Ⅰ群禽腺病毒液相基因芯片檢測方法的建立

朱余軍，饒 丹，叢 鋒，伍妙梨，袁 文，王 靜，練月曉，黃碧洪，徐鳳嬌，劉助紅，尹雪琴，黃 韌，張 鈺，陳梅麗，郭鵬舉

(廣東省實驗動物監測所 廣東省實驗動物重點實驗室，廣東 廣州 510663)

Ⅰ群禽腺病毒液相基因芯片檢測方法的建立

朱余軍，饒 丹，叢 鋒，伍妙梨，袁 文，王 靜，練月曉，黃碧洪，徐鳳嬌，劉助紅，尹雪琴，黃 韌，張 鈺，陳梅麗，郭鵬舉

(廣東省實驗動物監測所 廣東省實驗動物重點實驗室，廣東 廣州 510663)

為了建立一種快速、特異、靈敏的檢測I群禽腺病毒的液相基因芯片方法。根據Hexon基因序列設計特異引物，上游引物5'端加TAG序列，下游引物5'端加生物素，進行PCR擴增，將擴增產物與鏈霉素親和蛋白、磁珠37℃孵育30 min，通過Luminex200儀器分析。用所建立的液相基因芯片方法進行特異性、靈敏度、重復性及病料樣品的檢測。結果該方法的特異性強;檢測的敏感性可達1×102copies/μL;批內批間的變異系數都在5%以下;檢測結果與SYBR Green I熒光PCR方法100%相符。表明建立的液相基因芯片方法特異性好、靈敏高、重復性好，可用于 I群禽腺病毒的檢測。

Ⅰ群禽腺病毒(AAV);Hexon基因;液相基因芯片

禽腺病毒(AAV)是禽類一種常見的病毒，屬于禽腺病毒科禽腺病毒屬。禽腺病毒根據其抗原性不同可分為3個群，進一步利用RFLP技術把I群禽腺病毒劃分為A-E5個基因型，根據中和試驗可將其分為12個血清型(FAdV-1-FAdV 8a，8b-11)，I群禽腺病毒具有相同的群抗原，該病毒主要表現為包涵體肝炎、嚴重性貧血、呼吸道癥狀、出血性腸炎和產蛋量下降［1－2］。該病給我國養禽業帶來一定的經濟損失。液相芯片既可以檢測核酸又可以檢測蛋白質，應用范圍非常廣泛［3－4］。具有高通量大、靈敏度高、靈活等特點，使得該技術在基礎研究及檢測領域得到廣泛應用。本研究根據Hexon基因的保守序列設計了1對檢測I群禽腺病毒的特異性引物，系國內外首次建立I群禽腺病毒的液相基因芯片檢測方法，為I群禽腺病毒的流行病調查、防治等提供一種有效的方法。

1 材料與方法

1.1 毒株 12個血清型的禽腺病毒由青島農業大學尹燕博教授惠贈;產蛋下降綜合征病毒(EDSV)、傳染性腔上囊病病毒(IBDV)、禽呼腸孤病毒(REO)、禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)和馬立克病病毒(MDV)均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司;Premix Ex TaqTMDNA聚合酶、pMD19-T克隆載體、DL-2000 DNA Marker、6×Loading Buffer，購自寶生物工程(大連)有限公司;熒光編碼微球MagPlex-TAG022、鞘液，購自 luminex公司;Streptavidin RPhycoerythrin(SAPE)，購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 主要儀器 luminex200儀器，檢測軟件為xPONENT 3.1版本，核酸擴增儀，購自BIO-RAD公司。

1.4 引物設計與合成 根據GenBank中Hexon基因的保守序列設計了一對特異性引物(AAV-F1、AAV-F2)，預期擴增片段大小為191 bp(表1)，其中AAV-F1的5'端通過間隔臂(Spacer 18)添加有tag序列，tag序列能與微球MTAG-A022上所連的antitag序列反向互補，AAV-F2的5'端標記生物素。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。均經過HPLC純化，用雙蒸水溶解成10μmol/L儲存液備用。

