北京油雞混合感染副雞禽桿菌和禽偏肺病毒的診治

梅 晨，李淑芳，閆 旭，侯 婷，張培君，龔玉梅，王宏俊

(1．北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京 海淀 100097;2．北京市延慶區農業局，北京 延慶 102100)

北京油雞混合感染副雞禽桿菌和禽偏肺病毒的診治

梅 晨1，李淑芳1，閆 旭1，侯 婷2，張培君1，龔玉梅1，王宏俊1

(1．北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京 海淀 100097;2．北京市延慶區農業局，北京 延慶 102100)

副雞禽桿菌(Apg)為雞傳染性鼻炎的致病菌，本病的特點是潛伏期短，傳播迅速，短時間內便可波及全群［1］。處于產蛋高峰的雞群產蛋大幅度降低(10%～40%)，混合感染時會導致病雞死亡，給養殖業造成較大經濟損失，我國自1987年首次在北京分離到該菌后［2］陸續在不同省市分離到不同血清型的副雞禽桿菌［3－5］。禽偏肺病毒會引起一種以禽呼吸道癥狀、頭部腫脹和產蛋率下降為主要特征的疾病，該病毒屬于副黏病毒科、肺病毒亞科、肺病毒屬［6］，于1978年首次發現于南非共和國［7］，現已成為危害世界養禽業的重要疫病之一，禽偏肺病毒對火雞的影響非常明確，但對雞的影響卻知之甚少，一般認為可以引起雞的呼吸道感染而且是導致肉雞腫頭綜合征的重要誘因之一［8］。近年來由于養殖水平的提高及雞場保健意識的增強，單純的雞傳染性鼻炎在規模化雞場已經很少發病，但是如果混合感染了其他病原，導致抵抗力下降時，副雞禽桿菌會大量增殖，引起比較嚴重的呼吸道疾病。本實驗室于2016年3月接診了1例這兩種病原混合感染的病例，報告如下。

1 臨床癥狀

初期病雞出現輕微的呼吸道癥狀，表現為流鼻涕、甩鼻，隨著病情發展，病雞精神委靡，進食量減少，呼吸啰音，面部一側或雙側腫脹，重者雙眼因腫脹而完全失明，羽毛松亂，瘦弱。產蛋率急劇下降達30%。

2 剖檢變化

剖檢可見單側或雙側眶下竇腫脹，內有膿性分泌物;部分雞喉部及氣管有干酪樣滲出物;產蛋雞可見輸卵管萎縮，卵黃性腹膜炎。

3 實驗室診斷

3.1 細菌學分離鑒定

3.1.1 細菌分離 無菌操作采取病死雞眶下竇積液接種于TSA培養基，于厭氧罐中37℃培養16 h左右，挑取疑似副雞禽桿菌的菌落進行純化培養，連續3代以后平板上可見單一的針尖樣菌落。

3.1.2 PCR鑒定及分型 參考陳小玲［9］的方法，用1對特異性引物:F:5'-TGAGGGTAGTCTTGCACGCGAAT-3';R:5'-CAAGGTATCGATCGTCTCTCTACT-3'，做菌種鑒定。結果顯示，可以擴增出與預期條帶大小相同的DNA片段。初步鑒定為副雞禽桿菌(圖1)。

同時，參照Ryuichi SAKAMOTO［10］的分子分型方法，用如下分型引物進行分型鑒定:ABCF:5'-GGCTCACAGCTTTATGCAACGAA-3';

AR:5'-CGCGGGATTGTTGATTTTGTT-3'; BR:5'-GGTGAATTTCACCACACCAC-3';

CR:5'-TAATTTTCTTATTCCCAGCATCAATACCAT-3'，結果如圖2所示，表明本次分離的副雞禽桿菌為A型。

圖1 PCR檢測結果

3.1.3 血清型鑒定 參考Page程序進行HA和HI試驗鑒定副雞禽桿菌分離株的血清型［11］，分離株與800倍稀釋后的A型標準陽性血清發生陽性反應(表1)，而與B型和C型副雞禽桿菌的特異性陽性血清沒有反應。表明該分離株屬于 A型副雞禽桿菌。

圖2 PCR檢測結果

表1 Page方法的HI分型結果

3.1.4 回歸雞試驗 取6周齡SPF雞8只，眶下竇接種細菌分離物，106CFU/mL，0．2 mL/只，并設PBS接種空白對照，觀察發病情況。接種后24 h，所有分離培養的細菌接種后的試驗雞均出現了典型的雞傳染性鼻炎癥狀，而對照雞沒有任何臨床癥狀。

3.1.5 藥敏試驗 取分離的培養菌按常規紙片法進行藥敏試驗，結果顯示，分離株對頭孢氨芐、慶大霉素、頭孢哌酮、頭孢克羅高度敏感;對環丙沙星、左氧氟沙星、卡那霉素、頭孢拉定中度敏感;對磺胺嘧啶、土霉素、強力霉素、頭孢克肟不敏感(表2)。

