胃泰方對(duì)功能性消化不良肝郁脾虛型大鼠一氧化氮、神經(jīng)降壓素及胃竇5-羥色胺表達(dá)的影響※

陳 婕 張津瑋 楊 巖 胡建功 李慧臻 杜 瀟 王天麟 孔祥茹

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，天津 300150)

實(shí) 驗(yàn) 研 究

胃泰方對(duì)功能性消化不良肝郁脾虛型大鼠一氧化氮、神經(jīng)降壓素及胃竇5-羥色胺表達(dá)的影響※

陳 婕 張津瑋 楊 巖 胡建功1李慧臻 杜 瀟2王天麟2孔祥茹2

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，天津 300150)

目的 通過(guò)觀察胃泰方、嗎丁啉對(duì)功能性消化不良(FD)肝郁脾虛型大鼠一氧化氮(NO)、神經(jīng)降壓素(NT)及胃竇5-羥色胺(5-HT)表達(dá)的影響，從腦—腸軸途徑探討胃泰方治療FD的作用機(jī)制。方法 將40只SD大鼠隨機(jī)分為4組，即空白組、模型對(duì)照組、嗎丁啉組、胃泰組，每組10只。以32 mm蝴蝶夾夾鼠尾后1/3處，30 min后放開，每日1次；于每周二、四、六禁食，余日給足量飼料，持續(xù)4周。造模成功后第2 d起，胃泰方組大鼠以0.9 375 g/mL胃泰方濃縮液按2 mL/kg灌胃，嗎丁啉組以0.5 mg/mL嗎丁啉混懸液10 mL/kg灌胃，空白組、模型對(duì)照組以0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg灌胃，日1次，連續(xù)28 d。檢測(cè)血清中NO、NT及胃竇5-HT的表達(dá)。結(jié)果 與空白組比較，模型對(duì)照組NO含量減少，NT含量增加，胃竇5-HT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及灰度值明顯降低(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，胃泰組、嗎丁啉組NO含量增加，NT含量降低，胃竇5-HT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及灰度值明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 胃泰方能糾正NO、NT及胃竇5-HT的異常表達(dá)，其作用與嗎丁啉基本相當(dāng)，這可能是胃泰方治療FD的關(guān)鍵所在。

消化不良；中藥療法;病理生理學(xué);血清素；代謝;一氧化氮

功能性消化不良(functional dyspepsia，F(xiàn)D)屬功能性胃腸病之一，在其發(fā)病過(guò)程中不僅胃腸道功能失調(diào)起著重要作用，而且環(huán)境、心理、社會(huì)等因素對(duì)其發(fā)病也有一定的影響，各種致病因素相互作用，共同導(dǎo)致FD的發(fā)生發(fā)展。FD具有典型的臨床癥狀，以發(fā)病時(shí)腹部有明顯和持續(xù)性的上腹部脹滿疼痛、噯氣、惡心、嘔吐、厭食、納差等，且病程較長(zhǎng)，長(zhǎng)達(dá)12周以上而未有器質(zhì)性疾病的臨床綜合征[1]。在眾多消化系統(tǒng)疾病中，F(xiàn)D在臨床中較多發(fā)生，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，消化不良患者在普通人群中患病率為19%～41%，在我國(guó)發(fā)病也占有很大比例，且發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)階段我國(guó)發(fā)病率為20%～30%[2]。隨著對(duì)FD的深入研究，眾多專家學(xué)者開始重視精神心理因素[3]，而生理-心理-社會(huì)模式以及腦—腸軸理論備受重視，成為治療FD疾病的重要手段之一。由于腦—腸軸理論近年來(lái)在功能性疾病方面有著明顯的指導(dǎo)作用，本實(shí)驗(yàn)則通過(guò)研究其作用機(jī)制，從而更好地指導(dǎo)臨床。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(250±10)g，購(gòu)自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK(京)2009-0017，置于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)，室溫(24±2)℃，濕度(55±5)%。

