況日益加重，環丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等已經出現較高的耐藥性[9]。而且，隨著臨床用藥時間的延長，氟喹諾酮類藥物的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)還會隨之逐漸升高[10]，耐藥程度加重。

因此，了解廣泛耐藥結核分枝桿菌臨床分離株對不同氟喹諾酮類藥物的藥物耐受情況及耐藥相關基因突變情況，可以為廣泛耐藥結核病方案中氟喹諾酮類藥物的選擇提供依據。本研究選擇廣泛耐藥結核分枝桿菌臨床分離株，對左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星進行體外藥敏試驗以及耐藥相關基因突變的檢測分析。

資料和方法

一、菌株和試劑來源

1. 菌株來源：本研究的84株廣泛耐藥結核分枝桿菌菌株來自北京胸科醫院2012年4月至2014年4月住院患者臨床分離株。所有菌株均經對硝基苯甲酸(PNB)抑制生長試驗鑒定為結核分枝桿菌，且絕對濃度法臨床檢測均對氧氟沙星耐藥。

2. 試劑儀器來源：藥敏試驗所用左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星、7H9培養基藥粉均購買于Sigma公司。營養添加劑OADC購買于美國BD公司，羅氏培養基購買于珠海銀科公司，96孔板購買于美國Costar公司，阿爾瑪藍(Alamar blue)購買于美國Bio-Rad公司。

二、研究方法

1. 微孔板阿爾瑪藍顯色法(micro-plate Alamar blue assay，MABA)藥敏試驗：刮取羅氏培養基上生長4周的新鮮菌落，磨菌瓶研磨均勻，稀釋菌懸液至1麥氏比濁度，再稀釋1/20，向預制的含藥96孔板中每孔加入100 μl菌液。37 ℃培養7 d，再向微孔板中加入20 μl阿爾瑪藍和50 μl 5% Tween-80的預混顯色液，37 ℃繼續培養24 h觀察96孔板顏色變化。判定標準：藍色孔為無菌生長，粉色孔為有菌生長，藍色孔的最低藥物濃度記為能抑制結核分枝桿菌生長的MIC。對3種氟喹諾酮類藥物(左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星)均設置11個倍比稀釋的濃度測試梯度，為0.032～32 μg/ml。當MIC>判定界值時判斷為耐藥，反之則為敏感。按照WHO推薦標準，分別按照1 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml 作為左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星的流行病學耐藥判讀標準[5]，其中高水平耐藥按照MIC≥4 μg/ml判讀[11]。

2. 氟喹諾酮類耐藥相關基因擴增及序列測定：新鮮菌落80 ℃金屬浴2 h，離心半徑8 cm，12 000 r/min離心10 min去上清，每個環氧樹脂(EB)離心管內加20 μg/ml溶菌酶200 μl和菌沉淀37 ℃孵育過夜。按照MasterPure基因組DNA提取試劑盒流程抽提菌株的基因組DNA。設計引物對gyrA和gyrB進行擴增、產物測序。gyrA上游引物序列5′-GATGACAGACACGACGTTGC-3′，下游引物序列5′-GGGCTTCGGTGTACCTCAT-3′，擴增產物大小為398 bp；gyrB上游引物序列5′-GAGTTGGTGCGGCGTAAGAGC-3′，下游引物序列5′-CGGCCATCAAGCACGATCTTG-3′，擴增產物大小為322 bp。以上擴增產物均送睿博興科公司測序。

結 果

1. 左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星的MIC結果：在84株廣泛耐藥菌株中，左氧氟沙星的MIC值分布在0.25～16 μg/ml之間，莫西沙星的MIC值分布在0.125～16 μg/ml之間，加替沙星的MIC值分布在0.125～8 μg/ml之間。所有廣泛耐藥結核分枝桿菌臨床分離株對左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星的MABA法藥敏試驗MIC結果如表1所示。分離株對左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星的耐藥率分別是88.1%、44.0%、61.9%。

表1 84株廣泛耐藥MTB菌株對左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星的MIC值分布情況

注 Lfx：左氧氟沙星；Mfx：莫西沙星； Gfx：加替沙星

2. 三種新型喹諾酮類藥物之間的交叉耐藥結果：按照WHO推薦的1 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml判讀左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星耐藥情況，84株臨床分離株中包括左氧氟沙星耐藥74株、莫西沙星耐藥37株、加替沙星耐藥52株，對這3種新型氟喹諾酮類藥物同時耐藥的菌株有37株。按照WHO提出的莫西沙星耐藥臨界值0.5 μg/ml判讀，臨床分離株對左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星耐藥的菌株數目分別是74、76、52株，對3種藥物同時耐藥的菌株有52株，如圖1所示。

