氣相色譜-串聯質譜檢測煙草中15種苯氧羧酸類除草劑殘留

曹桂紅,王興寧

(1.貴州食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550012；2.貴州出入境檢驗檢疫局 綜合技術中心，貴州 貴陽 550081)

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氣相色譜-串聯質譜檢測煙草中15種苯氧羧酸類除草劑殘留

曹桂紅1,王興寧2*

(1.貴州食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550012；2.貴州出入境檢驗檢疫局 綜合技術中心，貴州 貴陽 550081)

建立了氣相色譜-串聯質譜技術對煙草中15種苯氧羧酸類除草劑農藥殘留量的分析方法。樣品采用乙腈提取、Carbon TPT固相萃取柱凈化、三甲基硅烷化重氮甲烷衍生化，采用氣相色譜-串聯質譜對15種苯氧羧酸類除草劑進行測定,通過保留時間、選擇離子及相對豐度定性，外標法定量。結果表明,15種苯氧羧酸類除草劑在20～1 000 μg/L濃度范圍內均呈良好線性關系，相關系數大于0.992,檢出限為0.9～3.3 μg/kg，定量下限為3.2～10.8 μg/kg。在20,100,200 μg/kg 3個加標水平下的平均回收率為71.5%～105.6%，相對標準偏差(RSD)為4.5%～14.9%。該方法簡便、快速、靈敏，適用于煙草中15種苯氧羧酸類除草劑的同時檢測。

煙草；苯氧羧酸類除草劑；氣相色譜-串聯質譜(GC-MS/MS)；固相萃取(SPE)；甲酯化

煙草是我國重要的經濟作物,近年來，除草劑的施用極大地降低了勞動強度，有效提高了農業生產效率，對煙葉產量和品質起到了積極作用[1]。苯氧羧酸類除草劑及其鹽和酯對闊葉雜草有很好的防治效果，且易溶于水，但其在農田生態系統中會遷移，引起土壤、地下水、大氣等污染[2]。苯氧羧酸類除草劑本身有中等毒性，其代謝產物(特別是一些鹵化物)對人類和生物體會造成危害，可引起人類軟組織惡性腫瘤，對動物體也表現出胎盤毒性[3-4]。

煙草中的農藥殘留量問題成為各國煙草貿易中倍加關注的內容，國際煙草科學研究合作中心(CORESTA) 農用化學品咨詢委員會(ACAC)于2013年提出了煙草中120種農藥的指導性殘留限量(Guidance Residue Levels，GRLs)，其中規定了3種苯氧羧酸類除草劑的殘留限量，分別是麥草畏0.2 mg/kg、2,4-滴0.2 mg/kg、2,4,5-涕0.05 mg/kg[5]。

目前，國內外對苯氧羧酸類除草劑殘留量的檢測大多采用氣相色譜法、氣相色譜-質譜法、液相色譜-串聯質譜法及離子色譜法等,且主要集中于谷物、水果、蔬菜、茶葉、土壤及動物組織等樣品[6-10]。而采用氣相色譜-串聯質譜(GC-MS/MS)測定煙草中多種苯氧羧酸類農藥殘留量尚未見報道。煙草中富含有機酸、煙堿、還原性糖、總糖、礦物質等化學物質，成分極為復雜[11]。GC-MS/MS具有氣相色譜及單級質譜的檢測優勢，且抗干擾能力更強[12-14],適用于煙草等復雜基質樣品中殘留農藥的快速篩查與確證。本文對煙草中15種苯氧羧酸類除草劑多殘留分析的樣品提取、固相萃取凈化以及GC-MS/MS的分離測定等條件進行了研究，建立了煙草中15種苯氧羧酸類除草劑殘留的測定方法，方法簡便、快速、凈化效果較好，各項技術指標均符合殘留檢測的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

氣相色譜儀-串聯質譜儀(GC-MS/MS、7000C,美國安捷倫公司),X-22R高速冷凍離心機(美國Allegra公司),R-215旋轉蒸發儀(美國Buchi公司),旋渦振蕩器(美國Taiboys公司)，分析天平(美國Mettler公司)，TurboVap Ⅱ氮吹儀(瑞典Biotage公司)。乙腈、丙酮、正己烷(色譜純),甲苯(分析純),氯化鈉、無水硫酸鈉(農殘級)，三甲基硅烷化重氮甲烷衍生化試劑(0.6 mol/L)，均購于美國Sigma公司；Carbon TPT固相萃取柱(2 000 mg/12 mL，天津艾杰爾公司)。

