奶牛乳房炎早期診斷試劑盒判定標準的制定

文/周慶民 徐 馨＊ 馮萬宇 張 艷 寧秀云

奶牛乳房炎早期診斷試劑盒判定標準的制定

文/周慶民1徐 馨1＊馮萬宇1張 艷1寧秀云2

（1黑龍江省獸醫科學研究所；2 訥河市動物防疫站）

為了建立奶牛乳房炎早期診斷試劑盒的判定標準，以目前檢測奶牛是否患有乳房炎最為準確的顯微鏡直接計數法為設定標準依據，以染色深淺與體細胞中DNA含量多少成正比、DNA含量多少與體細胞數量成正比的數量關系做對比，制定奶牛乳房炎早期診斷試劑盒的判定標準。結果顯示，該試劑盒判定結果能夠準確反映體細胞數量變化區間，準確判別奶牛乳房炎發生的程度。該試劑盒判定標準準確、劃分區間細致，能夠以明確的顏色變化準確快速判別奶牛乳房的狀況。

奶牛乳房炎；診斷試劑盒；DNA裂解；顯微鏡計數；判定標準

奶牛乳房炎是奶牛生產中發病率高、發生廣泛、危害最嚴重、造成損失最大的疾病之一，危及人類食品安全，嚴重阻礙奶牛業的健康發展。針對奶牛乳房炎早期臨床癥狀不明顯，呈隱性發生，不易判斷，研制出了奶牛乳房炎早期診斷試劑盒，其具有反應快速、檢測便捷的特點。本試驗以目前檢測奶牛是否患乳房炎最為準確的直接顯微鏡細胞計數法為設定標準依據，以染色顏色深淺與體細胞中DNA含量多少成正比、DNA含量多少與體細胞數量成正比的數量關系做對比，檢驗本試劑盒的判定準確性，同時制訂其判定標準。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

乳汁：采自齊梅生物科技股份有限公司良種乳牛繁育基地。

試劑：甲基綠（廣州威佳科技有限公司）、碘化鉀（濟南嘉裕化工有限公司）、冰醋酸（天津市恒興化學試劑制造有限公司）、醋酸鈉（南方醫科大學試劑中心）。

1.2 試驗方法

1.2.1 采集乳樣

隨機在齊梅生物科技股份有限公司良種乳牛繁育基地選取奶牛50 頭，選用專用的奶牛乳頭藥浴液，對乳頭進行藥浴，藥液作用時間保持在20～30 s。藥浴后用一次性紙巾擦干乳頭和基部，擠奶時丟棄前兩把奶，然后從第三把奶中收集50 mL接入滅菌管中。

1.2.2 顯微鏡計數

（1）涂布

充分搖勻新鮮采集的乳樣，用微量加樣器吸取滅菌管中部乳汁10 μL，將乳樣滴于玻片一端中部，仔細涂布成約1 cm2面積的乳膜。

（2）干燥、脫脂、固定

涂好乳膜的玻片于37 ℃溫箱中干燥后，用二甲苯脫脂5 min，再置于95%乙醇中固定5～10 min。

（3）染色

玻片干燥后，用美藍染色液染

色5 min。水洗，再用95%乙醇脫色數分鐘，水洗干燥后鏡檢。

（4）鏡檢及計數

在生物顯微鏡10 倍目鏡油鏡下觀察，計數視野內100 個1 cm2面積的體細胞數，然后用下式計算：SCC=系數×每個視野的細胞平均數（細胞總數÷100），即為每毫升乳樣中的體細胞數。

1.2.3 奶牛乳房炎早期診斷試劑盒檢測乳樣顏色變化

以移液槍吸取待檢奶牛乳汁樣品50 μL，加入100 μL KI裂解液，靜置2 min后加入甲基綠染色液，3 min后記錄顏色變化。

1.2.4 判定標準的制定

將顯微鏡計數結果與奶牛乳房炎早期診斷試劑盒顏色變化結果進行比對。將同一乳樣的體細胞數顯微鏡計數結果記入表1，另將應用奶牛乳房炎早期診斷試劑盒檢測的乳樣顏色變化結果也填入表1，摸索體細胞數量變化與顏色變化的對應關系，從而制定判定標準。

