結核分枝桿菌耐藥相關基因擴增多重PCR體系的建立與評估

李自慧 潘麗萍 孫琦 呂翎娜 杜博平 張洪靜 孫照剛 張宗德

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·論著·

結核分枝桿菌耐藥相關基因擴增多重PCR體系的建立與評估

李自慧 潘麗萍 孫琦 呂翎娜 杜博平 張洪靜 孫照剛 張宗德

目的 建立結核分枝桿菌耐藥相關基因多重PCR反應體系，評估該體系以臨床分離株DNA和痰菌DNA為模板擴增耐藥相關基因的成功率。方法 常規(guī)提取結核分枝桿菌臨床分離株(47株)及涂陽肺結核患者(21例)痰菌DNA。根據目前研究已發(fā)現的結核分枝桿菌耐藥相關基因合成引物，建立2個多重PCR體系以擴增目的基因。擴增片段經測序證實后，計算該體系用于兩種樣本的擴增成功率。結果 針對臨床常用8種抗結核藥物，選取結核分枝桿菌rpoB、katG、inhA、embB、gyrA、rpsL、rrs、eis共8個耐藥相關基因設計合成引物。建立2個多重PCR體系擴增8個耐藥基因，該體系擴增47株結核分枝桿菌臨床分離株DNA和21例菌陽肺結核患者痰菌DNA的成功率分別為100.0%(47/47)和76.2%(16/21)。結論 本研究建立了高效擴增8個結核分枝桿菌耐藥基因的多重PCR體系，結果對進一步研發(fā)結核病耐藥分子診斷產品具有重要意義。

結核, 抗多種藥物性； 聚合酶鏈反應； 基因測定； 核酸擴增技術； 技術評估, 生物醫(yī)學

結核病(tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌感染引起的一種嚴重威脅人類健康的傳染性疾病。近年來耐藥結核病的出現和傳播使得全球結核病的防控進一步受到威脅。據估計全球約20%的結核分枝桿菌分離株至少耐一種主要的抗結核藥物[1]，更嚴重的是耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)、廣泛耐藥結核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)甚至全耐藥結核病(totally drug-resistant tuberculosis，TDR-TB)的出現和增多，使得患者病程延長，死亡風險增高，一旦治療失敗會導致耐藥結核分枝桿菌的長期傳染。我國不僅是結核病高負擔國家，耐藥結核病疫情也十分嚴峻。據統計，我國新發(fā)和復發(fā)結核病患者中MDR-TB分別占5.7%和25.6%，其中約8.0%為XDR-TB患者，均高于全球平均水平[2-3]。

研究發(fā)現，結核分枝桿菌耐藥基因突變(包括藥物作用靶標基因、修飾或分解藥物的酶類基因等)、藥物外排泵、藥代動力學差異(包括藥物代謝快慢、不同病變組織藥物滲透力等)均有可能導致耐藥的發(fā)生，其中耐藥基因突變是導致結核病耐藥的一個重要原因。例如：約95%的利福平耐藥菌株rpoB基因發(fā)生突變，50%～95%的異煙肼耐藥菌株katG基因發(fā)生突變[4]。近年來應用全基因組測序技術也發(fā)現了大量可能與耐藥相關的基因位點[5-7]。在耐藥檢測方面，基于細菌培養(yǎng)技術的傳統表型藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)需要2～3個月才能得到結果，而基于分子生物學技術的耐藥基因突變檢測技術可以快速檢出耐藥基因，指導臨床及時選擇有效藥物，盡早治療和控制耐藥結核病。

目前，可用的耐藥結核病分子檢測方法仍十分缺乏，世界衛(wèi)生組織推薦使用Xpert MTB/RIF檢測和線性探針檢測(line probe assay，LPA)技術。前者是由美國賽沛(Cepheid)公司研發(fā)、基于聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)的技術，能快速、簡便地檢測利福平耐藥，其主要缺點是費用十分昂貴，無法普及推廣[8]。LPA主要基于PCR擴增和反向雜交技術，其代表產品GenoType MTBDRplus可以檢測利福平和異煙肼耐藥，GenoType MTBDRsl可以檢測氟喹諾酮類藥物及二線注射類抗結核藥物耐藥，但目前總體價格昂貴，需要專業(yè)技術人員操作，敏感度也略欠缺[9-11]。PCR技術目前仍然是分子檢測的基礎，但單一PCR反應每次只能擴增1個基因，實際工作要完成多樣本的多個耐藥基因檢測，工作量巨大。多重PCR(multiplex PCR)通過在同一反應體系里加入一對以上的引物，可以在同一反應管中實現對多個核酸片段的擴增，在提高通量、保持高特異度和高敏感度的同時，能大大降低成本、節(jié)省樣本，更加簡單、快速和高效。本研究擬針對目前比較明確的結核分枝桿菌耐藥基因，建立多重PCR反應體系，并評估其擴增臨床分離株DNA及痰菌DNA的成功率，為進一步研發(fā)結核病耐藥基因檢測產品奠定基礎。