表2 分離株藥敏試驗結果 (mm)

3.2 禽偏肺病毒核酸鑒定

3.2.1 RNA提取及反轉錄 將氣管棉拭子浸泡于PBS中充分洗下待檢病料后按照TRIZol說明書操作進行RNA提取，最后用5μL DEPC水溶解。反轉錄按照M-MLV Reverse Transcriptase說明書進行，具體反應體系如下:RNA 5μL，隨機引物1μL，5× M-MLV RT Buffer 4μL，核糖核酸酶抑制因子1μL， M-ML反轉錄酶1μL，dNTP(2．5 mmol/L)8μL。混勻后按以下程序進行反轉錄:42℃ 50 min，70℃15 min，反應結束后，立即置于－20℃保存備用。

3.2.2 PCR檢測 根據GenBank發表的禽偏肺病毒的Matrix(M)基因(登錄號為KF364615．2)的保守序列設計引物:上游引物5'-GAT GAC TAC AGC AAA CTA GAG-3';下游引物5'-CTT CAG GAC ATA TCT CGT AC-3'。預計擴增片段大小為468bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應總體系為20μL:cDNA 2μL，2×PCR Buffer 10μL，上、下游引物各1μL，以ddH2O加足體系。PCR反應條件為:94℃預變性5 min;94℃ 45 s，51℃ 45 s，72℃ 45 s，進行30個循環;72℃延伸5 min。反應結束后取5 uL產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果能成功擴增出目的條帶(圖3)。

圖3 PCR檢測結果

3.2.3 DNA序列分析 按照膠回收試劑盒說明書回收目的片段，在參照pGEM－T載體試劑盒說明書構建克隆載體。經菌液PCR鑒定為陽性克隆子后送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。使用DNAStar軟件將測序結果與GenBank中登錄的M基因進行序列比對分析(圖4)，結果顯示與 C亞型(登錄號為 FJ195332．1—FJ19534．1，FJ5344．1，FJ195345．1)核苷酸序列同源性極高，為96%～99%，同時也表明同一亞型不同毒株的這段基因相對比較保守，由以上結果確定病料中含有C型禽偏肺病毒。

圖4 序列比對結果

3.2.4 ELISA鑒定用IDEXX的禽偏肺病毒試劑盒檢測病雞的血清樣品，陽性值為0．306，陰性值為0.14，待檢血清值為0．5，結果顯示，血清中親偏肺病毒的抗體很高。

4 分析與討論

雞傳染性鼻炎和禽偏肺病毒感染是近期我國養雞場常見的兩種傳染病。病原體分別是副雞禽桿菌和禽偏肺病毒。單獨感染都能引起雞只的眼瞼腫脹，呼吸道癥狀，繼而導致采食量減少，產蛋下降等相似的臨床表現。根據雞場獸醫介紹，該雞群進行了馬立克、新城疫、傳染性囊病等常見疫病的疫苗免疫，沒有接種過雞傳染性鼻炎、支原體或偏肺病毒等相關疫苗。跟蹤調查結果顯示，新城疫，傳染性囊病免疫抗體水平較高。現場的調查發現，飼養密度不是很大，雞舍通風良好，但病雞癥狀表現得特別嚴重，單側或雙側眼瞼腫脹致盲。剖檢還發現部分產蛋雞輸卵管萎縮，或卵黃性腹膜炎。綜合發病情況、臨床癥狀、剖檢病變，我們初步懷疑是雞傳染性鼻炎。為進一步確診，我們開展了實驗室診斷工作。分離鑒定出A型副雞禽桿菌，診斷為副雞禽桿菌。通過ELISA抗體檢測，發現禽偏肺病毒血清抗體呈陽性，進一步的PCR鑒定，發現樣品中含有C型偏肺病毒的核酸，綜合診斷為副雞禽桿菌和禽偏肺病毒的混合感染，但不排除還有其他病原體的共同感染。

5 治療措施

隔離病雞，病死雞銷毀進行無害化處理。同時對全群雞只每羽肌肉注射10 000 IU頭孢氨芐;以慶大霉素飲水，連用3 d。對禽舍及飼養用具用0．1%百毒殺溶液進行徹底的消毒處理;場內健康雞與其他雞群緊急免疫雞傳染性鼻炎疫苗和偏肺病毒疫苗。經治療，病情迅速得到控制。

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［10］ Ryuichi SAKAMOTO，Yoichiro KINO，Masashi SAKAGUCHI．Developmentofa multiplex PCR and PCR－RFLP method for serotyping of Avibacterium paragallinarum［J］．Vet Med Sci，2012，74(2):271-273．

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S855.1+2

B

0529-6005(2017)06-0056-03

2016-06-20

國家自然科學基金項目(31272558);農業部公益性行業專項(201303044);北京市農林科學院創新能力建設項目(KJCX20140410)

梅晨(1989-)，女，碩士，從事預防獸醫學工作，E-mail:bjmeichen@sina．com

王宏俊，E-mail:whj_1209@163．com