圖1 左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星三種新型氟喹諾酮類藥物之間的交叉性耐藥情況

3. 耐藥相關基因測序分析結果：對菌株進行gyrA和gyrB測序分析，gyrA基因突變率較高(89.3%，75/84)。突變集中在第88、90、91、94位點，以第94位點突變為主(57.1%，48/84)，且在該位點檢測到Asp94Gly、Asp94Asn、Asp94Ala、Asp94Tyr、Asp94His共5種氨基酸突變形式，其中存在Asp94Gly突變的菌株MIC較高，該突變位點和形式可能與氟喹諾酮類藥物高水平耐藥相關，具體數據見表2。gyrB未見堿基突變，均為野生型，未見gyrA和gyrB兩基因聯合突變。

討 論

氟喹諾酮類藥物在耐藥結核病治療中非常重要，但此類藥物兼有廣譜抗生素身份，在社區獲得性肺炎、支氣管擴張、慢性阻塞性肺疾病急性加重期、泌尿系感染等一般細菌感染中廣泛應用，因而易于出現過多藥物暴露而發生耐藥。廣泛耐藥結核分枝桿菌臨床分離株對新型氟喹諾酮類抗菌藥物出現較高的耐藥率，將給臨床抗結核治療方案的制定造成極大難題。

通過MABA法檢測84株廣泛耐藥結核分枝桿菌臨床分離株的MIC值顯示，同一菌株中莫西沙星和加替沙星的MIC小于左氧氟沙星，與研究報道一致[12]。WHO曾經推薦的莫西沙星耐藥的臨床臨界值為0.5 μg/ml，新的指南改為推薦0.5 μg/ml和2 μg/ml兩個濃度，但更傾向于推薦應用2 μg/ml的濃度[5]。在84株臨床分離株中，所測試的3種藥物之間存在著雙向交叉耐藥，結核分枝桿菌復合群對第三代和第四代氟喹諾酮類藥物有較高的耐藥比例，這一結論也和目前指南[5-6]指出的第四代氟喹諾酮類藥物體外藥敏試驗提示交叉耐藥一致[12-15]。當按照0.5 μg/ml標準判讀莫西沙星耐藥時，耐藥菌株比例(76/84，90.5%)甚至超過左氧氟沙星耐藥的菌株(74/84，88.1%)，但按照2 μg/ml耐藥界值判讀，則莫西沙星耐藥菌株的比例大幅度降低(44.0%，37/84)。由此不難發現，藥物敏感性試驗中臨界值的選定對于耐藥和交叉耐藥的判定起著決定性影響，因此臨界濃度的確定需要在長期、多中心、大數據評估的基礎之上建立才可能更準確。

除了莫西沙星外，WHO新的指南也調整了左氧氟沙星的耐藥臨界濃度，由2 μg/ml更改為1 μg/ml[5]。本課題組一項研究也證實目前應用的左氧氟沙星臨界濃度值大于結核分枝桿菌的流行病學界值，故而會將一些含有耐藥相關基因突變的菌株判讀為野生菌株[17]。Poissy等[11]對5株廣泛耐藥菌株進行動物實驗得出結論，對左氧氟沙星耐藥的廣泛耐藥菌株在莫西沙星MIC<2 μg/ml時仍可在廣泛結核病治療中應用。Maitre等[18]認為無論氟喹諾酮類耐藥還是敏感，在廣泛耐藥結核病的治療中莫西沙星的治療效果明顯優于左氧氟沙星。本研究有39株(39/84，46.43%)臨床分離株因莫西沙星耐藥臨界值由0.5 μg/ml 變為2 μg/ml而被判讀為莫西沙星敏感菌株，有13株(13/84，15.48%)菌株對左氧氟沙星的MIC為1 μg/ml、因臨界值改變由原來的敏感菌株被判讀為耐藥菌株。然而，這些患者應用莫西沙星方案是否有效尚不得而知。耐藥臨界值是提示結核分枝桿菌對藥物敏感情況的一項重要指標，在患者抗結核方案的制定中起到非常重要的作用。然而WHO對莫西沙星MIC判讀標準改變原因并未做出詳細的解釋，左氧氟沙星耐藥且莫西沙星MIC介于0.5～2 μg/ml之間的菌株對莫西沙星臨床治療效果如何，還需要進一步的臨床觀察和評估。

