利巴韋林原位聚合分子印跡電化學傳感器的研制

華彥濤,徐振林,王 弘,楊金易,孫遠明,沈玉棟

(華南農業大學 食品學院/廣東省食品質量安全重點實驗室,廣東 廣州 510642)

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利巴韋林原位聚合分子印跡電化學傳感器的研制

華彥濤,徐振林,王 弘,楊金易,孫遠明,沈玉棟*

(華南農業大學 食品學院/廣東省食品質量安全重點實驗室,廣東 廣州 510642)

利用原位聚合分子印跡技術,以3-氨基苯硼酸(3-ABBA)為功能單體,利巴韋林(RIB)為目標分子,以硼酸和順式二醇在不同酸堿度條件下可逆形成環內酯鍵為原理,在玻碳電極表面原位聚合形成利巴韋林分子印跡膜,研制了測定利巴韋林的分子印跡電化學傳感器。采用循環伏安法(CV)和差分脈沖法(DPV)對印跡膜性能進行研究。 DPV測試表明：在最優實驗條件下,利巴韋林的濃度在5.0×10-8～1.0×10-5mol/L范圍內與峰電流呈良好的線性關系,相關系數(r2)為0.995 3,檢出限(S/N=3)為1.5×10-8mol/L。特異性實驗表明制備的傳感器對利巴韋林的選擇性良好。該分子印跡電化學傳感器可用于食品中利巴韋林的檢測。

利巴韋林(RIB)；原位聚合；分子印跡聚合物(MIP)；電化學傳感器

利巴韋林(RIB)是人工合成的核苷類廣譜抗病毒藥,對許多DNA和RNA病毒有抑制作用,可用于病毒性感冒、肺炎等病癥的治療[1-4]。隨著我國畜禽飼養集約化水平的提高,傳染病的發生與流行已成為阻礙我國畜禽業快速發展的重要因素,因病毒感染導致動物死亡的比率僅次于細菌感染的致死率,占36.8%,且發病率呈上升趨勢。因此,繼抗生素藥物后,抗病毒藥物被大量用于畜禽產品生產中,如利巴韋林等抗病毒藥物常被用于雞、豬流感的預防和早期治療及豬傳染性胃腸炎的防治等。而長期大量使用這些藥物會導致動物中毒、免疫抑制、藥物殘留等問題,同時還可使病毒產生變異[5-8]。農業部第426號與560號公告和《獸藥管理條例》規定,禁止利巴韋林、金剛烷胺等人用抗病毒藥物作獸藥。美國FDA 也于2006 年禁止利巴韋林類抗流感病毒藥物用于禽類。目前抗病毒類藥物已列為我國畜禽產品普查及風險監測的重點對象,因此,建立其快速有效的檢測方法對于食品安全監控極為重要。

利巴韋林的檢測主要包括液相色譜(LC)[8-9]和液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)[10-15]等方法。該類大型儀器檢測準確、靈敏度高,但存在設備昂貴、需專業人員、前處理復雜耗時等不足。目前分子印跡傳感器已被廣泛用于農獸藥小分子藥物殘留的檢測,并且新型納米材料的應用使得電化學傳感器的檢測靈敏度更高。而且分子印跡電化學傳感器制備簡單,檢測藥物耗時短、費用低,且電極能重復利用,樣品前處理簡單[16-18],可與高效液相色譜-質譜確證技術結合應對量大面寬的農產品、食品安全快速篩查需求。分子印跡電化學傳感器敏感膜的制備方法包括分子自組裝法、溶膠-凝膠法、表面涂覆法、原位聚合、光或熱聚合等。其中原位電聚合電化學聚合是在印跡分子存在的情況下,功能單體分子發生電化學聚合,構成一種包含有印跡分子的聚合膜。相比于其他方法,電化學聚合方法操作簡單,在功能單體和印跡分子的溶液中進行電聚合即可實現,還可通過控制流通電荷的量獲得重復性優良的超薄膜,并且該方法制得的聚合膜具有很好的剛性,去除印跡分子后印跡空穴不易變形,具有良好的重現性。目前,有關利巴韋林的分子印跡電化學檢測技術尚未見報道。本文利用3-氨基苯硼酸為功能單體,利巴韋林為目標分子,以硼酸和順式二醇在不同酸堿度條件下可逆形成環內酯鍵為原理,采用原位電聚合方法,在電極表面原位聚合制備分子印跡膜,通過表征,實現了對抗病毒藥物利巴韋林的簡便、快速檢測,對于有效檢測利巴韋林具有重要的參考和實用價值。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

