鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗(HB株)免疫產生期和持續期的試驗

段會娟，林 健，楊志遠，王小蕾，趙際成，潘 潔，何平有，鄒立宏，楊保收，劉月煥

［1．北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京 海淀 100097;2．瑞普(保定)生物藥業有限公司，河北 保定 071000］

鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗(HB株)免疫產生期和持續期的試驗

段會娟1，林 健1，楊志遠1，王小蕾1，趙際成1，潘 潔1，何平有2，鄒立宏2，楊保收2，劉月煥1

［1．北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京 海淀 100097;2．瑞普(保定)生物藥業有限公司，河北 保定 071000］

評價鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗(HB株)免疫16日齡北京鴨的效力、免疫產生期和持續期。利用實驗室制備的3批鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗(201401、201402和201403批)，以0．5 mL/只的劑量分別經肌肉或皮下注射途徑免疫16日齡DTMUV抗體陰性北京鴨，首次免疫后14 d按照同樣的劑量和途徑進行二次免疫。分別于首免后14 d，二次免疫后7、14、42、60d和100 d采血分離血清，用ELISA方法檢測抗體。采血后以0．5 mL/只含500 DID50的劑量經胸部肌肉注射鴨坦布蘇病毒進行攻毒，攻毒后2 d采血，分離血清進行病毒分離。3個批次疫苗免疫16日齡北京鴨，二次免疫后7 d均可檢測到血清抗體，至60 d檢測時抗體陽性率在80%以上。三批疫苗二次免疫后7 d即對試驗鴨產生保護，保護率可達到60%以上，其中皮下注射途徑的免疫持續期為60 d，肌肉注射途徑的免疫持續期為100 d。鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗對16日齡北京鴨采用二次免疫的程序可獲得良好的保護效果，胸部肌肉注射途徑優于皮下注射途徑。

鴨;坦布蘇病毒;疫苗;效力;免疫產生期;免疫持續期

自2010年4月，在我國浙江等多個省市發現以產蛋鴨產蛋量急劇下降為主要特征的疾病，根據卵巢出血的大體病變，將該病暫命名為鴨出血性卵巢炎(duck hemorrhagic ovaritis，DHO)［1］。隨后經過病毒分離鑒定和病毒NS5片段的DNA序列同源性分析結果表明，引起上述鴨疫情的病毒為一種黃病毒、Ntaya病毒群中的Tembusu病毒［2－3］，2011年首屆水禽疫病防控研討會將該病統一命名為“鴨坦布蘇病毒病”［4］。Tembusu病毒首次于1968年在Sarawak地區的蚊子體內分離到，曾一度認為家禽可能是病毒的自然宿主［5］。Tembusu病毒分別于1982年和1992年在泰國北部日本腦炎流行地區蚊子體內分離到［6－7］。雛鴨最早在10日齡發病，大部分集中在20～40日齡，發病雛鴨以出現站立不穩，倒地不起等神經癥狀為主，淘汰率在10% ～30%，嚴重的高達80%，給養鴨業造成了嚴重的經濟損失［8］。免疫接種是預防該病的重要措施，但疫苗免疫程序不合理，會造成鴨群免疫狀態產生差異，抵抗力低的鴨群不能抵抗病毒的侵襲，引起疾病的傳播。鴨坦布蘇病毒病疫苗的研究處于起步階段，尚未見有關免疫效力評價報道。本試驗采用血清學方法和免疫攻毒保護法測定疫苗免疫產生期和持續期，評價和比較不同免疫途徑疫苗的保護效力。

1 材料與方法

1.1 試驗地點瑞普(保定)生物藥業有限公司負壓動物舍，實驗動物使用許可證號為SYXK(Ji)2010－0045。

1.2 材料

1.2.1 疫苗 批號:分別為 201401、201402和201403的3批鴨坦布蘇病毒病(HB株)滅活疫苗，均由北京市農林科學院畜牧獸醫研究所和瑞普(保定)生物藥業有限公司實驗室研制。

1.2.2 毒株鴨坦布蘇病毒HB株(DTMUV－HB)，鴨胚F4代，由北京市農林科學院畜牧獸醫研究所增殖，鴨半數感染量(DID50)為107．7/0．5 mL。

1.2.3 北京鴨280只DTMUV抗體陰性的16日齡北京鴨，由北京南口北京鴨育種中心提供。

1.2.4 SPF雞胚 6日齡SPF雞胚，購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.2.5 ELISA試劑盒 ELISA試劑盒(ID Screen West Nile Competition，產品編號WNC－2P)，購自法國IDVET公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗鴨分組與免疫280只16日齡雛鴨隨機分為4組，3個試驗組各80只，分別注射實驗室試制的3批DTMUV滅活疫苗(01、02和03)，每組采用皮下注射(頸部后1/3處)及胸部肌肉注射途徑各免疫40只鴨，免疫劑量為0．5 mL/只。剩余的40只鴨作為非免疫對照鴨。免疫后14d，用相同批號疫苗按照同樣的免疫劑量和途徑進行二次免疫。

