民族藥刺齒鳳尾蕨抑制人源結腸癌細胞活性成分研究

孫丹++++++張艷++++++孫強++++++彭玉勃++++++王磊

[摘要] 目的 研究民族藥刺齒鳳尾蕨抑制人源結腸癌細胞活性成分。 方法 采用95%乙醇提取藥材，聚酰胺色譜、葡聚糖凝膠色譜以及制備型高效液相色譜等技術獲取化合物，磁共振波譜技術（NMR）對得到的化合物進行結構鑒定。磺酰羅丹明B比色法（SRB）對化合物進行體外抗腫瘤活性篩選。 結果 從刺齒鳳尾蕨中分離得到5個二萜類化合物，分別鑒定為geopyxin A（1），geopyxin C（2），ent-11β-acetoxykaur-16-en-18-ol（3），7β，16α，17-trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid（4）和neolaxiflorin K（5）。活性篩選表明化合物1，2和5具有顯著的抑制人源結腸癌細胞活性，IC50值分別為1.20、2.45和3.26 μmol/L。 結論 化合物1～5首次從刺齒鳳尾蕨中分離得到。

[關鍵詞] 刺齒鳳尾蕨；化學成分；體外抗腫瘤活性

[中圖分類號] R927 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）06（a）-0020-04

Study on chemical constituents and their inhibition of anthropogenic colon cancer cells bioactivity from ethnic medicine Pteris dispar

SUN Dan ZHANG Yan SUN Qiang PENG Yubo WANG Lei

Jiamusi College， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Jiamusi 154007， China

[Abstract] Objective To study the inhibition of anthropogenic colon cancer cells activity constituents of Pteris dispar. Methods The medicinal materials were extracted by 95% ETOH. Compounds were obtained by kinds of chromatographies including polyamide， Sephadex LH-20 and pre-HPLC and the structures identified by NMR. In vitro antitumor activity was tested by SRB methods. Results 5 compounds were obtained from the plant and their structures were established as geopyxin A （1）， geopyxin C （2）， ent-11β-acetoxykaur-16-en-18-ol （3）， 7β， 16α， 17-trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid （4） and neolaxiflorin K （5）. Compounds 1， 2 and 5 showed strong in vitro antitumor activity against HCT-116， with IC50 values of 1.20， 2.45 and 3.26 μmol/L respectively. Conclusion Compounds 1-5 are obtained from Pteris dispar for the first time.

[Key words] Pteris dispar； Chemical component； In vitro antitumor activity

刺齒鳳尾蕨為鳳尾蕨科（Pteridaceae）鳳尾蕨屬藥用植物，具有清熱解毒，涼血去痰的功效[1]，該藥用植物含有鳳尾蕨屬植物特征性成分貝殼杉烷型二萜類化合物[2]，該類成分具有廣譜的抗腫瘤活性[3]。國內(nèi)外學者對該類化合物進行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)了一些化合物具有顯著抗腫瘤活性[3]。如我國天然藥物學家孫漢董院士對該類成分進行了系統(tǒng)的研究[4-8]。其中冬凌草甲素具有療效確切的抗腫瘤活性，是非常有希望成為新抗腫瘤制劑的先導化合物[9-12]。然而，刺齒鳳尾蕨作為一種富含貝殼杉烷型二萜類成分的民族藥，對其蘊含的大量二萜成分的結構和抗腫瘤活性沒有得到深入研究。本課題組從該植物中分離得到5個二萜類成分，其中3個化合物具有顯著的抗腫瘤活性。

1 儀器與試藥

Varian VNS-400磁共振儀（Varian公司，美國），TMS為內(nèi)標；Agilent 1200高效液相色譜儀（安捷倫科技公司，美國），連接DAD檢測器；Agilent 1100制備型高效液相色譜儀（安捷倫科技公司，美國），YMC C18制備型色譜柱（250 mm × 20 mm，5 μm，YMC公司，日本）；聚酰胺樹脂（60～90目，浙江臺州市路橋四甲生化塑料廠，中國）；Sephadex LH-20（25～100 μm，Pharmacia Biotek公司）；乙腈、甲醇（色譜純，F(xiàn)isher、Tedia公司，美國）；SRB（Sigma公司，美國）；人源結腸癌細胞HCT-116購自中國醫(yī)學科學院藥物研究所；Thermo熱電FC酶標儀（熱電公司，美國）。

藥材采集于云南省西雙版納地區(qū)，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學陳效忠副教授鑒定為刺齒鳳尾蕨的全草。