電化學工作站(上海辰華儀器公司)；三電極系統：玻碳電極；分子印跡電極(MIP)或非印跡電極(NIP)為工作電極；飽和Ag/AgCl電極為參比電極；鉑柱電極為對電極；利巴韋林(Ribavirin,RIB)、阿卡地新(Acadesine,AC)、3-氨基苯硼酸(3-Aminobenzeneboronic acid，3-ABBA)純度均為99%,購于上海阿拉丁生化試劑有限公司；其他試劑均為分析純,購于上海阿拉丁生化試劑有限公司,實驗用水為一級水。

圖1 以利巴韋林為模板分子的分子印跡聚合物的制備過程Fig.1 Schematic representation of the preparation process of molecularly imprinted polymers(MIPs) using RIB as template

1.2 印跡與非印跡電極的制備

首先將100 μL 0.05 mol/L利巴韋林溶液和1 mL 0.005 mol/L 3-氨基苯硼酸溶液分別加入6 mL磷酸緩沖液(PBS,0.05 mol/L,pH 8.0)中,超聲混合均勻。然后將處理好的裸玻碳電極、鉑絲電極與飽和甘汞電極浸入上述溶液。通過循環伏安法進行電聚合,調整合適的時間制備聚合物薄層修飾的電極,將該修飾玻碳電極浸入0.5 mol/L H2SO4溶液中,調整合適的洗脫時間,脫去鑲嵌在聚合物薄層中的利巴韋林分子。作為對照,非印跡電極(NIP)除了不加模板分子RIB,其余步驟同上。圖1為分子印跡膜的形成過程。

1.3 檢測方法

采用循環伏安法(CV)和差分脈沖法(DPV)對印跡電極進行表征。測定溶液為1.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)6] (含0.10 mol/L KCl),實驗所用溶液均需通氮氣除氧處理。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的優化

分別優化了單體和模板分子的摩爾比、聚合時間、洗脫時間、掃描速率和pH值等因素,觀察各條件下電極的峰電流變化ΔI(即浸泡在1.0×10-5mol/L RIB溶液MIP/GCE所測定的DPV峰值減去浸泡之前MIP/GCE測定的DPV峰值之差),選出最佳條件。

2.1.1 模板分子與單體分子摩爾比的優化 模板分子與單體分子的摩爾比影響分子印跡聚合物薄膜中印跡空穴的數量,也決定著該傳感器對模板分子的重新結合能力和特異性識別能力。本實驗對摩爾比進行優化,利巴韋林的濃度為0.05 mol/L,3-氨基苯硼酸的濃度分別為0.05,0.06,0.07,0.08 mol/L(即3-氨基苯硼酸與利巴韋林的摩爾比分別為1∶1,1.2∶1,1.4∶1,1.6∶1),各取100 μL加入6 mL pH 8.0的PBS溶液中制成聚合溶液,制備MIP/GCE。實驗結果表明,3-氨基苯硼酸與利巴韋林的摩爾比為1.2∶1時,電流變化值最高。