1.2 藥物 胃泰方由黃芩9 g、半夏12 g、黃連3 g、干姜9 g、人參(黨參)9 g、炙甘草9 g、大棗4 g、郁金10 g、青皮10 g、陳皮10 g組成，購(gòu)自天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房，按成人體質(zhì)量60 kg臨床用藥量的10倍，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院煎藥室袋煎，取全部煎煮液，于天津南開醫(yī)院藥理研究室用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮胃泰方水煎劑，終得濃縮液濃度為0.9 375 g/mL。多潘立酮(嗎丁啉)，西安楊森制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H10910003，產(chǎn)品批號(hào)：140423350，按成人60 kg體質(zhì)量臨床用藥量的10倍，由蒸餾水配制成濃度為0.5 mg/mL的混懸液備用。

1.3 造模及分組 將40只SD大鼠隨機(jī)分為4組，即空白組、模型對(duì)照組、嗎丁啉組、胃泰組，每組10只。以32 mm蝴蝶夾夾鼠尾后1/3處，30 min后放開，每日1次；于每周二、四、六禁食，余日給足量飼料，持續(xù)4周，成功復(fù)制肝郁脾虛型FD大鼠模型。造模成功后第2 d起，胃泰組以0.9 375 g/mL胃泰方濃縮液灌胃，嗎丁啉組以0.5 mg/mL嗎丁啉混懸液10 mL/kg灌胃，空白組、模型對(duì)照組以0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg灌胃，日1次，連續(xù)28 d。在進(jìn)行胃腸動(dòng)力測(cè)定的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于實(shí)驗(yàn)要求，需要用碳素墨水灌胃。然而在觀察胃竇組織形態(tài)學(xué)變化時(shí)，由于碳素墨水灌胃，從而導(dǎo)致某些SD大鼠的黏膜污染，以至于無(wú)法觀察，同時(shí)碳墨灌胃也會(huì)影響一氧化氮(NO)、神經(jīng)降壓素(NT)的檢測(cè)，故最終每組有6只SD大鼠進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。

1.4 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1 NO、NT 實(shí)驗(yàn)第28 d禁食12 h后，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，收集于空白的采血管中，靜置30 min，4 ℃ 3 000 r/min離心，20 min，取上清，為血清，供NO、NT檢測(cè)。

1.4.2 胃竇組織形態(tài)學(xué)變化 各組大鼠在造模結(jié)束后及給藥干預(yù)結(jié)束后第2 d，用30%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，采用中性甲醛，以內(nèi)固定的方法固定全胃，梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察胃病理學(xué)變化。在光學(xué)顯微鏡下，每張切片在400倍鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野，用Image Pro Plus 5.0.2圖像分析軟件測(cè)定各組切片中抗體呈陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)、累計(jì)光密度(integrated optical density,IOD)進(jìn)行半定量分析，IOD值代表組織染色強(qiáng)度，IOD值越大，代表染色越強(qiáng)。灰度值可反映5-羥色胺(5-HT)蛋白陽(yáng)性神經(jīng)元染色深淺，灰度值越高，染色越淺，5-HT蛋白含量越低，表達(dá)越少。

2 結(jié) 果

2.1 各組給藥后大鼠NO含量比較 見表1。

表1 各組給藥后大鼠NO含量比較

與空白組比較，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，△P<0.05

由表1可見，給藥干預(yù)28 d后，與空白組比較，模型對(duì)照組NO含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，胃泰方組、嗎丁啉組NO含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；嗎丁啉組與胃泰方組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組給藥后NT含量比較 見表2。

表2 各組給藥后NT含量比較

與空白組比較，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，△P<0.05

由表2可見，給藥干預(yù)28 d后，與空白組比較，模型對(duì)照組NT含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，胃泰方組、嗎丁啉組NT含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；嗎丁啉組與胃泰方組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組大鼠胃竇5-HT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 見表3。