材料和方法

1. 菌株及痰標本來源：收集結核分枝桿菌臨床分離株47株，以及菌陽肺結核患者痰樣本21例，所有樣本來源于首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院。

2. 臨床分離株DNA的提取：用TE緩沖液[pH=8.0，含三羥甲基氨基甲烷(Tris)-Cl 0.1 mol/L，乙二胺四乙酸(EDTA) 0.5 mol/L]重懸細菌，加入溶菌酶至5 mg/ml，37 ℃過夜振蕩消化，加入蛋白酶K至終濃度為1 mg/ml，加入10%十二烷基硫酸鈉(SDS)至終濃度為1%，37 ℃振蕩1 h。用DNA小量提取試劑盒(51304，Qiagen公司)按操作說明提取菌株DNA，溶解于適量無菌去離子水，用NanoDrop 2000(美國Thermo Scientific)進行定量檢測后，貯存于-20 ℃。

3. 痰菌DNA的提取：在生物安全柜中對痰標本常規(guī)采用N-乙酰-L-半胱氨酸氫氧化鈉液化，取500 μl液體離心收集沉淀，用TE緩沖液洗一遍，重懸后加入玻璃珠，室溫劇烈渦旋，然后95 ℃熱滅活20 min，離心取上清，加1/10體積氯化鈉和2倍體積預冷無水乙醇沉淀DNA，最后離心收集沉淀，用70%乙醇洗一遍，將DNA重新溶解于20 μl TE緩沖液，貯存于-20 ℃。

4. 耐藥相關基因的引物設計及合成：參考文獻[12]，同時采用Primer premier 5.0軟件設計和評價引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行引物合成。

5. PCR擴增及測序：PCR擴增采用的水生棲熱菌(thermus aquaticus，Taq)酶購于北京康為世紀生物科技有限公司(CW0654A)，脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)購于天根生化科技(北京)有限公司(CD111-02)。由生工生物工程(上海)股份有限公司完成PCR產物的雙向測序。

6. 主要儀器：生物安全柜(NU-425-300E，美國Nuaire公司)、基因擴增儀(My Cycler，美國Bio-rad公司)、凝膠成像系統(GelDoc XR，美國Bio-rad公司)、核酸分析儀(Nanodrop2000，美國Thermo公司)。

結 果

1. 耐藥相關基因擴增所用引物序列：本研究選取目前發(fā)現的8個結核分枝桿菌耐藥相關基因序列，分別為rpoB、katG、inhA、embB、gyrA、rpsL、rrs和eis，設計合成的引物序列見表1。

表1 結核分枝桿菌耐藥基因擴增引物序列

注 F為上游引物；R為下游引物

2. 耐藥基因擴增多重PCR體系的建立：本研究根據不同耐藥基因擴增片段大小，嘗試不同組合和擴增體系，最終通過優(yōu)化可以實現利用2個多重PCR體系擴增8個耐藥基因，擴增體系見表2。PCR擴增條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個循環(huán)，72 ℃ 5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳顯示，8個條帶對應基因大小與預期一致(圖1)。

3. 測序結果：將8個條帶切膠測序，測序序列與結核分枝桿菌標準菌株H37Rv相應基因逐一進行比對，結果證明擴增序列是預期的8個耐藥基因序列。以katG基因測序結果為例，比對結果證明擴增條帶為katG基因，并且該菌株在第1355堿基位置由堿基T突變?yōu)镃(圖2)。

表2 結核分枝桿菌耐藥基因擴增多重PCR體系

注 管A包含5對基因引物：embB、katG、rrs、rpoB和inhA；管B包含3對基因引物：eis、gyrA和rpsL。a：指管A中5條上游引物各0.8 μl；b：指管A中5條下游引物各0.8 μl；c：指管B中3條上游引物各0.8 μl；d：指管B中3條下游引物各0.8 μl