2.1.2 聚合時間的優化 聚合時間影響聚合薄膜的厚度以及電極的敏感性。在掃描速率為50 mV/s條件下,考察了聚合時間分別為5,10,15,20 min時電極的峰電流變化ΔI。實驗表明,聚合時間小于10 min時,制備的聚合薄膜不夠穩定；大于10 min則導致聚合薄膜太厚,阻礙溶液和電極之間的電子傳遞。因此選擇聚合時間為10 min,此時的電流峰位變化最明顯。

2.1.3 洗脫時間的優化 洗脫時間會間接影響聚合薄膜的厚度和印跡孔穴的數量。隨著洗脫時間的增加,洗脫下的RIB模板分子越來越多,生成的印跡孔穴也增多,電流變化值增大。本實驗設定的洗脫圈數分別為5,10,15,20圈,實驗表明洗脫圈數越多,電流峰位變化越明顯,增加到一定圈數之后,RIB分子基本洗脫干凈,15圈之后,電流峰位基本不再變化,所以實驗選擇洗脫圈數為15圈。

圖2 MIP/GCE和NIP/GCE的循環伏安曲線圖Fig.2 Cyclic voltammograms of different modified electrodes a.MIP/GCE before elution,b.MIP/GCE after elution, c.NIP/GCE after elution;d.NIP/GCE before elution； 5.0 mmol·L-1K3[Fe(CN)6],0.1 mol·L-1 KCl

2.1.4 掃描速率的優化 掃描速率與聚合薄膜的緊密程度有關,并影響傳感器的敏感程度。當掃描速率較低時,制得的聚合膜較為緊密,反之掃描速率過大時,制得的聚合薄膜較為疏松粗糙,導致傳感器的選擇識別能力下降。本實驗設定掃描速率分別為25,50,75,100 mV/s。實驗結果表明,隨著掃描速率的增加,電流變化值先增大后減小,在50 mV/s時達最大,故選擇最優的掃描速率為50 mV/s。

圖3 不同濃度RIB在傳感器的DPV響應Fig.3 DPV responses of RIB with different concentrations on MIP sensor concentration of RIB(from a to g):0,1.0×10-8，5.0×10-8， 5.0×10-7，5.0×10-6,1.0×10-5，5.0×10-5 mol/L; K3[Fe(CN)6],0.1 mol·L-1 KCl

2.1.5 支持電解質pH值的優化 分別配制pH值為6.0,7.0,8.0,9.0的電解液,考察了電解質pH值對傳感器峰電流的影響。結果表明,pH值偏低時,會減少苯硼酸與鄰二醇形成環內酯的可能性,pH值偏高時會破壞印跡膜的穩定性,導致模板分子的識別能力下降。由于pH 8.0時,峰形較為合理,且響應電流最好,故選用底液的pH值為8.0。

2.2 分子印跡膜的電化學表征

2.2.1 不同電極的循環伏安圖 選擇1 mmol/L的[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-溶液作為電化學活性探針測試不同電極的電化學行為。圖2為MIP/GCE和NIP/GCE的循環伏安曲線。由圖可知，MIP/GCE在洗脫前，沒有出現明顯的氧化還原峰(圖2b)，而在洗脫RIB分子后，出現了明顯的氧化還原峰(圖2a)。然而NIP/GCE在洗脫前(圖2d)與洗脫后(圖2c)均未出現較明顯的氧化還原峰。表明MIP/GCE經洗脫后出現印跡孔穴，而NIP/GCE則未得到。

2.2.2 傳感器的響應特征 在最優條件下,采用差分脈沖法(DPV)研究電極的氧化峰電流與利巴韋林濃度的關系,實驗結果如圖3。在5.0×10-8～1.0 ×10-5mol/L濃度范圍內,DPV測定的氧化峰電流與利巴韋林濃度呈良好的線性關系,其線性回歸方程為I(μA)=0.819 9c(μmol/L)+ 4.524,線性相關系數(r2)為0.995 3,檢出限(S/N=3)為1.5×10-8mol/L。該傳感器顯示了高靈敏度,且制作簡便、價格低廉。