表3 各組大鼠胃竇5-HT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 個(gè)/視野

與空白組比較，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，△P<0.05

由表3可見，與空白組比較，模型對(duì)照組胃竇5-HT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，胃泰方組、嗎丁啉組胃竇5-HT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 各組大鼠胃竇5-HT免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 空白組模型胃竇明顯，可見胞漿呈棕褐色的5-HT陽(yáng)性細(xì)胞，染色較強(qiáng)。與空白組比較，模型對(duì)照組胃竇胞漿呈棕褐色的5-HT陽(yáng)性細(xì)胞較少，染色較弱，與模型對(duì)照組比較，嗎丁啉組及胃泰方組胃竇胞漿呈棕褐色的5-HT陽(yáng)性細(xì)胞無(wú)明顯差別，染色相近。見圖1。

圖1 各組大鼠胃竇5-HT免疫組織化學(xué)染色(×400)A、空白組；B、模型對(duì)照組；C、嗎丁啉組；4、胃泰方組

2.5 各組大鼠胃竇5-HT表達(dá)(灰度值)比較 見表4。

表4 各組大鼠胃竇5-HT表達(dá)(灰度值)比較

與空白組比較，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，△P<0.05

由表4可見，與空白組比較，模型對(duì)照組胃竇5-HT灰度值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，胃泰方組、嗎丁啉組胃竇5-HT灰度值增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

FD在中醫(yī)學(xué)中沒(méi)有明確的病名。根據(jù)病因、病機(jī)、病變所及臟腑和病性的不同，可歸屬于“胃脘痛”“痞滿”“嘈雜”等范。許多古典醫(yī)籍對(duì)其皆有記載，如《素問(wèn)·至真要大論》曰“諸嘔吐酸，皆屬于熱”[4]。FD雖然病位在胃、腸，但其發(fā)病與五臟相關(guān)，其中與肝、脾尤為密切。張照蘭教授在對(duì)FD論述中提出“飲食水谷入腸胃，賴肝木之疏泄，肝氣機(jī)調(diào)暢，木氣得疏，則脾胃調(diào)和[5]。正如《臨證指南醫(yī)案》曰“脾宜升則健，胃宜降則和”[6]。二者一臟一腑，受納腐熟運(yùn)化水谷，同為人之“倉(cāng)廩之官”。一旦出現(xiàn)肝木過(guò)旺或脾土虛弱，克伐脾土太過(guò)，則“肝木乘土”或“土虛木乘”的病理變化隨即發(fā)生，如《醫(yī)學(xué)求是》曰“木郁不達(dá)，風(fēng)木沖擊而賊脾土，則痛于臍下”[7]。《素問(wèn)·舉痛論》曰“思則心有所存，神有所歸，正氣留而不行，故氣結(jié)矣”[4]。即是指情志失調(diào)，氣機(jī)不利導(dǎo)致痞滿。孫志杰等[8]認(rèn)為FD病機(jī)以脾虛為本，食積、氣滯、痰濕為標(biāo)，本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜。氣機(jī)不暢為本病病機(jī)特點(diǎn)，肝郁脾虛是基本病機(jī)。蘇干伸等[9]認(rèn)為脾虛氣滯是FD的病機(jī)關(guān)鍵，氣機(jī)不暢是病機(jī)特點(diǎn)，而飲食和情緒是主要誘發(fā)因素。近年中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)消化專業(yè)委員會(huì)將FD分為脾虛氣滯、肝胃不和、飲食停滯、痰濕中阻、脾胃濕熱、寒熱錯(cuò)雜、胃陰不足、脾胃虛寒8種類型[10]。

FD的病機(jī)與肝、脾密切相關(guān)，肝郁脾虛為胃腸功能紊亂的病理本質(zhì)，用葉天士的“肝為起病之源，胃為傳病之所”來(lái)概括FD的發(fā)病部位，認(rèn)為FD病變部位在胃，與肝密切相關(guān)，并強(qiáng)調(diào)此處胃當(dāng)理解為脾胃之功能，肝、脾、胃同居中焦，三者功能失調(diào)可致氣機(jī)壅滯，升降失職，出現(xiàn)水谷不腐之痞滿證。