2 方法與結果

2.1 化合物的分離和鑒定

95%乙醇提取刺齒鳳尾蕨藥材（10.0 kg）3次，每次1 h，得到浸膏（1.0 kg）。浸膏分散于水中，分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到相應的4個萃取部位。乙酸乙酯萃取物（200.0 g）過聚酰胺樹脂柱色譜，分別用不同濃度乙醇洗脫，30%乙醇洗脫物（50.0 g）過sephadex LH-20柱色譜得到30個流份S1-S30。制備型HPLC（乙腈-水=30∶70，流速5.0 mL/min）對S10進行分離，得到化合物2（12.0 mg）和5（12.0 mg）。制備型HPLC（乙腈-水=40∶60，流速5.0 mL/min）對S11進行分離，得到化合物1（12.0 mg）和3（12.0 mg）。制備型TLC對S12（2.0 g）進行分離，得到化合物4（5.0 mg）。

化合物1白色不定型粉末。1H NMR（CDCl3，400 MHz） δ：3.52（1H，dd，J = 12.0、5.0 Hz，H-1），2.00（1H，m，H-2a），1.63（1H，m，H-2b），2.12（1H，m，H-3a），1.28（1H，m，H-3b），2.11（1H，d，J = 8.0 Hz，H-5），1.96（1H，m，H-6），3.85（1H，d，J = 2.8 Hz，H-7），2.09（1H，m，H-9），3.00（1H，m，H-11a），1.48（1H，m，H-11b），2.00（1H，m，H-12a），1.63（1H，m，H-12b），3.06（1H，d，J = 2.5 Hz，H-13），2.28（1H，m，H-14a），1.48 （1H，m，H-14b），5.96（1H，s，H-17a），5.30（1H，s，H-17b），1.21（3H，s，H-18），1.11（3H，s，H-20）；13C NMR（CDCl3，100 MHz） δ：81.9（C-1），30.2（C-2），35.3（C-3），42.8（C-4），45.0（C-5），27.0（C-6），72.2（C-7），53.4（C-8），47.3（C-9），44.5（C-10），20.8（C-11），33.0（C-12），38.3（C-13），35.4（C-14），214.8（C-15），149.4（C-16），115.6（C-17），28.5（C-18），183.6（C-19），11.5（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]基本一致，故鑒定化合物為geopyxin A，化學結構式見圖1。

化合物2白色不定型粉末。1H NMR（CDCl3，400 MHz） δ：1.84（1H，m，H-1a），0.96（1H，m，H-1b），1.70（1H，m，H-2a），1.47（1H，m，H-2b），2.16（1H，m，H-3a），1.09（1H，td，J = 13.2、4.0 Hz，H-3b），2.05（1H，m，H-5），2.03（1H，m，H-6a），1.91（1H，m，H-6b），3.93（1H，m，H-7），1.84（1H，d，J = 8.0 Hz，H-9），1.86（1H，m，H-11a），1.48（1H，m，H-11b），1.92（1H，m，H-12a），1.70（1H，mz，H-12b），3.06（1H，s，H-13），2.30（1H，m，H-14a），1.48（1H，m，H-14b），6.00（1H，s，H-17a），5.31（1H，s，H-17b），1.25（3H，s，H-18），1.03（3H，s，H-20）；13C NMR（CDCl3，100 MHz） δ：39.8（C-1），18.5（C-2），37.5（C-3），43.3（C-4），46.5（C-5），27.4（C-6），72.4（C-7），53.1（C-8），46.3（C-9），40.1（C-10），18.9（C-11），32.7（C-12），38.1（C-13），34.7（C-14），214.3（C-15），149.2（C-16），116.0（C-17），28.7（C-18），184.1（C-19），15.8（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]基本一致，故鑒定化合物為geopyxin C，化學結構式見圖2。