1.3.2 ELISA抗體的測定首免后14 d(二免前)，二次免疫后7、14、42 d和60 d分別取10只或5只鴨，采血分離血清測定ELISA抗體，測定的方法按照試劑盒說明書進行。

1.3.3 病毒分離分別將首免后14 d(二免前)，二次免疫后7、14、42、60 d和100 d用于ELISA抗體測定的10只或5只鴨，以0．5 mL/只的劑量(含500 DID50)胸部肌肉接種進行攻毒。攻毒后2 d采血分離血清，進行病毒分離。具體方法如下:采集的血清經卵黃囊途徑接種5枚6日齡SPF雞胚，每胚0．1 mL。接種后置37℃條件下繼續孵化，24 h內死亡雞胚棄去。采用RT－PCR方法測定24～72 h死亡雞胚的DTMUV核酸，將1/5或以上雞胚死亡且DTMUV核酸陽性的鴨判為DTMUV病毒分離陽性。

1.3.4 統計分析比較不同免疫途徑3批疫苗的免疫產生期和持續期，分析血清學方法和免疫攻毒保護法的相關性，評價疫苗的保護效力。

2 結果與分析

2.1 ELISA抗體201401、201402和201403批次的疫苗經皮下注射途徑一次免疫后14 d(即二次免疫前)尚無抗體產生，二次免疫后7 d開始檢測到血清抗體，免疫后14 d抗體陽性率達60%以上，至60 d檢測時抗體陽性率在80%以上。肌肉注射途徑組一次免疫后14 d，201401和201403批次的疫苗產生抗體，陽性率為20%;二次免疫后7 d三批疫苗的抗體陽性率達到60%以上，至60 d抗體陽性率在80%以上。同批次疫苗經肌肉注射途徑產生的抗體陽性率略高于皮下注射組。結果見表1。

表1 三批疫苗免疫鴨ELISA抗體檢測結果

2.2 免疫攻毒保護經皮下注射途徑1次免疫后14 d，201402批次的疫苗未對試驗鴨產生保護，201401和201403批次的疫苗保護率低(20%);二次免疫后7 d，三批疫苗均可保護部分試驗鴨免于病毒感染(3批疫苗的保護率為50%～80%)，此后疫苗的保護效果逐漸增強，免疫后42 d三批疫苗的保護率均達70%以上，并持續至免疫后60 d。但至100 d時，疫苗保護效果下降，約50%的試驗鴨可分離到病毒。肌肉注射途徑組一次免疫后 14 d，201403批次的疫苗未對試驗鴨產生保護，201401和201402批次的疫苗保護率低;在二次免疫后7 d，3批疫苗均產生保護作用(3批疫苗的保護率為60%～90%)，此后隨時間的延長，各批疫苗對試驗鴨的保護效果更加明顯，二次免疫后14 d，3批疫苗的攻毒保護率均達80%以上并持續到免疫后60 d，至100 d時仍保持70%以上的保護率。兩種免疫途徑對試驗鴨產生保護的時間基本一致，但肌肉注射途徑的攻毒保護率更高，且免疫持續期可達100 d，較皮下注射途徑60 d的免疫持續期，保護效果更持久。對照組全部為病毒分離陽性。結果見表2。

表2 三批疫苗免疫鴨病毒分離結果

3 討論

獸用疫苗的免疫途徑主要有飲水、滴鼻、噴霧、浸泡、皮下或肌肉注射等途徑，滅活疫苗主要采用皮內、皮下或肌肉注射途徑免疫?？紤]注射方便和禽皮膚的組織學結構，禽用滅活疫苗主要采用皮下或肌肉注射途徑免疫。由于禽類腿部肌肉血管豐富，腿部肌肉注射易將疫苗帶入心臟或其他組織器官，形成疫苗栓子，導致注射的家禽注射后出現死亡或出現臨床癥狀，本試驗在預試驗過程中，腿部肌肉注射的雛鴨即因注射原因出現注射部位肌肉嚴重出血和死亡現象，故本研究采用胸部肌肉注射途徑。本研究利用3批實驗室制備的疫苗，比較了皮下和肌肉注射途徑的免疫效果，結果表明，3批疫苗經肌肉注射途徑一次免疫后14 d群體的抗體陽性率低，皮下注射途徑免疫則尚未產生抗體;采用這兩種接種途徑二次免疫后7 d開始檢測到血清抗體，免疫后60 d仍保持較高的抗體陽性率;兩種接種途徑二次免疫后7 d均對16日齡北京鴨產生保護，其中皮下注射途徑的免疫持續期為60 d，肌肉注射途徑的免疫持續期更為長久，可達100 d，對群體的保護效果優于皮下注射途徑。對照血清抗體出現與疫苗產生保護的時間，可以看出在二免后7 d抗體陽性率大幅升高后疫苗的保護效果也隨之提高，并且疫苗保護持續時間與抗體持續期相吻合，這說明滅活疫苗免疫產生保護性抗體，并提示或可通過抗體檢測評價該疫苗的免疫效果。3批疫苗經兩種注射途徑后ELISA抗體陽性率和免疫攻毒保護率略有不同，可能與實驗動物的個體差異有關;皮下注射組ELISA抗體陽性率和攻毒保護率略低于肌肉注射組，分析可能與疫苗注射不確實及注射部位吸收不良有關。綜合血清抗體檢測結果及攻毒保護結果，采用肌肉注射途徑免疫鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗更為有效。