FD是指具有胃和十二指腸功能紊亂引起的癥狀，經(jīng)檢查排除引起這些癥狀的器質(zhì)性疾病的一組臨床綜合征[11]。FD的發(fā)生與胃腸運(yùn)動(dòng)功能型障礙、內(nèi)臟敏感性異常、胃酸分泌的改變、幽門螺桿菌(Hp)感染、胃腸激素的改變、心理障礙及腦—腸軸功能障礙等具有相關(guān)性。腦—腸軸理論近年來(lái)在功能性疾病方面有著明顯的指導(dǎo)作用，其作用機(jī)制則是將認(rèn)知和情感中樞與神經(jīng)內(nèi)分泌、腸神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)相聯(lián)系的雙向交通通路，其一方面通過(guò)刺激和將內(nèi)在信息通過(guò)腸神經(jīng)鏈與高級(jí)神經(jīng)中樞相連接影響胃腸感覺、動(dòng)力和分泌等，另一方面通過(guò)親內(nèi)臟作用，同時(shí)又反過(guò)來(lái)作用于中樞的痛感、情緒和行為，即胃腸癥狀對(duì)心理狀態(tài)有反作用[11]。

半夏瀉心湯出自張仲景所撰《傷寒論》，由半夏、干姜、黃芩、黃連、人參、大棗、炙甘草7味藥組成。方中半夏、干姜為君，半夏辛散開結(jié)，兼和胃降逆，干姜味辛性溫，合半夏行氣以散痞結(jié)，二者合用，共達(dá)暢通氣機(jī)、散結(jié)開痞之功；黃連、黃芩相須為輔，二者皆味苦性寒，具有清熱燥濕之功，取其味苦趨下，以助胃氣通降，又可兼制干姜、半夏之溫燥；人參、甘草、大棗三者皆味甘性溫，共為佐使，甘緩調(diào)中，扶正補(bǔ)虛，顧護(hù)胃氣。《傷寒論》原文中此方本為少陽(yáng)誤下成痞或癥見嘔而腸鳴之心下痞所設(shè)，因其配伍精當(dāng)，療效顯著，故后世廣泛應(yīng)用于各種消化道及其他疾病的治療[12]。胃泰方為半夏瀉心湯加青皮、陳皮、郁金而成，使其加強(qiáng)疏肝健脾的作用，切中FD肝郁脾虛的基本病機(jī)。

半夏瀉心湯廣泛應(yīng)用于胃痞病患者，根據(jù)癥狀胃痞相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的FD，雖然其療效顯著，但具體機(jī)制仍不明確。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)腦—腸軸在FD的發(fā)病中起到重要作用，且眾學(xué)者散在的研究也表明半夏瀉心湯對(duì)腦—腸軸相關(guān)腦腸肽具有一定的調(diào)節(jié)作用。張?jiān)降萚13]發(fā)現(xiàn)半夏瀉心湯可通過(guò)對(duì)胃泌素、血管活性肽的調(diào)節(jié)，抑制化療后胃腸道反應(yīng)。馮云霞等[14]發(fā)現(xiàn)半夏瀉心湯及其類方調(diào)中顆粒可通過(guò)對(duì)一氧化氮合酶(NOS)、腸血管活血肽(VIP)及P物質(zhì)(SP)含量的影響，進(jìn)而調(diào)節(jié)氣機(jī)升降和胃腸運(yùn)動(dòng)。李彩榮等[15]認(rèn)為胃腸動(dòng)力減弱、排空障礙等與膽囊收縮素(CCK)的升高相關(guān)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)半夏瀉心湯可通過(guò)降低CCK來(lái)達(dá)到治療慢性胃炎的目的。李志強(qiáng)等[16]通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)半夏瀉心湯具有明顯抗抑郁作用。