化合物3白色不定型粉末。1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ：1.98（1H，m，H-1a），0.95（1H，m，H-1b），1.64（1H，m，H-2a），1.55（1H，m，H-2b），1.46（1H，m，H-3a），1.29（1H，m，H-3b），1.22（1H，m，H-5），1.50（1H，m，H-6a），1.35（1H，m，H-6b），1.68（1H，m，H-7a），1.56（1H，m，H-7b），1.38（1H，m，H-9），5.08（1H，m，H-11），1.95（1H，m，H-12a），1.90（1H，m，H-12b），2.65（1H，s，H-13），2.00（1H，m，H-14a），1.18（1H，m，H-14b），2.50（1H，d，J = 16.8 Hz，H-15a），2.05（1H，m，H-15b），4.85（1H，s，H-17a），4.70（1H，s，H-17b），3.45（1H，d，J = 10.8 Hz，H-18a），3.12（1H，d，J = 10.8 Hz，H-18b），0.77（1H，s，H-19），1.03（1H，s，H-20），1.95（1H，s，11-OAc）；13C NMR（CDCl3，100 MHz） δ：39.5（C-1），17.8（C-2），35.2（C-3），37.7（C-4），49.4（C-5），19.9（C-6），40.7（C-7），43.0（C-8），62.0（C-9），38.0（C-10），69.3（C-11），39.8（C-12），42.5（C-13），39.5（C-14），48.0（C-15），155.5（C-16），103.2（C-17），72.0（C-18），17.7（C-19），18.0（C-20），170.3（11a-OAc），21.8（11b-OAc）。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]基本一致，故鑒定化合物為ent-11β-acetoxykaur-16-en-18-ol，化學結構式見圖3。

化合物4白色不定型粉末。1H NMR（MeOH，400 MHz） δ：1.88（1H，m，H-1a），0.95（1H，m，H-1b），2.00（1H，m，H-2a），1.43（1H，m，H-2b），2.18（1H，m，H-3a），1.09（1H，m，H-3b），1.77（1H，m，H-5），2.11（1H，m，H-6a），1.99（1H，m，H-6b），3.64（1H，s，H-7），1.43（1H，d，J = 7.8 Hz，H-9），1.65（1H，m，H-11a），1.58（1H，m，H-11b），1.68（1H，m，H-12a），1.59（1H，m，H-12b），2.09（1H，m，H-13），1.85（1H，d，m，H-14a），1.71（1H，m，H-14b），1.75（1H，d，J = 14.0 Hz，H-15a），1.56（1H，d，J = 14.0 Hz，H-15b），3.71（1H，d，J = 12.0 Hz，H-17a），3.65（1H，d，J = 12.0 Hz，H-17b），1.19（1H，s，H-18），1.04（1H，s，H-20）；13C NMR（MeOH，100 MHz） δ：41.7（C-1），20.4（C-2），39.3（C-3），44.3（C-4），48.1（C-5），30.4（C-6），78.0（C-7），49.1（C-8），51.1（C-9），40.5（C-10），19.2（C-11），27.7（C-12），46.2（C-13），37.5（C-14），50.2（C-15），82.8（C-16），66.8（C-17），29.2（C-18），182.5（C-19），16.1（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]基本一致，故鑒定化合物為7β，16α，17-trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid，化學結構式見圖4。

化合物5白色不定型粉末。1H NMR（Pyridine-d5，400 MHz） δ：6.26（1H，d，J = 10.5 Hz，H-2），6.72（1H，d，J = 10.5 Hz，H-3），2.38（1H，m，H-5），4.82（1H，m，H-6），2.05（1H，m，H-9），2.23（1H，m，H-11a），1.65（1H，m，H-11b），2.20（1H，m，H-12a），1.35（1H，m，H-12b），2.87（1H，m，H-13），2.56（1H，d，J = 12.5 Hz，H-14a），2.48（1H，dd，J = 12.5、4.6 Hz，H-14b），6.05（1H，s，H-17a），5.38（1H，s，H-17b），1.57（1H，s，H-18），4.09（1H，d，J = 12.0 Hz，H-19a），3.75（1H，d，J = 12.0 Hz，H-19b），5.05（1H，d，J = 9.6 Hz，H-20a），4.62（1H，d，J = 9.6 Hz，H-20b）；13C NMR（Pyridine-d5，100 MHz） δ：197.9（C-1），130.2（C-2），157.6（C-3），42.1（C-4），58.9（C-5），73.6（C-6），96.8（C-7），60.3（C-8），49.3（C-9），47.1（C-10），20.3（C-11），30.2（C-12），34.8（C-13），25.8（C-14），209.1（C-15），153.8（C-16），118.2（C-17），25.8（C-18），65.8（C-19），66.2（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]基本一致，故鑒定化合物為neolaxiflorin K，化學結構式見圖5。

2.2 體外抗腫瘤活性測試

處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞置于96孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h，設置5個不同濃度梯度（分別為1.0、5.0、25.0、75.0、125.0 μmol/L）的待測化合物，加到細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，加入SRB試劑，按照SRB方法[17]測定化合物抑制腫瘤細胞的IC50值。