4 結論

4.1 鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗對16日齡北京鴨采用二次免疫的程序可獲得良好的保護效果，采用皮下注射或肌肉注射途徑二次免疫后7 d可檢測到血清抗體并產生保護，皮下注射途徑的免疫持續期為60 d，肌肉注射途徑的免疫持續期為100 d。

4.2 胸部肌肉注射途徑優于皮下注射途徑。

［1］ 曹貞貞，張存，黃瑜，等，鴨出血性卵巢炎的初步研究［J］．中國獸醫雜志，2010，46(12):3-6．

［2］ Cao Z，Zhang C，Liu Y，et al．Tembusu virus in ducks，china［J］．Emerging Infectious Diseases，2011，17(10):1873-1875．

［3］ Yan P，Zhao Y，Zhang X，et al．An infectious disease of ducks caused by a newly emerged Tembusu virus［J］．strain in mainland China．Virology，2011，417(1):1-8．

［4］ Sun X Y，Diao Y X，Wang J，et al．Tembusu virus infection inCherry Valley ducks:the effect of age at infection［J］．Veterinary Microbiology，2014，168(1):16-24．

［5］ Platt G S，Way H J，Bowen E T，et al．Arbovirus infections in-Sarawak，October 1968－February 1970 Tembusu and Sindbisvirus isolations from mosquitoes［J］．Ann Trop Med Parasitol，1975，69(1):65-71．

［6］ Leake C J，Ussery M A，Nisalak A，et al．Virus isolations from mosquitoes collected during the 1982 Japanese encephalitis epidemic in northernThailand［J］．Trans R Soc Trop Med Hyg，1986，80(5):831-837．

［7］ Pandey B D，Karabatsos N，Cropp B，et al．Identification of a flavivirus isolated from mosquitos in Chiang MaiThailand［J］．Southeast Asian J Trop Med Public Health，1999，30(1):161-165．

［8］ 李玉峰，馬秀麗，于可響，等，一種從鴨新分離的黃病毒研究初報［J］．畜牧獸醫學報，2011，42(6):885-891．

Studies on the period and duration of duck Tembusu virus inactivated vaccine producing

DUAN Hui-juan1，LIN Jian1，YANG Zhi-yuan1，WAGNG Xiao-lei，ZHAO Ji-cheng1，PAN Jie1，HE Ping-you2，ZOU Li-hong2，YANG Bao-shou2，LIU Yue-huan1

(1．Institute of Animal and Husbandry Medicine，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China; 2．Ringpu(Baoding)Biological Pharmaceutical Co．，LTD，Baoding 071000，China)

To evaluate the protection efficacy，immunity producing time and immunity duration of the duck Tembusu virus(DTMUV)inactivated vaccine(HB strain)in 16－day－old Beijing ducks．DTMUV antibody negtive 16－day－old Beijing ducks were inoculated with 0．5 ml of three batches of laboratory prepared DTMUV inactivated vaccine(201401，201402 and 201403)by intramuscular or subcutaneous routes respectively．On 14th daypost－injection，booster immunization was implemented with the same dosage and route as primary immunization．Sera were collected and detected for antibody by ELISA on day 14 after primary immunizaiton and on day 7，14，42，60and 100 after booster immunization．Groups of ducks were challenged by chest intramuscular injection with 500 DID50of DTMUV in 0．5 ml on the same day for sera colletcion，and sera were seperated on day 2 post challenge for virus isolation．Antibodies could be detected in the sera on day 7 after booster immunization with the three batchs of inactivated vaccine．On days 60 after booster immunization the antibody positive rates still remained above 80%．The three batchs of vaccine could protect ducks from challenge on day 7 after boost erimmunization，and the immunity protection rate was above 60%．Furthermore，the immunity duration of subcutaneous and intramuscular was 60days and 100 days，respectively．The DTMUV inactivated vaccine had good immunological efficacyin 16-day-old Beijing ducks with the procedure of two immunizaions．The intramuscular injection in chest is superior to the subcutaneous injection．

Duck;Tembusu virus;Vaccine;Efficiency;Producing immunity time;Immunity duration．

LIU Yue-huan

S852.43

A

0529-6005(2017)06-0106-03

2016-09-01

段會娟(1981-)，女，助理研究員，碩士，從事動物傳染病的防治工作，E-mail:huijuangduan@163．com

劉月煥，E-mail:liuyuehuan@sina．com