子宮內膜異位癥患者子宮內膜HIF-1α、CD34、CD54的表達及相互關系※

賈云波 杜惠蘭 姚穎玉 宮學華

(河北省廊坊衛生職業學院中醫教研室，河北 廊坊 065001)

子宮內膜異位癥患者子宮內膜HIF-1α、CD34、CD54的表達及相互關系※

賈云波 杜惠蘭△姚穎玉1宮學華2

(河北省廊坊衛生職業學院中醫教研室，河北 廊坊 065001)

目的 觀察缺氧誘導因子1α(HIF-1α)、CD34、CD54與子宮內膜異位癥(EMS)發生的關系，以期探討EMS的發病機制。方法 選取26例EMS手術患者，所有病例均經腹腔鏡或開腹手術確診，經病理證實為腹膜型EMS 8例，卵巢子宮內膜異位囊腫9例，子宮腺肌癥9例，同期選取子宮肌瘤手術患者6例為對照組，應用免疫組織化學法(SP)測定2組子宮內膜組織中HIF-1α、CD34、CD54的表達。結果 HIF-1α、CD34、CD54在腹膜型EMS組、卵巢子宮內膜異位囊腫組、子宮腺肌癥組的表達均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。HIF-1α與CD34、CD54的表達呈正相關。結論 HIF-1α可能在EMS異位病灶形成中起重要作用，推測內異癥的發生與局部病灶缺氧有關。且HIF-1α與CD34的表達呈正相關，提示HIF-1α可以促進內異癥組織血管生成；HIF-1α與CD54的表達呈正相關，推測HIF-1α可加強異位內膜細胞的黏附作用，從而有利于形成異位灶。

子宮內膜異位癥；缺氧誘導因子1,α亞基；抗原,CD34；胞間黏附分子1

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMS)是育齡期婦女常見病，臨床表現為不孕、性交痛、慢性盆腔痛、痛經等，嚴重影響患者的身心健康[1]。該病的發病機制至今尚未完全闡明。EMS有3種病變形式：腹膜型EMS、卵巢子宮內膜異位囊腫、子宮腺肌癥。EMS雖是良性病變，但有惡性生物學行為，乏氧是惡性腫瘤發展過程中的普遍現象。缺氧誘導因子1α(HIF-1α)是乏氧的重要代表因子[2]，在EMS中異位的子宮內膜碎片由于缺乏相應的血管供應，面臨缺血、缺氧環境[3]，本研究通過研究乏氧與EMS血管生成、黏附機制的關系，為EMS的發病機制提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

1.1.1 診斷標準 符合中華醫學會婦產科學分會子宮內膜異位癥協作組制訂的《子宮內膜異位癥的診治指南》[4]。

1.1.2 納入標準 ①符合上述診斷標準；②B超檢查結果支持，伴有周期性疼痛性交痛以及不孕等臨床癥狀；③經醫學倫理會審核通過，獲知情同意，自愿參與研究。

1.1.3 排除標準 ①合并盆腔、子宮及其附件慢性炎性疾病；②子宮發育不良或存在惡性病變，如子宮肌瘤、子宮腺肌瘤等。

1.2 一般資料 全部32例均為河北醫科大學第二醫院(11例)、石家莊市第六醫院(11例)、河北省中醫院(10例)2012-10—2015-12行婦科手術的住院患者，研究組26例為婦科手術治療的EMS患者，術后經病理證實為腹膜型EMS 8例，卵巢子宮內膜異位囊腫9例，子宮腺肌癥9例；年齡27～48歲，平均(38.83±5.16)歲。對照組選擇同期住院的子宮肌瘤患者6例，術后經病理證實為正常子宮內膜，年齡35～47歲，平均(40.63±3.23)歲。全部患者均知情同意，2組年齡分布均衡，比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 儀器與試劑 HIF-1α兔抗人多克隆抗體為濃縮型工作液(工作濃度1∶100)；CD34鼠抗IgG多克隆抗體、CD54鼠抗IgG多克隆抗體，均購自武漢博士德生物工程有限公司；Nikon尼康光鏡顯微照相機；LEICA RM2125石蠟切片機。