表2 84株廣泛耐藥結核分枝桿菌臨床分離株中gyrA基因突變形式和MIC

注 Lfx：左氧氟沙星；Mfx：莫西沙星； Gfx：加替沙星；Ala：丙氨酸；Asn：天冬酰胺；Val：纈氨酸；Pro：脯氨酸；His：組氨酸；Tyr：酪氨酸；Gly：甘氨酸；Cys：半胱氨酸；Asp：天冬氨酸；Ser：絲氨酸；耐藥菌株數目按照流行病學界值判讀；高水平耐藥定義為MIC≥4 μg/ml

按照莫西沙星臨床耐藥臨界濃度2 μg/ml的標準，左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星三者之間比較，出現了左氧氟沙星、加替沙星耐藥但莫西沙星敏感的現象。本研究中加替沙星耐藥率高于莫西沙星，考慮是因為加替沙星作為第四代氟喹諾酮類藥物，殺菌活性較強，然而其MIC臨界值則使用了和三代氟喹諾酮類藥物相同的1 μg/ml標準。不排除隨著加替沙星使用的增多，在獲得更多數據的情況下會對耐藥臨界值的調整。

因氟喹諾酮類藥物不同于一線抗結核藥物的殺菌機制，被廣泛應用于耐藥結核病的治療[19]。本研究發現的突變熱點主要集中在gyrA基因的QRDR，該段序列高度保守，是氟喹諾酮類藥物結合的主要部位[21]。本研究結果初步表明，gyrA基因突變是廣泛耐藥結核分枝桿菌對以上3種氟喹諾酮類藥物耐藥主要機制。本研究得到的gyrA基因突變均為錯義突變，主要發生在基因保守區第67～106位的密碼子區，第88位、90位、91位、94位密碼子上，與國內外報道一致[16,21]。Asp94Gly和Ala90Val的改變是最常見的耐藥突變類型，與同類研究結果一致[16,22]。在gyrA基因突變類型中，Asp94Gly位點突變可能與氟喹諾酮類高水平耐藥有關，該種突變形式相關的高水平耐藥菌株數目為左氧氟沙星>莫西沙星>加替沙星，說明在目前左氧氟沙星更易出現高水平耐藥突變。可能與該位點基因突變類型引起致氟喹諾酮類藥物靶標gyrA結構的顯著改變有關，氟喹諾酮類藥物和gyrA結合位點發生改變，使A亞基和氟喹諾酮類藥物結合能力顯著下降，進而導致MIC的變化并出現耐藥。

在本研究的84株廣泛耐藥結核分枝桿菌臨床分離株中，未檢測到gyrA突變也無gyrB的菌株有9株，其中分別有4株對左氧氟沙星耐藥、5株對莫西沙星耐藥。此種表型藥敏試驗和基因型藥敏結果不一致的現象，推測可能與菌群的異質性有關。患者感染的結核分枝桿菌復合群同時存在對氟喹諾酮類藥物耐藥和敏感的不同菌群，如敏感菌株為優勢菌群，可能會因為耐藥菌株比例較低而無法檢測到相關耐藥基因突變，而表型藥敏試驗由于能檢測到較低比例的耐藥菌群的存在，因此報告耐藥[23]。另外，gyrA和gyrB基因突變以外的其他耐藥機制也可能造成上述結果的不一致，如拓撲異構酶Ⅳ的改變、細胞膜通透性改變、藥物外排泵等機制。

部分廣泛耐藥菌株在第88和第90位點存在突變(Gly88Ala突變3株、Ala90Val突變4株)，但這些菌株仍表現為對這3種新型氟喹諾酮類藥物敏感的藥敏表型，考慮為氨基酸結構原因。纈氨酸(Val)、甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)同屬于非極性氨基酸，且這三種氨基酸在結構、荷電性等方面相似，因此Gly88Ala、Ala90Val的改變未能引起gyrA基因與氟喹諾酮類藥物結合能力的明顯改變，故未能導致明顯耐藥表型改變。

綜上所述，廣泛耐藥結核分枝桿菌中氟喹諾酮類藥物耐藥形勢嚴峻，新型氟喹諾酮類藥物已存在嚴重耐藥，氟喹諾酮類藥物在廣泛耐藥結核病治療中的應用受到極大地挑戰。在廣泛耐藥結核病治療方案制定中，應按照藥敏實驗結果評估相應的用藥指征，而耐藥界值的判定需要更多的臨床數據驗證。

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(本文編輯：范永德)