表1 所用的引物及TAG序列

1.5 方法

1.5.1 病毒DNA的提取 按照病毒DNA提取試劑盒的操作步驟提取禽腺病毒DNA，－80℃保存備用。

1.5.2 Hexon質粒標準品的制備 通過PCR擴增Hexon基因片段，將PCR產物經膠回收純化后，與pMD19-T載體連接，并轉化至DH5α感受態細胞，37℃過夜，挑取單個菌落，進行PCR及測序鑒定，將陽性克隆進行質粒抽提備用。

1.5.3 PCR反應體系的建立 PCR擴增體系(25μL)如下:Premix Ex TaqTMDNA聚合酶(2×) 12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板2μL，補水至25μL。反應條件為:94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共進行35個循環，72℃ 10 min，于4℃結束反應。

1.5.4 PCR擴增產物、熒光編碼微球和鏈霉素親和-藻紅蛋白雜交 雜交緩沖液將熒光微球稀釋至125個/μL;取20μL稀釋的熒光編碼微球，5μL PCR產物，75μL SAPE使用液于一PCR管中，37℃孵育30 min，在Luminex200儀器上讀取熒光中位數(MFI)值。

1.5.5 結果判定 最低檢測閾值(cutoff值)的確定:選取10只健康雞組織樣品(每個樣品平行重復3次)，分別讀取MFI值并計算其平均值和標準差。以平均值加3倍標準差的MFI值設定其為cutoff值［5］。當檢測樣品的MFI值大于cutoff值時，判斷該試驗數據有效且為陽性樣本;否則，為陰性。

1.5.6 特異性試驗 利用上述方法，對12個血清型的I群禽腺病毒、EDSV、IBDV、REO、IBV、MDV和空白對照進行特異性試驗。

1.5.7 靈敏度試驗 將已知濃度為1×1010copies/ μL的pMD19-T Hexon質粒做10倍系列稀釋，每個稀釋度取2μL作為模板進行擴增，測定本方法的敏感性。

1.5.8 重復性試驗 選用1×107和1×105copies/ ul的作為標準品，進行批內、批間重復性試驗。

1.5.9 病料樣品的檢測 應用上述液相基因芯片方法，對廣東省某雞場送檢的60份雞組織病料樣本進行檢測，同時用SYBR Green I熒光PCR［6］法復檢。比較這兩種方法的檢測結果的符合率。

2 結果

2.1 PCR擴增結果 分別以12個血清型的I群禽腺病毒DNA作為模板，進行PCR擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，均能擴出191 bp的條帶(圖1)。

2.2 特異性試驗結果 本試驗的最低檢測閾值為250。應用本試驗建立的液相基因芯片方法進行檢測，12個血清型的Ⅰ群禽腺病毒均為陽性，而EDSV、IBDV、REO、IBV、MDV和空白對照均為陰性，表明所建立的液相基因芯片方法具有良好的特異性，與其他檢測對象無交叉反應(圖2)。

2.3 靈敏度試驗結果 對10倍系列稀釋的質粒進行檢測，結果表明，本試驗建立的液相基因芯片方法的靈敏度達1×102copies/μL(圖3)。

圖1 Ⅰ群禽腺病毒12個血清型PCR結果

圖2 液相基因芯片方法特異性檢測結果

圖3 液相基因芯片方法的靈敏度試驗結果

2.4 復性試驗結果 對重復性結果進行統計學分析(表2)，批內試驗的變異系數在4%以下，批間試驗的變異系數在5%以下，表明該方法的穩定，結果可靠，具有可重復性。

表2 標準品的批內和批間重復性試驗

2.5 病料樣品的檢測 使用新建立的液相基因芯片方法從60份病料樣品中檢出陽性樣本33份(陽性率為55%)，液相基因芯片檢測結果與 SYBR Green I熒光PCR檢測結果符合率為100%。

3 討論

液相芯片檢測技術是一種特異、敏感、快速、高通量的檢測技術。基于Luminex xMAP系統的液相芯片技術是惟一得到美國 FDA批準的芯片類技術［6］。液相基因芯片檢測技術是將多重熒光免疫分析(MFIA)和TAG技術結合起來，TAG技術使用Luminex專有的通用標簽，通過標簽序列與反標簽序列的專一性互補配對，進行核酸試驗優化，產品開發和分子診斷化驗。該技術避免了過去還需要將合成的寡核苷酸序列偶聯到微球上的復雜操作，有效地降低了成本和勞動力，同時大大地縮短了檢測的時間。