1～4為4個結核分枝桿菌臨床分離株DNA樣本；M為DNA分子量標準，條帶從大至小分別為2000、1000、750、500、250和100 bp。A圖為A管擴增產物電泳圖，5個條帶從大到小分別為embB、katG、rrs、rpoB和inhA；B圖為B管擴增產物電泳圖，3個條帶從大到小分別為eis、gyrA和rpsL圖1 PCR產物2%瓊脂糖凝膠電泳圖

4. 多重PCR體系擴增臨床分離株DNA的成功率：提取47株結核分枝桿菌臨床分離株DNA，以菌株DNA為模板，采用已建立的多重PCR體系進行擴增，結果47株的8個條帶全部成功擴增(圖3)，擴增成功率為100.0%。

5. 多重PCR體系擴增痰菌DNA的成功率：提取21例痰涂片染色陽性的患者痰菌DNA，以其為模板，采用已建立的多重PCR體系進行擴增，結果有16例痰樣本提取的DNA 8個條帶全部成功擴增(圖4)，擴增成功率為76.2%。另外3例痰樣本提取的DNA僅擴增出了部分條帶，2例痰樣本提取的DNA無任何條帶擴增。

圖2 katG基因PCR產物測序結果與基因序列比對結果

1～47為結核分枝桿菌臨床分離株DNA樣本；A代表A管，包含5對基因擴增引物(embB、katG、rrs、rpoB和inhA)；B代表B管，包含3對基因擴增引物(eis、gyrA和rpsL)； M為DNA分子量標準，條帶從大至小分別為2000、1000、750、500、250和100 bp；(-)為陰性對照圖3 以臨床分離株DNA為模板的PCR產物2%瓊脂糖凝膠電泳圖

1～21為痰樣本提取的DNA；A代表A管，包含5對基因擴增引物(embB、katG、rrs、rpoB和inhA)；B代表B管，包含3對基因擴增引物(eis、gyrA和rpsL)；M為DNA分子量標準，條帶從大至小分別為2000、1000、750、500、250和100 bp；(-)為陰性對照圖4 以痰菌DNA為模板的PCR產物2%瓊脂糖凝膠電泳圖

討 論

本研究針對目前結核病治療最常用的一線口服抗結核藥物(異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺)、注射類抗結核藥物(鏈霉素、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素)和氟喹諾酮類藥物，檢索文獻、選取較確切的8個耐藥基因，合成引物，擴增包含常見突變位點的基因片段。其中rpoB基因涉及利福平耐藥，本實驗擴增片段包含1123～1531區(qū)域內突變位點；katG基因和inhA啟動子區(qū)涉及異煙肼耐藥。本實驗擴增片段包含katG基因438～1072區(qū)域和mabA-inhA啟動子區(qū)常見突變位點，但inhA結構基因本身突變涉及異煙肼耐藥所占比例較少[13-14]，本研究暫不考慮；embB基因涉及乙胺丁醇耐藥，擴增片段包含852～1962區(qū)域內突變位點；rpsL基因涉及鏈霉素耐藥，擴增片段包含目前發(fā)現的全部突變位點。rrs基因涉及鏈霉素、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素耐藥，擴增片段包含1158位點后的所有突變位點；eis基因涉及卡那霉素耐藥，擴增片段包含該基因啟動子區(qū)內突變位點；gyrA基因涉及氟喹諾酮類藥物耐藥，擴增片段包含-29～394區(qū)域內突變位點。另外，pncA基因突變是吡嗪酰胺耐藥的主要機制(約85%吡嗪酰胺耐藥菌株存在pncA突變)，但其突變位點繁多且分散，幾乎涵蓋整個基因，有的表型耐藥和基因型耐藥存在不一致[4,15-17]。研究發(fā)現，ahpC啟動子區(qū)涉及異煙肼耐藥，但也有研究認為其更像是因過氧化氫酶和(或)過氧化物酶活性缺失而引起的補償性突變，并不是引起異煙肼耐藥的原因[18]。本研究暫不納入這些基因。具體耐藥基因突變位點可參見數據庫網站https://tbdreamdb.ki.se/Info/。