標準品：3,5-二氯苯甲酸、麥草畏、MCPP、MCPA、2,4-滴丙酸、2,4-滴、5-氯苯酚、2,4,5-涕丙酸、草滅平、2,4,5-涕、2,4-滴丁酸、苯達松、毒秀定、地樂酚及三氟羧草醚(純度大于98%，德國DR公司)。實驗用水均為Milli-Q超純水。樣品：實驗室日常委托檢測樣品。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備液:準確稱取15種苯氧羧酸類除草劑標準品各10 mg(精確至0.1 mg)分別置于50 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度后，得到質量濃度為200 mg/L的農藥標準儲備液，儲存于4 ℃冰箱中。

混合標準儲備液:準確移取100 μL上述200 mg/L標準儲備液于10 mL容量瓶中，用丙酮定容，得到質量濃度為2 mg/L的混合標準儲備液，儲存于4 ℃冰箱中。

混合標準工作溶液:取2 mg/L混合標準儲備液，配制成質量濃度分別為20,100,200,500,1 000 μg/L的混合標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品提取 準確稱取2.00 g(精確至0.01 g)煙草樣品于50 mL具塞離心管中，加入5 mL水潤濕，加2 g氯化鈉和15 mL乙腈溶液振蕩混勻，靜置30 min，以5 000 r/min離心5 min收集上清液。再加15 mL乙腈重復提取1次，合并兩次提取液于100 mL濃縮瓶中，用旋轉蒸發儀40 ℃水浴蒸發濃縮至約1 mL，待凈化。

1.3.2 凈 化 在Carbon TPT固相萃取柱中加入1 cm高的無水硫酸鈉，加樣前用5 mL乙腈-甲苯溶液(體積比為3∶1)預淋洗該柱，棄去淋洗液，當液面到達無水硫酸鈉頂部時，迅速將樣品提取濃縮液轉入該柱，下接15 mL玻璃試管，分別用1 mL乙腈-甲苯溶液(3∶1)洗滌濃縮瓶3次，將全部洗滌液轉入Carbon TPT固相萃取柱中，待液面到達無水硫酸鈉頂部時，用15 mL乙腈-甲苯溶液(3∶1)洗脫，收集所有流出液，待衍生。

1.3.3 衍生化 將收集的洗脫液在40 ℃水浴中氮吹濃縮至近干,用5 mL正己烷淋洗試管壁，氮吹近干，再用5 mL正己烷淋洗1次，用平緩氮氣吹至約1 mL，加入100 μL三甲基硅烷化重氮甲烷衍生劑，蓋塞混勻后，于40 ℃下水浴10 min，再用平緩氮氣流吹至近干，用丙酮溶解并定容至1 mL，過0.2 μm有機濾膜后供GC-MS/MS分析。

1.4 色譜-質譜條件

色譜柱：DB-5 MS毛細管柱 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度：250 ℃，不分流進樣；載氣:He(純度>99.999%),流速為1 mL/min；進樣量為1 μL；升溫程序：起始溫度70 ℃，保持2 min；以10 ℃/min升至290 ℃，保持10 min。

電子轟擊離子源(EI)；電子能量:70 eV；離子源溫度: 230 ℃；接口溫度:280 ℃；溶劑延遲時間:5 min；檢測器電壓：1.0 kV；碰撞氣：氦氣，流速1.5 mL/min；數據掃描方式:正離子；測定方式：選擇反應監測方式(MRM)。每種化合物通過GC-MS/MS檢測的保留時間、離子對等相關參數見表1。

表1 15種苯氧羧酸類除草劑的色譜保留時間及質譜條件Table 1 Retention times and EI-MS/MS conditions for 15 phenoxyacid herbicides

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

比較了常用于除草劑前處理的乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷、正己烷和乙酸乙酯等溶劑的提取效果。結果表明,丙酮和甲醇的極性較強,對大多數除草劑能夠充分提取,但也提取出煙草中大量的油脂和色素,從而給下一步凈化帶來困難。乙酸乙酯、二氯甲烷和正己烷提取的色素和油脂較少,但不能完全提取煙草組織中的殘留除草劑,提取效率低。而乙腈能有效提取大多數除草劑,且對油脂和色素提取較少,易于凈化,所以本實驗最終選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2 凈化方法的研究