胃腸道黏膜嗜鉻細(xì)胞(EC)可分泌5-HT，其在人體生理調(diào)控過(guò)程中具有調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動(dòng)、情感認(rèn)知、睡眠飲食等多種功能。其常存在于胃、十二指腸，在其分泌過(guò)程中，以旁分泌為主，約占其分泌總量的90%。NT可明顯增強(qiáng)小腸的逆蠕動(dòng)，然其總體來(lái)說(shuō)則起著抑制胃腸蠕動(dòng)的作用。NO可調(diào)節(jié)胃腸道容受性舒張功能，因此NO合成及釋放減少，最終將導(dǎo)致FD患者早飽或餐后飽脹感。

本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究以FD大鼠為研究對(duì)象，在成功造模后，通過(guò)酶聯(lián)免疫、免疫組化法等方法檢測(cè)血清中NO、NT含量和胃竇組織5-HT的表達(dá)在胃泰方治療前后變化，結(jié)果表明，胃泰方能使血清NO含量增加，NT含量降低，胃竇組織5-HT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及灰度值明顯增加，其作用與嗎丁啉基本相當(dāng)，糾正異常的腦腸肽的作用可能是胃泰方治療FD的關(guān)鍵所在。

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(本文編輯：董軍杰)

Effects of Weitai prescription on expression of nitric oxide, neurodetensin and antrum 5-HT in functional dyspepsia rats with liver depression and spleen deficiency type

CHENJie,ZHANGJinwei,YANGYan,etal.

DepartmentofGastroenterology,theSecondHospitalAffiliatedtoTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300150

Objective To observe the effects of Weitai prescription and domperidone on expression of nitric oxide (NO), neurodetensin (NT) and antrum 5-hydroxytryptamine (5-HT) in functional dyspepsia (FD) rats with liver depression and spleen deficiency type, and explore the mechanism of Weitai prescription on treatment of FD from brain - gut axis way. Methods SD rats were randomly divided into blank group, model group, domperidone group and Weitai group,10 rats in each group. The 1/3 after rat tali were folder by 32 mm butterfly clamps for 30 min, one time per day. The rats were fasting at Tuesday, Thursday, Saturday, given enough feed in the other days for 4 weeks. The rats in Weitai group were treated with 0.9 375 g/mL Weitai prescription concentrate by 2 mL/kg gavage after 2ndd successful modeling. The domperidone group was treated with 0.5 mg/mL domperidone suspension by 10 mL/kg gavage, blank control group and model group were treat with 0.9% sodium chloride injection by 10 mL/kg gavage, once a day for 28 d. The expression of NO, NT and antrum 5-HT were detected. Results Compared with the blank group, the NO content in the model group was decreased, the NT content was increased, and the number of antrum 5-HT positive cells and the gray value were significantly decreased (P<0.05).Compared with the model group, the NO content in Weitai group and domperidone group were increased,the NT content were decreased, and the number of antrum 5-HT positive cells and the gray value were significantly increased,with statistical differences(P<0.05). Conclusion Weitai prescription can correct the abnormal expression of NO, NT and antrum 5-HT, its actions are similar to that of domperidone, which may be the key of Weitai prescription on treatment of FD.

Dyspepsia; TCM therapy; Pathophysiology; Serotonin; Metabolism; Nitric oxide

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.07.026

※ 項(xiàng)目來(lái)源：天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合科研課題(編號(hào)：13099)

1 天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，天津 300150

2 天津中醫(yī)藥大學(xué)2013級(jí)碩士研究生，天津 300193

陳婕(1970—)，女，主任醫(yī)師，博士研究生在讀，碩士研究生導(dǎo)師。研究方向：脾、胃、肝、膽疾病的中西醫(yī)診療。

R-332;R345.44

A

1002-2619(2017)07-1064-05

2016-11-03)