筆者采用2個多重PCR體系擴增8個包含常見突變位點的結核分枝桿菌耐藥基因，以臨床分離株提取的DNA為模板時成功率為100.0%，以肺結核患者痰樣本提取的DNA為模板時成功率為76.2%。分析后者成功率低的原因，第一有可能是痰樣本提取的結核分枝桿菌DNA含量相對較少，以宿主DNA為主，對擴增過程有干擾；更主要的原因可能是痰樣本含菌量不同，提取出的細菌DNA含量存在差異，含量低的樣本有可能擴增陰性。盡管本研究提取的痰樣本均來自于痰涂片抗酸染色陽性的患者，但可能因為痰液黏稠、細菌在痰液中分布不均，部分提取的痰液含菌量較少，使得擴增未能成功。因此，采取措施提高痰菌量，如1例患者提取多個痰樣本DNA，同時進一步優(yōu)化痰樣本結核分枝桿菌DNA的提取方法，如優(yōu)化裂解液，增加研磨時間，以提高破菌效率、提高細菌DNA含量，均有可能會大大提高多重PCR擴增的成功率。

另外，雖然多重PCR能夠同時擴增目的基因的數量在理論上沒有限制，但實踐中常常因為多對引物同時存在，容易產生非特異性擴增、擴增效率不同、擴增結果判讀困難等原因而受到限制。因而在設計引物時要綜合考慮引物的特異性、長度、退火溫度等因素，并通過調整鎂離子濃度、引物濃度等優(yōu)化反應體系，以最終獲得靶基因片段的有效擴增[19]。本研究也曾嘗試將8對引物放在1個多重PCR體系擴增，但干擾明顯，多數樣本無法實現對所有目的基因的有效擴增，還需進一步調整和優(yōu)化。

總之，本研究成功實現了利用2個多重PCR體系擴增8個結核分枝桿菌耐藥基因，擴增基因包含常見的耐藥突變位點，研究結果可為進一步應用測序、芯片雜交等技術確定突變形式奠定基礎，這對研發(fā)相關診斷產品，快速預測耐藥類型、正確選擇抗結核藥物進行治療、控制耐藥結核病疫情具有重要意義。

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(本文編輯：薛愛華)

Establishment and evaluation of the multiplex PCR systems for amplifyingMycobacteriumtuberculosisgenes involved in drug resistance

LIZi-hui,PANLi-ping,SUNQi,LYüLing-na,DUBo-ping,ZHANGHong-jing,SUNZhao-gang,ZHANGZong-de.

BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute,BeijingKeyLaboratoryforDrugResistantTuberculosisResearch,Beijing101149,China

ZHANGZong-de,Email:zzd417@163.com；SUNZhao-gang，Email：sunzg75@163.com

Objective To establish multiplex PCR systems for amplifyingMycobacteriumtuberculosisgenes involved in drug resistance and evaluate the success rates of amplification using DNA templates from clinical isolates and sputum samples of pulmonary tuberculosis patients. Methods DNA was routinely extracted from 47M.tuberculosisclinical isolates and 21 sputum samples of smear positive pulmonary tuberculosis patients. Primers for amplifying genes involved in drug resistance were designed and synthesized, and 2 multiplex PCR systems were established. The amplified fragments were confirmed by sequencing, and the success rates of amplification by multiplex PCR were analyzed. Results We selected 8 gene sequences includingrpoB,katG,inhA,embB,gyrA,rpsL,rrsandeis, which were involved in resistance to 8 commonly used anti-tuberculosis drugs. Two multiplex PCR systems were established to amplify 8 sequences, and the success rates of amplification were 100.0% (47/47) for DNA from 47 clinical isolates and 76.2% (16/21) for DNA from 21 sputum samples of smear positive pulmonary tuberculosis patients. Conclusion Two multiplex PCR systems are established for amplifying eightM.tuberculosisgene sequences involved in resistance to anti-tuberculosis drugs used in clinical practice. The result has important value for developing new genotypic tests to diagnose drug-resistant tuberculosis.

Tuberculosis, multidrug-resistant； Polymerase chain reaction； Genetic testing； Nucleic acid amplification techniques； Technology assessment, biomedical

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.002

“十二五”國家科技重大專項(2015ZX10004801-003)；重大傳染病防治協同創(chuàng)新中心項目(PXM2016_014226_000052)；北京市自然科學基金(7164245)；北京市科技新星計劃(Z161100004916080)；北京市醫(yī)院管理局“青苗”計劃專項(QML20151501)

101149 首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院 北京市結核病胸部腫瘤研究所 耐藥結核病研究北京市重點實驗室

張宗德，Email：zzd417@163.com；孫照剛，Email：sunzg75@163.com

2017-06-30)