2.2.3 傳感器的選擇性 選擇RIB的結構類似物阿卡地新(Acadesine,AC)、單體類似物苯甲酸鈉(Benzoic acid,BEN)考察MIP/GCE的選擇性。考察了1.0×10-5mol/L的RIB和AC在MIP/GCE和NIP/GCE上的電流變化,結果發現，RIB在MIP/GCE上的響應電流值ΔI較大,在NIP/GCE上的響應電流非常小,而AC在MIP/GCE與NIP/GCE上的響應電流均非常小,說明MIP/GCE對RIB具有很好的識別能力,對AC的特異性識別能力較弱。主要是因為本方法以3-氨基苯硼酸與順式鄰二醇可逆形成環內酯鍵為原理,雖然AC與利巴韋林結構相似,但因為AC有另外的氨基存在,會造成空間位阻,干擾鄰二醇與苯硼酸的聚合,因此MIP/GCE對AC選擇性較弱。

實驗同時考察了MIP/GCE的抗干擾能力,對1.0×10-5mol/L RIB+1.0×10-3mol/L AC溶液和1.0×10-5mol/L RIB +1.0×10-3mol/L苯甲酸鈉(BEN)溶液進行測定。檢測結果顯示,100倍于RIB的AC和BEN的存在均對RIB的測定無明顯影響。MIP/GCE顯示了良好的抗干擾能力。

3 結 論

本文分別以3-氨基苯硼酸與利巴韋林為功能單體與目標分子,在玻碳電極表面原位電聚合形成利巴韋林分子印跡膜,制備了分子印跡電化學傳感器。該傳感器具有快速結合模板分子的能力,對利巴韋林具有良好的選擇性。通過循環伏安法(CV)和差分脈沖法(DPV)對印跡膜性能進行了研究。利巴韋林的濃度在5.0×10-8～1.0×10-5mol/L范圍內與峰電流呈良好的線性關系,相關系數為0.995 3,檢出限為1.5×10-8mol/L。與利巴韋林的其他檢測方法(如LC,LC-MS等)相比,該傳感器制備方法簡單,檢測時間短,檢出限較低,穩定性好,有望用于食品中利巴韋林殘留的檢測。

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Development of an Electrochemical Sensor for Detection of Ribavirin Based on In-situ Polymerization Molecularly Imprinted Film

HUA Yan-tao，XU Zhen-lin,WANG Hong,YANG Jin-yi,SUN Yuan-ming，SHEN Yu-dong*

(Key Laboratory of Food Quality and Safety of Guangdong Province，College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

A novel electrochemical sensor for the determination of ribavirin(RIB) was fabricated by molecularly imprinted technology，based on 3-aminobenzeneboronic acid as functional monomer，and ribavirin as target molecule.A molecularly imprinted polymers(MIPs) membrane was synthesized on the surface of glassy carbon electrode in vacuum drying oven，by the formation principle of ring ester bond with boric acid and vicinal diol.The electrochemical behavior of the membrane was characterized by cyclic voltammetry(CV) and differential pulse voltammetry(DPV).Under the optimum conditions，the response of peak currents was linear to concentration of RIB in the range of 5.0×10-8-1.0×10-5mol/L with a detection limit(S/N=3) of 1.5×10-8mol/L.The electrochemical sensor has the advantages of high sensitivity，good stability and high reproducibility，and could be uesd to detect RIB in food.

ribavirin(RIB)；in-situ polymerization；molecular imprinting polymer (MIP)；electrochemical sensor

2017-03-07；

2017-03-25

國家自然科學基金項目(31371769)；廣東省科技計劃項目(2014A020219008，2014A050503059，2014A030311043)；廣州市科技計劃項目 (201704020082)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.07.015

O657.1；TQ460.72

A

1004-4957(2017)07-0921-04

*通訊作者：沈玉棟,博士,教授,研究方向：食品質量與安全研究,Tel：020-85283448，E-mail：shenyudong@scau.edu.cn