高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質譜儀測定鹽酸黃酮哌酯中的1-(2-羥乙基)哌啶殘留

許 潔,周長朋，鄭文鳳，王春玲

(迪沙藥業集團國家認定企業技術中心，山東 威海 264205)

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高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質譜儀測定鹽酸黃酮哌酯中的1-(2-羥乙基)哌啶殘留

許 潔*,周長朋，鄭文鳳，王春玲

(迪沙藥業集團國家認定企業技術中心，山東 威海 264205)

建立了鹽酸黃酮哌酯中1-(2-羥乙基)哌啶的高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質譜(HPLC-QTRAP-MS/MS)定量分析方法。鹽酸黃酮哌酯藥物用0.1%甲酸溶解后，經Agilent ZORBAX SB-Aq C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱分離，以乙腈-0.1%甲酸水作為流動相進行梯度洗脫，采用電噴霧正離子掃描方式，以選擇反應監測(SRM)模式進行檢測。結果表明，1-(2-羥乙基)哌啶在10～100 μg/L范圍內線性關系良好(r=0.999 7)，加標回收率為98.9%～106.8%，相對標準偏差(RSD)均不大于3.0%，方法檢出限(S/N=3)為6.0 mg/L，方法定量下限(S/N=10)為20 mg/L。該方法簡單、靈敏、準確，適用于鹽酸黃酮哌酯中1-(2-羥乙基)哌啶殘留的測定。

高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質譜儀；鹽酸黃酮哌酯；1-(2-羥乙基)哌啶

鹽酸黃酮哌酯(Flavoxate hydrochloride，FX)，化學名3-甲基黃酮-8-羧酸-2-哌啶乙酯鹽酸鹽(合成路線見圖1)，是一種平滑肌松弛藥，具有選擇性解除泌尿生殖系統平滑肌痙攣的作用，對尿頻、尿急、尿痛以及尿失禁癥狀均有明顯的改善作用，臨床上常用于治療下尿路感染、梗阻性疾病以及尿道綜合征[1-3]。

液相色譜-質譜聯用技術(LC-MS)具有選擇性強、靈敏度高、定量準確等優點，近年來已被廣泛應用于藥品中的雜質研究，其中四極桿/線性離子阱(QTRAP)質譜屬于混合型串聯質譜，除具有三重四極桿的傳統定量功能外，還可進行多級子離子掃描，提供化合物結構信息[10-13]。因此，本文基于高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質譜(HPLC-QTRAP-MS/MS)技術，建立了測定鹽酸黃酮哌酯藥物中1-(2-羥乙基)哌啶的分析方法。該方法操作簡單、靈敏度高、回收率好，填補了國內鹽酸黃酮哌酯藥物中1-(2-羥乙基)哌啶定量檢測研究的空白，為鹽酸黃酮哌酯藥物的質量控制及安全性評價提供了可靠的檢測方法。

圖1 鹽酸黃酮哌酯的合成路線圖Fig.1 Graphical synthetic route of flavoxate hydrochloride

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo LTQ-XL型高效液相色譜-四極桿/離子阱質譜儀(美國Thermo公司)；BT-25S型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)；超聲清洗器(昆山超聲儀器公司)；0.22 μm有機系濾膜(天津津騰實驗設備有限公司)。

1-(2-羥乙基)哌啶(純度≥99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；甲酸(色譜級，美國Sigma公司)；乙腈(色譜級，德國Merck公司)；實驗用水為Milli-Q超純水(電阻率為18.25 MΩ·cm)；鹽酸黃酮哌酯精品(迪沙藥業集團有限公司)。

1.2 溶液的配制

對照品溶液：取1-(2-羥乙基)哌啶適量，精密稱定，用水溶解并定容，配制成1.0 mg/mL濃度的標準儲備液，4 ℃避光保存。取適量標準儲備液，用水配制成10.0 mg/L濃度的標準中間液，作為對照品溶液，4 ℃避光保存。上機前用0.1%甲酸水稀釋成適當濃度的標準工作溶液，過0.22 μm濾膜，待測。

供試品溶液：取鹽酸黃酮哌酯精品適量，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加0.1%甲酸水超聲溶解并定容，配制成0.1 mg/mL濃度的供試品溶液，過0.22 μm濾膜，待測。

1.3 色譜條件

(2)LVQ神經網絡比BP神經網絡在進行地下水源熱泵系統EER等級劃分的預測中速度更快，且穩定性和準確性更高。

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相：0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)。采用梯度洗脫模式：0～3.00 min，5%B；3.00～5.00 min，5%～95% B；5.00～8.00 min，95% B；8.01～20.00 min，5% B。流速：0.2 mL/min，柱溫：25 ℃；進樣體積：10 μL。