I群禽腺病毒有12個血清型，各血清型毒株的Hexon基因較為保守。因此，針對Hexon基因的保守區設計引物，該方法敏感性高，可達1×102copies/μL;特異性強，對EDSV、IBDV、REO、IBV、MDV等均無交叉反應;該方法具有很好的重復性，批內、批間試驗的變異系數均在5%以下。本試驗無需電泳，避免了電泳過程中的污染。應用該方法對60份雞組織病料樣本進行檢測，陽性率為55%，檢測結果與SYBR Green I熒光PCR法100%相符。本試驗建立的I群禽腺病毒的液相基因芯片檢測方法具有快速、靈敏度高、特異性強、重復性好等優點。

［1］ 殷震，劉景華．動物病毒學［M］．2版．北京:科學出版社，1997．

［2］ Domermuth C H，Weston C R，Cowen B S，et al．Incidence and distribution of avian adenovirus group II splenomegaly of chickens［J］．Avian Disease，1980，24(3):591-599．

［3］ Martins T B，Burlingame R，Von Muhlen C A，et al．Evaluation of multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for detection of autoantibodies to nuclear antigens［J］．Clin Diagn Lab Immun，2004，11(6):1 054．

［4］ Lash G E，Scaife P J，Innes B A，et al．Comparison of three multiplex cytokine analysis systems:Luminex，SearchLightTM and FAST Quant［J］．J Immun Meth，2006，309:205-208．

［5］ Crowther J R．Validation of Diagnostic Tests for Infectious Diseases［M］．Volume 149 ofthe series Methods in Molecular Biology，The ELISA Guidebook，2001:301-345．

［6］ 謝明星，彭小莉，苗春柳，等．牛白細胞黏附缺陷病液相基因芯片檢測方法的建立［J］．繁殖育種，2013，17:48-52．

Development of a magnetic beads suspension array for the detection of aviadenovirus group I

ZHU Yu-jun，RAO Dan，CONG Feng，WU Miao-li，YUAN Wen，WANG Jing，LIAN Yue-xiao，HUANG Bi-hong，XU Feng-jiao，LIU Zhu-hong，YIN Xue-qin，HUANG Ren，ZHANG Yu，CHEN Mei-li，GUO Peng-ju

(Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute，Guangdong Key Laboratory of Laboratory Animals，Guangzhou 510663，China)

To develop a rapid，specific and sensitive magnetic beads suspension array for the detection of Aviadenovirus group I (AAV)．According to the hexon gene sequences，a pair of specific primers were designed for amplified Aviadenovirus group I．The forward primer was designed with a unique TAG sequence at5’end，and the reverse primer was biotin-labeled at5’end．After amplifying the PCR fragment，the product，Streptavidin R-Phycoerythrin and magnetic beads were incubated at37℃ for 30 min．The resuls were analyzed using luminex 200 instrument．The specificity，sensitivity，reproducibility and clinical samples for this assay were evaluated．The assay was specific for 12 serotypes of Aviadenovirus group I，and there was nonspecific reactions with other viruses．Sensitivity analysis showed that the limit of detection of the developed magnetic beads suspension array was 1×102copies/ul of plasmid DNA．From the coefficient of variation analysis，the intra-and inter-assay coefficient of variation was lower than 5．Compared to SYBR Green I real-time PCR，there had a same detection rate(55%)of60 clinical samples．These results show that the assay is specific，sensitive，repeatable and flexible，and can be utilized for the detection of Aviadenovirus group I．

Aviadenovirus group I;Hexon;magnetic beads suspension array

CHEN Mei-li

S855.3

A

0529-6005(2017)06-0050-03

2016-09-14

廣東省科技計劃項目(2016A040403065);廣東省科技計劃項目(2015B070701003);國家科技支撐計劃(2015BAI07B00)

朱余軍(1988)，女，研究實習員，碩士，研究方向為預防獸醫學，E-mail:837895642@qq.com

陳梅麗，E-mail:chml@gdlami.com