固相萃取(SPE)凈化技術是農殘檢測中較常見的前處理方式，對于不同溶液中的污染物可分別利用反相、離子交換、螯合樹脂等多種手段進行，具有溶劑用量少、便捷、安全、高效等特點。本文比較了Carbon TPT、石墨化碳(GC-NH2)、弗羅里硅土(FL-PR)、C184種固相萃取柱對添加了混合標準溶液的空白樣品的凈化效果，以15 mL乙腈-甲苯(3∶1)為洗脫液，經衍生化和濃縮定容后檢測。結果發現，Carbon TPT柱與GC-NH2柱的效果優于FL-PR柱和C18柱，這是由于FL-PR柱和C18柱對色素雜質的吸附能力較弱，基質干擾較大，而Carbon TPT柱對色素雜質的吸附性最強，凈化效果最好，因此實驗最終選擇Carbon TPT柱為凈化萃取柱。

2.3 衍生化條件的選擇

分別比較了不同的溫度(20、30、40、50、60 ℃)與時間(10、30、60、120 min)條件對衍生化效果的影響。結果表明，溫度低于40 ℃時，隨著溫度的升高，其所需的衍生化時間逐漸縮短，如20 ℃時所需要的衍生時間為60 min，30 ℃時所需要的衍生時間為30 min，實驗結果與文獻一致[13]；而當溫度≥40 ℃時只需10 min即可達到理想的衍生效果，繼續升高溫度，易導致溶劑揮發過快，影響試驗效果。因此實驗最終選擇衍生溫度為40 ℃，衍生時間為10 min。

圖1 15種苯氧羧酸類除草劑(100 μg/L)的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of 15 phenoxyacid herbicides(100 μg/L)1.3,5-dichlorobenzoic acid,2.dicamba,3.MCPP,4.MCPA,5.dichlorprop,6.2,4-D,7.pentachlorphenol,8.2,4,5-TP, 9.chloramben,10.2,4,5-T,11.2,4-DB,12.dinoseb, 13.bentazone,14.picloram,15.acifluorfen

2.4 質譜條件的優化

將質量濃度為5 mg/L的混合標準溶液在m/z45～500進行一級質譜全掃描(Full scan)，通過儀器自帶解卷積軟件和NIST譜庫檢索對色譜圖進行定性分析，確定目標化合物的保留時間、質量數及匹配度等信息。選擇特征明顯、質量數高、重現性好、無干擾的離子作為母離子。其次，進行二級質譜產物離子掃描，比較不同的碰撞能量獲取的產物離子色譜圖信息，選取重復性好、強度大、靈敏度高的碎片作為定量、定性的子離子,以豐度最高的1對子離子進行定量分析，豐度次高的1對子離子進行定性分析。最終確定各農藥的母離子、子離子、碰撞能量、掃描時間等參數(表1)。在選定的質譜條件下，得到了較為理想的分離效果，混合基質標準工作溶液的MRM圖見圖1。從圖1可以看出，除了8號與9號峰未完全分離外，其余的色譜峰峰形尖銳，對稱性好，各色譜峰間完全分離。

2.5 基質效應的考察

GC-MS/MS分析方法普遍存在基質效應，基質誘導效應即目標物在純溶劑和基質中響應存在較大差異，通常相同濃度的農藥在基質中表現為基質增強效應或基質抑制[15-16]。

消除基質效應的方法有基質凈化法、加入分析保護劑法、內標法、基質匹配標準溶液法等。由于分析保護劑的選擇有限且價錢昂貴，而內標法與基質匹配標準溶液法的前處理操作繁瑣且增加了后續數據的處理難度。本文選擇基質凈化法去除干擾物質，可有效降低基質效應的影響。

本文通過對比3個水平標準溶液與基質匹配標準溶液的響應強度，來考察基質效應。以在100,200,500 μg/kg 3個水平下基質匹配標準溶液中的峰面積響應之和與相對應3個水平下純溶劑配制的標準溶液中目標物的峰面積響應的比例差異來考察基質效應。結果表明，15種除草劑基質效應的比值在0.7～1.1之間，說明通過本文的凈化處理，可消除基質效應的影響。因此，本實驗可以采用純溶劑直接配制15種除草劑的工作曲線進行定量。