1.3.2 取材方法 組織取材：手術取分泌期內膜異位癥患者異位內膜組織、卵巢子宮內膜異位囊腫囊壁、子宮腺肌癥組織5～6 mm大小；對照組取分泌期行手術子宮肌瘤患者的正常子宮內膜組織5 mm大小，立即浸入4%的多聚甲醛固定液中，石蠟包埋，4 μm連續切片做蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.3.3 HIF-1α、CD34、CD54表達 采用免疫組織化學法(SP)測定，免疫組化主要步驟如下：切片常規脫蠟至水；0.01 M磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，每次5 min；0.3%甲醇-過氧化氫室溫下孵育20 min；蒸餾水清洗3次，每次5 min；0.1 M枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)微波爐內修復，98 ℃維持20 min；冷卻至室溫；10%山羊血清，37 ℃溫箱濕盒內孵育30 min；濾紙吸去多余血清，加入一抗(稀釋1∶100)；0.01 M PBS清洗3次，每次5 min；滴加生物素化二抗(山羊抗兔)工作液，37 ℃溫箱濕盒內孵育30 min；0.01 M PBS清洗3次，每次5 min；滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃溫箱濕盒內孵育30 min；0.01 M PBS清洗3次，每次5 min；二氨基聯苯胺(DAB)顯色2～5 min；自來水充分沖洗，終止顯色；梯度酒精脫水：70%、80%、90%酒精5 min，95%酒精10 min，100%酒精Ⅰ、Ⅱ各15 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各15 min透明；中性樹膠封固，陰性對照用PBS替代一抗；HIF-1α、CD34、CD54均以胞漿、胞核內黃色細顆粒為陽性結果。

1.3.4 陽性細胞圖像分析 所有標本均在Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統內，在相同的放大倍數下，每個切片計數10個視野，分析各指標的表達情況，以指征陽性信號的表達強度。HIF-1α、CD54結果的測定是以灰度值表示,值越低,表達含量越高；CD34的表達以平均光密度值(入射光/出射光，取對數)表示，值越高，含量越高。

1.4 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計處理，采用成組資料的方差分析；兩變量相關關系用直線相關分析，以Spearman相關系數表示,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組子宮內膜HIF-1α、CD34、CD54表達情況 見表1。

由表1可見，HIF-1α、CD34、CD54在腹膜型EMS組、卵巢子宮內膜異位囊腫組、子宮腺肌癥組的表達均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 HIF-1α在各組內膜組織中的表達 HIF-1α陽性表達呈棕黃色顆粒，主要定位于腺體胞漿或胞核中，HIF-1α在腹膜型EMS組、卵巢巧克力囊腫組及子宮腺肌癥組異位內膜及間質中均有表達，HIF-1α在以上3組的表達均高于對照組。見圖1。

表1 各組子宮內膜HIF-1α、CD34、CD54表達情況

與對照組比較，*P<0.05

對照組 卵巢子宮內膜異位囊腫組 子宮腺肌癥組 腹膜型EMS組
圖1 HIF-1α在各組的表達(×400)

2.2 CD34在各組內膜組織中的表達 CD34的陽性表達在新生血管內皮細胞的胞漿中，對照組新生血管少，在卵巢子宮內膜異位囊腫組、子宮腺肌癥組、腹膜型EMS組新生血管多，CD34在以上3組的表達均高于對照組。見圖2。

對照組 卵巢子宮內膜異位囊腫組 子宮腺肌癥組 腹膜型EMS組
圖2 CD34在各組的表達(×200)

2.3 CD54在各組內膜組織中的表達 CD54陽性表達在腺體細胞胞漿中,對照組陰性表達。子宮腺肌癥組表達呈弱陽性，卵巢子宮內膜異位囊腫組及腹膜型EMS組除在腺體表達外,在血管內皮細胞中也有表達,CD54在以上3組的表達均高于對照組。見圖3。

對照組 卵巢子宮內膜異位囊腫組 子宮腺肌癥組 腹膜型EMS組
圖3 CD54在各組的表達(×400)

2.4 兩變量相關 用直線相關分析，以Spearman相關系數表示,結果示:HIF-1α與CD34的表達呈正相關(r=0.873)、P=0.01(雙側)；HIF-1α與CD54的表達呈正相關(r=0.857)、P=0.01(雙側)。

3 討 論

EMS為育齡期婦女常見病，其病因尚不完全清楚。EMS雖是一種良性病變，但有惡性腫瘤的生物學特征，其發病機制至今仍存在爭議。異位灶形成有3個步驟：黏附、侵襲、血管生成[5]，異位內膜必須持續存活足夠長的時間才能完成該過程，在此過程的早期，細胞必然處于一個缺血、缺氧的環境。Sharkey等[6]體外研究證實低氧可作為獨立的因素調節血管內皮生長因子(VEGF)的產生。Smith SK[7]也認為月經期脫落的子宮內膜本身處于缺氧狀態。