以人源結腸癌細胞（HCT-116）為模型對化合物進行體外活性篩選，結果顯示化合物1～5的IC50值分別為1.20、2.45、50.2、58.9和3.26 μmol/L。

3 討論

體外抗腫瘤活性篩選表明化合物1、2和5具有顯著的抗腫瘤活性，而化合物3和4沒有抗腫瘤活性。通過比較化合物的結構特征和活關系可知化合物1、2和5具有α，β不飽和酮基團從而表現(xiàn)出抗腫瘤活性，而化合物3和4不具備上述基團從而活性消失，該結論與此類化合物的構效關系總結一致[3]，下一步工作將繼續(xù)研究本屬植物，期待發(fā)現(xiàn)活性更強的貝殼杉烷二萜類化合物。

[參考文獻]

[1] 龔先玲，茍占平，梁念慈，等.鳳尾蕨屬6種藥用植物抗腫瘤有效部位篩選[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21（7）：1599-1601.

[2] 范世錦，鄭雅元，呂應年，等.優(yōu)化刺齒鳳尾蕨抗癌二萜的超聲提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（11）：49-51.

[3] Sun HD，Huang SX，Han QB. Diterpenoids from Isodon species and their biological activities [J]. Nat Product Rep，2006， 23：673-698.

[4] Zou J，Du X，Pang G，et al. Ternifolide A，a new diterpenoid possessing a rare macrolide motif from Isodon ternifolius [J]. Organ Lett，2012，14（12）：3210-3213.

[5] Pan L，Zhou P，Zhang X，et al. Skeleton-rearranged pentacyclic diterpenoids possessing a cyclobutane ring from Euphorbia wallichii [J]. Organ Lett，2006，（13）：2775-2778.

[6] Huang SX，Xiao WL，Li LM，et al. Bisrubescensins A-C：thee new dimeric ent-kauranoids isolated from isodon rubescens [J]. Chem Inform，2006，8（28）：1157-1160.

[7] Zhang M，Zhu Y，Zhan G，et al. Micranthanone A，a new diterpene with an unprecedented carbon skeleton from rhododendron micranthum [J]. Organ Lett，2013，15（12）：3094-3097.

[8] Wang WG，Du X，Li XN，et al. New bicyclo[3.1.0]hexane unit ent-kaurane diterpene and its seco-derivative from Isodon eriocalyx var. laxiflora [J]. Organ Lett，2012，14（1）：302-305.

[9] 張典瑞，任天池.冬凌草甲素的藥學研究進展[J].中國藥學雜志，2003，38（11）：817-820.

[10] 劉晨江，趙志鴻.冬凌草的研究進展[J].中國藥學雜志，1998，33（10）：577-581.

[11] 劉洪川，金永生，陳海生.冬凌草甲素的結構修飾研究進展[J].藥學實踐雜志，2016，34（2）：114-115.

[12] 馮耀榮，陳紅淑.冬凌草甲素抗腫瘤活性研究進展[J].中國中醫(yī)藥科技，2016，23（1）：125-126.

[13] Wijeratne EM，Bashyal BP，Liu MX，et al. Geopyxins A-E，ent-kaurane diterpenoids from endolichenic fungal strains Geopyxis aff. majalis and Geopyxis sp. AZ0066：structure-activity relationships of geopyxins and their analogues [J]. J Nat Products，2012，75（3）：361-369.

[14] Dao TT，Lee KY，Jeong HM，et al. ent-Kaurane diterpenoids from Croton tonkinensis stimulate osteoblast differentiation [J]. J Nat Products，2011，74（12）：2526-2531.

[15] Nhiem NX，Hien NT，Tai BH，et al. New ent-kauranes from the fruits of Annona glabra and their inhibitory nitric oxide production in LPS-stimulated RAW264.7 mac？鄄rophages [J]. Bioorgan Med Chem Lett，2014，25（2）：254-258.

[16] Wang WG，Yang J，Wu HY，et al. ent- Kauranoids isolated from Isodon eriocalyx，var. laxiflora，and their structure activity relationship analyses [J]. Tetrahedron，2015， 71（48）：9161-9171.

[17] 黃銀久，宋寶安，金林紅，等.SRB法和MTT法抗腫瘤藥物篩選結果相關性研究[J].生物學雜志，2009，26（4）：13-16.

（收稿日期：2016-12-20 本文編輯：李亞聰）