1.4 質譜條件

電噴霧離子源(ESI)；正離子檢測模式；掃描方式：選擇反應掃描(SRM)模式；離子源溫度：320 ℃；輔助氣溫度：300 ℃；鞘氣：35 psi；輔助氣：15 psi；毛細管電壓：3 500 V；定量方式：外標法定量；定量離子對：130.0→111.9；碰撞能量(CE)：40 V。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

1-(2-羥乙基)哌啶屬于極性分子，對其采用ESI離子源比APCI離子源的離子化效率更高，且1-(2-羥乙基)哌啶在水中顯堿性，因此采用電噴霧正離子模式(ESI+)進行檢測。將1-(2-羥乙基)哌啶配制成1.0 mg/L的標準溶液，先進行一級質譜全掃描，確定其準分子離子[M+H]+峰(m/z130.0)，然后對母離子進行子離子全掃描，得到碎片離子，篩選響應值較高、基線噪音低的離子(m/z111.9)作為監測離子，最后對鞘氣、輔助氣、碰撞能量等參數進行優化，得到“1.4”所述質譜條件。

2.2 配制溶劑的優化

鹽酸黃酮哌酯屬于酯類化合物，極易發生酯鍵水解反應，尤其是在堿性溶液中[14-15]。El-Gindy等[16]研究證明，鹽酸黃酮哌酯易水解生成3-甲基黃酮-8-羧酸和1-(2-羥乙基)哌啶(圖2)，在0.1 mol/L NaOH溶液中0.5 h內即可水解完全。本實驗考察了鹽酸黃酮哌酯在不同配制溶劑中的穩定性，分別用水、水-乙腈(95∶5)、0.1%甲酸水和0.1%甲酸水-乙腈(95∶5) 4種溶液配制得到0.1 mg/mL的鹽酸黃酮哌酯樣品，分別放置0，0.5，1，2，3 h后上機檢測。研究表明，鹽酸黃酮哌酯在水和水-乙腈溶液中的水解速度較快，0.5 h內1-(2-羥乙基)哌啶增長近5倍，在0.1%甲酸水和0.1%甲酸水-乙腈溶液中較為穩定，3 h內基本不水解。進一步研究發現，0.1%甲酸水-乙腈配制的樣品中1-(2-羥乙基)哌啶的保留能力降低，因此本研究選用0.1%甲酸水作為1-(2-羥乙基)哌啶和鹽酸黃酮哌酯供試液的配制溶劑。

圖2 鹽酸黃酮哌酯在NaOH溶液中的水解機理Fig.2 Hydrolysis mechanism of flavoxate hydrochloride in sodium hydroxide

2.3 色譜條件的優化

對3種常用的C18色譜柱Agilent Eclipse XDB(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)、Thermo Accucore(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)和Agilent Zorbax SB-Aq(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)進行考察。由于1-(2-羥乙基)哌啶的極性較大，出峰時間較早，在3種色譜柱上均能和鹽酸黃酮哌酯主峰達到有效分離，但1-(2-羥乙基)哌啶在Agilent Eclipse XDB柱上的峰形較寬且有拖尾現象，在Thermo Accucore柱上不能有效保留。考慮到本實驗的梯度洗脫程序中較長時間為高水相比例，Agilent Zorbax SB-Aq柱具有親水性表面，可以有效防止固定相的塌陷，在相同檢測樣品數量下使用壽命明顯高于Agilent Eclipse XDB柱和Thermo Accucore柱。另外，Agilent Zorbax SB-Aq柱可使極性化合物在高含水量的流動相中有強保留，從而延長1-(2-羥乙基)哌啶的出峰時間，因此本實驗選用Agilent Zorbax SB-Aq柱作進一步的色譜條件優化。

采用正離子掃描模式，在流動相乙腈-水體系中加入適量的甲酸可以提高其離子化效率[17]。本實驗考察了流動相A(甲酸水)中分別添加0.02%，0.05%和0.1%甲酸時對1-(2-羥乙基)哌啶峰形、響應強度以及保留時間等方面的影響。結果顯示，當流動相A中甲酸含量為0.02%時，雖然1-(2-羥乙基)哌啶的保留時間有所延長，但其峰形較寬而且拖尾嚴重，響應值較低；提高甲酸含量后，目標化合物的峰形均較好，但在0.1%甲酸條件下其響應值更高，且1-(2-羥乙基)哌啶的保留時間為1.60 min，與鹽酸黃酮哌酯主峰(RT=7.1 min)的分離效果較好。因此，本實驗最終選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相，采用Agilent Zorbax SB-Aq柱進行分離。

2.4 線性關系、檢出限與定量下限

用0.1%甲酸水溶液將10 mg/L的1-(2-羥乙基)哌啶標準溶液稀釋后配制成質量濃度分別為10，25，50，75，100 μg/L的系列標準溶液，在最佳檢測條件下進行測定，以1-(2-羥乙基)哌啶的峰面積(y)對其質量濃度(x,μg/L)進行線性回歸。結果表明，1-(2-羥乙基)哌啶在10～100 μg/L質量濃度范圍內線性關系良好(r=0.999 7)，線性方程為y=1 396.1+1 161.1x；以3倍信噪比(S/N=3)和S/N=10分別計算方法檢出限為6.0 mg/L，定量下限為20 mg/L。