研究證實HIF-1α在維持腫瘤細胞的能量代謝、新生血管形成、細胞增殖等方面起重要作用[8]。在腫瘤發生早期可發生HIF-1α的過度表達，且與腫瘤血管形成、侵襲轉移有關[9]。HIF-1α在EMS的形成和發展中是否起到一定作用，值得我們探索。HIF-1α是機體處于缺氧狀態的惟一調控因子，調控參與血管生成的各種因子，可促進EMS異位內膜的生長[10]。缺氧使HIF-1α表達增強，激活一系列靶基因的轉錄，使細胞獲得對組織低氧和營養物質供應減少的適應能力，維持細胞的生存與增殖[11]。Sharkey等[6]提出缺氧條件下促進大量新生血管的形成可能是EMS的發病機制之一。有研究發現，在EMS患者在位子宮內膜組織中，HIF-1α的表達較正常子宮內膜升高，在微觀上已具有與正常內膜不同的生物學特性，此結果符合“在位內膜決定論”[12]。近年來大量研究發現EMS與血管生成關系密切[13]，從而提出一個新的病因學說：血管形成學說。

CD34抗體最常用來標記腫瘤血管內皮細胞，新近國內外報道顯示，以CD34標記血管內皮細胞的特異性最強[14]。Donnez等[15]認為EMS紅色病變中血管生成及有絲分裂活性最高，表明在異位灶形成早期組織內新生血管更豐富，有利于病灶浸潤、發展。本研究結果顯示，CD34在腹膜型EMS組、卵巢子宮內膜異位囊腫組及子宮腺肌癥組的表達均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

CD54參與細胞的生長移行、腫瘤的轉移浸潤、血管生成等一系列的生理、病理過程[16]，可作為EMS黏附機制的代表因子。黏附分子的高表達均有助于異位組織逃避機體免疫系統和自然殺傷細胞的殺傷，對異位組織侵入腹膜、卵巢等起促進作用[17]。本研究結果顯示，CD54在腹膜型EMS組、卵巢子宮內膜異位囊腫組及子宮腺肌癥組的表達均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

綜上所述，本研究EMS患者子宮內膜組織HIF-1α高于正常子宮內膜組，提示EMS的形成可能與乏氧關系密切。HIF-1α與CD34的表達呈正相關，提示HIF-1α可以促進EMS組織血管生成；HIF-1α與CD54的表達呈正相關，推測HIF-1α可加強異位內膜細胞的黏附作用，從而有利于形成異位灶。

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(本文編輯：李珊珊)

The expression and correlation of HIF-1α, CD34 and CD54 in endometrium of patients with endometriosis

JIAYunbo*,DUHuilan,YAOYingyu,etal.

*DepartmentofTeachingandResearchofTraditionalChineseMedicine,LangfangHealthVocationalCollegeinHebeiProvince,Hebei,Langfang065001

Objective To observe the relationship between hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1α), CD34, CD54 and endometriosis (EMS), in order to explore the pathogenesis of EMS.Methods 26 EMS surgery patients were selected, all cases were diagnosed by laparoscopy or laparotomy. Confirmed by pathology, 8 cases were peritoneal EMS, 9 cases were ovarian endometriosis cyst and 9 cases were adenomyosis. Six patients with uterine fibroids surgery were selected as control group at the same time. The expression of HIF-1α, CD34, CD54 in endometrial tissues were detected by streptavidin-perosidase (SP) in two groups. Results The expression of HIF-1α, CD34, CD54 in peritoneal EMS group, ovarian endometriosis cyst group and adenomyosis group was higher than that in control group, with statistical difference (P<0.05). HIF-1α was positively correlated with the expression of CD34 and CD54. Conclusion HIF-1α may play an important role in the formation of EMS ectopic lesions,speculating that the occurrence of endometriosis related to hypoxia in local lesions. Moreover, HIF-1α was positively correlated with the expression of CD34 suggesting that HIF-1α can promote angiogenesis in EMS tissue. HIF-1α was positively correlated with the expression of CD54 suggesting that HIF-1α can enhance the adhesion of ectopic endometrial cells, thus which is conducive to the formation of ectopic lesions.

Endometriosis; Hypoxia-inducible factor 1, alpha subunit; Antigen, CD34; Intercellular adhesion molecule 1

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.07.008

※ 項目來源：河北省科學技術廳科技計劃項目(編號：132777155)；河北省中醫藥管理局科研計劃項目(編號：2014027)

△ 通訊作者：河北中醫學院婦科教研室，河北 石家莊 050091

1 中國石油天然氣集團公司中心醫院中醫科，河北 廊坊 065000

2 中國石油天然氣集團公司中心醫院門診部，河北 廊坊 065000

賈云波(1982—)，女，主治醫師，博士。研究方向：生殖與內分泌專業。

R711.71

A

1002-2619(2017)07-0992-05

2017-01-17)