2 結果與分析

2.1 顯微鏡計數與奶牛乳房炎早期診斷試劑盒顏色變化比對結果

顯微鏡計數結果與奶牛乳房炎早期診斷試劑盒顏色變化比對結果見表1。試驗結果表明，體細胞數量變化區間對應著DNA染色的顏色變化梯度，體細胞數越多，綠色越深。由表1可知，乳樣中體細胞數低于2.9×105個/mL時，對應顯色顏色為淺藍綠色；體細胞數在3.0×105～4.9×105個/mL范圍內時，對應顯色顏色為淺綠色；體細胞數在5.0×105～7.9×105個/mL范圍內時，對應顯色顏色為淡綠色；體細胞數在8.0×105～14.9×105個/mL范圍內時，對應顯色顏色為綠色；體細胞數在15.0×105～49.9×105個/mL范圍內，對應顯色顏色為深綠色；體細胞數多于50.0×105個/mL時，對應顯色顏色為墨綠色。

2.2 判定標準的制定

“-”，為陰性，淺藍綠色（體細胞數為0～2.9×105個/ mL）；“±”，為疑似，淺綠色（體細胞數為3.0×105～4.9×105個/mL）；“+”，為弱陽性，淡綠色（體細胞數為5.0×105～7.9×105個/mL）；“++”，為陽性，綠色（體細胞數為8.0×105～14.9×105個/mL）；“+++”，為強陽性，深綠色（體細胞數為15.0×105～49.9×105個/mL）；“++++”，為極強陽性，墨綠色（體細胞數多于50×105個/mL）。

表1 顯微鏡計數與試劑盒染色結果表

表2 判定標準

3 討論

3.1奶牛乳房炎早期診斷試劑盒判斷標準，是以目前檢測奶牛是否患有乳房炎最為準確的顯微鏡直接計數法為設定標準依據，對同一樣品同時用顯微鏡計數法和早期診斷試劑盒進行檢測，比較體細胞數目多少和試劑盒染色深淺變化關系，確定早期診斷試劑盒的反應范圍，從而制定出早期診斷試劑盒的判定標準。

3.2本試驗中，診斷試劑盒的顏色變化隨著體細胞數量的變化而變化，而且呈正相關，隨著乳汁中體細胞數量的增多，診斷試劑盒的顏色越變越深，符合規律性變化。

3.3本試驗制定的奶牛乳房炎早期診斷試劑盒判斷標準是按照國際上通用的乳汁中體細胞數變化范圍對應試劑盒的顏色變化程度而確定，其判斷標準符合奶牛乳房炎的發生程度，與我國及國際對奶牛乳房炎的判斷一致，符合奶牛乳房炎的診斷標準。

4 結論

本文制訂的快速診斷試劑盒診斷標準，是以目前檢測奶牛是否患有乳房炎最為準確的顯微鏡細胞計數法為設定標準依據，以染色顏色深淺與體細胞中DNA含量多少成正比、DNA含量多少與體細胞數量成正比的數量關系做對比，制定的奶牛乳房炎早期診斷試劑盒判定標準。判定標準準確、劃分區間細致，能夠以明確的顏色變化準確快速判別奶牛乳房炎發生的程度。

該試劑盒判定結果準確反映體細胞數量變化區間，能夠快速判定出奶牛乳房炎發生的程度。其標準規范、操作簡便，判定迅速準確，便于攜帶和現場應用，為判定乳汁中體細胞數目、DNA數量及食品安全行業提供了一種經濟、便捷、有效、現場、適時、及時的檢測手段。適用于養殖場自主大規模批量檢測篩查，也適用于平時對疑似隱性乳房炎奶牛隨時判定。比對目前判斷奶牛乳房炎結果最為準確的體細胞計數法，該試劑盒顯色正確指示了體細胞數量變化關系，進而對應判斷出奶牛的健康情況。同時它還規避了體細胞計數法（SCC）、PCR檢測法和乳汁電導率檢測法需要在實驗室中檢測的局限性，也規避了乳汁pH值檢測法和乳汁電導率檢測法的不準確性。C

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黑龍江省省屬科研院所專項資金項目“奶牛乳房炎早期診斷盒及無抗治療劑的研究”]

周慶民（1964-），男，本科，研究員，研究方向為臨床診療與新獸藥開發。

2017-05-20）

?通信作者：徐馨（1983-），女，漢，碩士，助理研究員，主要從事新藥開發與疾病診療。