2.6 線性范圍與相關系數

將混合標準儲備溶液分別配制為20、100、200、500、1 000 μg/L系列濃度的標準工作液，以15種除草劑標準溶液的濃度為橫坐標(x,μg/L)、峰面積為縱坐標(y)，繪制線性關系曲線。結果表明，15種除草劑的濃度在20～1 000 μg/L范圍內與峰面積呈良好的線性關系，相關系數(r2)均大于0.992(見表2)。

表2 15種苯氧羧酸類除草劑的線性方程、相關系數、線性范圍、回收率、相對標準偏差(n=6)及定量下限Table 2 Linear equations,correlation coefficients(r2),linear ranges,recoveries,RSDs(n=6) and quantitative limits of 15 phenoxyacid herbicides

2.7 回收率、精密度及定量下限

選取空白樣品，稱取3個平行樣，分別準確添加15種除草劑混合標準溶液,按前述的操作步驟進行3個濃度水平(20,100,200 μg/kg)的加標回收實驗，每個水平平行測定6次,計算回收率及相對標準偏差(RSD)。結果表明，15種除草劑的平均回收率為71.5%～105.6%,RSD為4.5%～14.9%。分別根據3倍信噪比(S/N=3)及S/N=10計算15種除草劑的檢出限(LOD)與定量下限(LOQ)，得到15種除草劑的LOD為0.9～3.3 μg/kg，LOQ為3.2～10.8 μg/kg(見表2)。結果滿足國際煙草科學研究合作中心(CORESTA)農用化學品咨詢委員會(ACAC)指導殘留限量(GRLs)和技術方法指導對回收率、精密度、檢測靈敏度的要求。

2.8 實際樣品的檢測

為驗證方法的可行性，對企業委托檢驗的20個煙草樣品，按照建立的方法進行樣品前處理并測定15種苯氧羧酸類除草劑的殘留量。結果有2個樣品分別檢出麥草畏0.13 mg/kg、2,4-滴0.05 mg/kg，其他13種苯氧羧酸類除草劑均未檢出。

3 結 論

本文建立了乙腈提取，TPT固相萃取柱凈化,氣相色譜-串聯質譜同時檢測和確證煙草樣品中15種苯氧羧酸類除草劑殘留量的分析方法。對提取溶劑、凈化方式、衍生化條件、質譜參數等條件進行了優化，并考察了基質效應的影響，保證了檢測結果的準確性。方法針對CORESTA 2013版農藥殘留指導名單的苯氧羧酸類除草劑進行了考察，結果表明，該方法能有效避免煙草中復雜基質的干擾，選擇性強、靈敏度高、重現性好，能滿足當前對煙草中苯氧羧酸類除草劑殘留分析的相關要求。

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Determination of 15 Kinds of Phenoxyacid Herbicides in Tobacco by Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CAO Gui-hong1,WANG Xing-ning2*

(1.Guizhou Institute for Food and Drug Inspection,Guiyang 550012,China;2.Technical Center,Guizhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guiyang 550081,China)

A method was developed for the simultaneous determination of 15 phenoxyacid herbicides in tobacco.Samples were extracted with acetonitrile(MeCN),then cleaned up with TPT SPE column.The methylation of analyte was performed with trimethylsily-diazmethan,and the detection was carried out by gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS).The method showed a good linearity over the concentration range of 20-1 000 μg/L with correlation coefficients all above 0.992.The limits of detection and quantitation were 0.9-3.3 μg/kg and 3.2-10.8 μg/kg,respectively.The average recoveries of analytes at three fortified levels(20,100,200 μg/kg) were in the range of 71.5%-105.6%,with RSDs of 4.5%-14.9%.The proposed method is simple,rapid and sensitive,and is suitable for the simultaneous determination of 15 phenoxyacid herbicides in tobacco.

tobacco；phenoxyacid herbicides；gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS)；solid phase extraction(SPE)；methylation

2016-11-14；

2017-03-11

國家質檢總局科研項目(2015IK085)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.07.013

O657.63; S482.4

A

1004-4957(2017)07-0911-05

*通訊作者：王興寧，碩士，工程師，研究方向：食品中農藥殘留檢測，Tel:0851-822778102，E-mail:271762880@qq.com