首屆臨床結核病超聲診斷與治療新進展研討會征文通知

超聲在結核病的診斷與治療中不可或缺，應該引起業界同仁的高度重視并進行實踐探索。超聲及超聲介入技術簡便易行，具有高性價比，尤其超聲技術對多臟器的可企及性，更是開辟了對多種臟器結核病診斷與治療的新領域。為及時交流臨床結核病超聲診斷與治療的經驗和科研成果，掌握最新學術動態，推動結核病超聲診療工作的規范化進程，由中國防癆協會《中國防癆雜志》期刊社、杭州市紅十字會醫院聯合主辦的“首屆臨床結核病超聲診斷與治療新進展研討會”擬于2017年10月19—22日在浙江省杭州市召開。大會將邀請國內結核病超聲領域、臨床領域、基礎研究領域知名專家對結核病診療國內外最新研究動向、最新理論等進行精彩的專題學術講座，同時將遴選優秀會議征文進行大會發言，并擬于《中國防癆雜志》組織專題重點號刊發。

征文要求：(1)凡符合超聲診斷與介入技術在結核病臨床應用、基礎研究方面內容的稿件均在征文之列。來稿要求未在國內外公開發行刊物上發表(請在文題上方注明“未公開發表，未一稿多投”)；(2)論著類稿件需提供全文+800字左右的摘要，摘要包括目的、方法、結果和結論，也可僅提供符合上述要求的摘要；(3)其他類型稿件為全文投稿；(4)全文4000字以內，編排順序為：題目、郵編、單位(至科室)、姓名、中文摘要、正文、參考文獻；(5)本次會議征文不接收通過郵局郵寄的紙質版論文，只接收Word版電子文件；格式為：題目3號黑體、正文5號宋體，單倍行距；(6)請務必附第一作者與通信作者的通信地址、聯系電話、手機、Email。入選論文將納入會議《資料匯編》，經大會學術委員會評選出的優秀論文將推薦刊登于《中國防癆雜志》或《結核病與肺部健康雜志》，并安排大會發言；(7)征文請通過Email發送至郭萌編輯郵箱(手機：17718596164；電話：010-62257257；Email：guomenggg@163.com)。郵件注明“結核病超聲會議”；截止日期：2017年9月1日。

《中國防癆雜志》期刊社

杭州市紅十字會醫院

Resistance analysis of 84 extensively drug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates against three new generation fluoroquinolones

ZONGZhao-jing,JINGWei,HUOFeng-min,DONGLing-ling,MAYi-feng,PANGYu,HUANGHai-rong.

NationalClinicalLaboratoryonTuberculosis,BeijingKeyLaboratoryforDrug-resistantTuberculosisResearch,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingTuberculosisandThoracicTumorInstitute,Beijing101149，China

HUANGHai-rong,Email:huanghairong@tb123.org

Objective To investigate the resistant status of extensively drug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates against new genratation fluroquinolones (FQs)． Methods Extensively drug-resistantMycobacteriumtuberculosis(XDR-MTB) clinical isolates were collected from Beijing Chest Hospital between 2012—2014. Absolute concentration method was used for ofloxacin (Ofx) and levofloxacin (Lfx) susceptibility testing, while broth dilution method was used to detect the minimal inhibitory concentration (MIC) of the isolates against three FQs，including Lfx，moxifloxacin (Mfx) and gatifloxacin (Gfx). The quinolone resistance determining regions (QRDR) ofgyrAandgyrBwere sequenced for all the enrolled isolates. Results A total of 84 XDR-MTB isolates were enrolled. Among them,74 (74/84, 88.1%), 37 (37/84，44.0%) and 52 (52/84, 61.9%) isolates were resistant to Lfx, Mfx and Gfx according the cut-off criteria recommended by WHO, respectively. Mutations at 88, 90, 91 and 94 locus ofgyrAwere detected among 89.3% (75/84)of the enrolled isolates, and Asp94Gly accounting for high-level FQs resistance. All the strains had wild typegyrB. Conclusion Our findings demonstrated that new generation FQs resistance were very frequently observed among XDR-MTB isolates, and mutation within QRDR ofgyrAwas the main mechanism of FQs resistance.

Extensively drug-resistant tuberculosis;Mycobacteriumtuberculosis; Quinolones; Microbial sensitivity tests; Multidrug resistance-associated proteins; Point Mutation

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.005

101149 首都醫科大學附屬北京胸科醫院 北京市結核病胸部腫瘤研究所 國家結核病臨床實驗室

黃海榮，Email: huanghairong@tb123.org

2017-06-19)