2.5 重復性

按照“1.2”方法平行配制同一批號6份鹽酸黃酮哌酯供試品溶液，進行LC-MS測定，考察6份樣品中1-(2-羥乙基)哌啶的保留時間和峰面積的相對標準偏差(RSD)。結果顯示，6份鹽酸黃酮哌酯樣品中1-(2-羥乙基)哌啶保留時間的RSD為0.65%，峰面積的RSD為2.6%。方法的重復性良好，可以滿足1-(2-羥乙基)哌啶的分析要求。

2.6 樣品加標回收率與相對標準偏差

以已知1-(2-羥乙基)哌啶含量的鹽酸黃酮哌酯樣品的加標回收率考察方法的準確度。在鹽酸黃酮哌酯樣品中按80%限度、100%限度和120%限度3個水平添加1-(2-羥乙基)哌啶對照品，按照實驗方法進行樣品前處理和測定，每個加標水平平行測定3個樣品。由表1可知，鹽酸黃酮哌酯樣品中1-(2-羥乙基)哌啶濃度為63.40 mg/L，加標回收率為98.9%～106.8%，RSD均小于3.0%。

表1 鹽酸黃酮哌酯中1-(2-羥乙基)哌啶的加標回收率及相對標準偏差Table 1 Recoveries and RSDs of 1-(2-hydroxyethyl)piperidine ethanol in flavoxate hydrochloride

圖3 鹽酸黃酮哌酯樣品中1-(2-羥乙基)哌啶的SRM色譜圖Fig.3 SRM chromatogram of 1-(2-hydroxyethyl)piperidine in flavoxate hydrochloride sample

2.7 實際樣品的測定

應用本方法對小試3批、中試3批及工藝驗證3批共9批鹽酸黃酮哌酯樣品進行分析測定，所有樣品均按照“1.2”方法現用現配。9批樣品中均檢出1-(2-羥乙基)哌啶殘留，含量為53～117 mg/kg，均符合鹽酸黃酮哌酯中1-(2-羥乙基)哌啶雜質的限量要求(≤500 mg/kg)，圖3為某樣品的SRM色譜圖。

3 結 論

本文首次建立了鹽酸黃酮哌酯中1-(2-羥乙基)哌啶殘留的HPLC-MS/MS定量檢測方法，該方法利用LC-MS/MS的高選擇性，有效去除了其他雜質的干擾，確保了方法的高靈敏度，且精密度、回收率和定量下限均能滿足限度要求，適用于鹽酸黃酮哌酯中1-(2-羥乙基)哌啶殘留的定量檢測。

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Determination of 1-(2-Hydroxyethyl)piperidine in Flavoxate Hydrochloride by HPLC-QTRAP-MS/MS

XU Jie*,ZHOU Chang-peng,ZHENG Wen-feng,WANG Chun-ling

(National Enterprise Technology Center of Disha Pharmaceutical Group，Weihai 264205，China)

A high performance liquid chromatography-quadrupole ion trap tandem mass spectrometric(HPLC-QTRAP-MS/MS) method was developed for the quantification of 1-(2-hydroxyethyl) piperidine residue in flavoxate hydrochloride.After dissolved with 0.1% formic acid,the flavoxate hydrochloride sample was loaded onto an Agilent ZORBAX SB-Aq C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm) column to separate with a mobile phase of 0.1% formic acid-acetonitrile.The electrospray was operated in positive ion mode,and the sample was monitored in the select reaction monitoring(SRM) mode.As a result,the calibration curve of 1-(2-hydroxyethyl)piperidine showed a good linearity(r=0.999 7) in the range of 10-100 μg/L.The recoveries were in the range of 98.9%-106.8%,with relative standard deviations(RSDs) not more than 3.0%.The limit of detection(LOD,S/N=3) for the method was 6.0 mg/L,and the limit of quantitation(LOQ,S/N=10) was 20 mg/L.The method has the advantages of simple operation,high sensitivity and good reproducibility,and could be used for the detection of 1-(2-hydroxyethyl)piperidine in flavoxate hydrochloride.

high performance liquid chromatography-quadrupole ion trap tandem mass spectrometry(HPLC-QTRAP-MS/MS)；flavoxate hydrochloride; 1-(2-hydroxyethyl)piperidine

2017-02-22；

2017-03-17

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.07.012

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2017)07-0906-05

*通訊作者：許 潔，碩士，工程師，研究方向：理化檢測及藥物分析，Tel：0631-3857373，E-mail：xwjxuwenjing1987@126.com