副豬嗜血桿菌菌體蛋白的提取及蛋白質雙向電泳方法建立

謝宇舟，李 軍，馮世文，彭 昊，潘 艷，禤雄標，陳澤祥，許力干，楊 威

(1．廣西獸醫研究所，廣西 南寧 530001;2．廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室，廣西 南寧 530001)

副豬嗜血桿菌菌體蛋白的提取及蛋白質雙向電泳方法建立

謝宇舟1，2，李 軍1，2，馮世文1，2，彭 昊1，2，潘 艷1，2，禤雄標1，2，陳澤祥1，2，許力干1，2，楊 威1，2

(1．廣西獸醫研究所，廣西 南寧 530001;2．廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室，廣西 南寧 530001)

為了建立副豬嗜血桿菌菌體蛋白的雙向電泳方法，獲得背景清晰、蛋白分辨率高的雙向電泳圖，對細菌裂解方法、蛋白上樣量、IPG膠條選擇等關鍵步驟進行優化。結果顯示，采用超聲(9．9 s/停頓9．9 s，200 W)冰浴破碎細菌，5 min后，裂解液溶解沉淀，4℃過夜裂解提取菌體蛋白，以0．6 mg菌體蛋白上在pH值3～10非線性IPG膠條上進行電泳，最后考馬斯亮藍G250染色，獲得的蛋白質點清晰，效果最好，隨機挑取14個蛋白點進行質譜鑒定，證實均為副豬嗜血桿菌菌體蛋白。

副豬嗜血桿菌;雙向電泳;菌體蛋白;蛋白質組學

副豬嗜血桿菌(HPS)屬巴斯德菌科嗜血桿菌屬成員，是革拉澤病(Glasser's disease)的病原。HPS通常定植在健康仔豬的鼻腔、扁桃體和氣管前段等上呼吸道部位，與宿主呈共棲狀態。當仔豬感染豬繁殖與呼吸障礙綜合征、豬圓環病毒2型等免疫抑制病或處于應激狀態時，HPS可以突破宿主的免疫屏障保護，引起斷奶仔豬發生纖維素性漿膜炎、腦膜炎和多發性關節炎，病死率較高，對養豬業的健康發展構成一定的威脅［1］。

HPS分為15個血清型，此外，還有約20%的菌株未能定型，HPS血清型的多樣性是造成其臨床癥狀差異的主要原因［2］。

蛋白質雙向凝膠電泳 (Two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2－DE)技術是蛋白質組學研究的平臺，它通過等電聚焦電泳和SDSPAGE分離將細菌強、弱毒力菌株的各種菌體蛋白在二維平面上分離后，應用質譜技術對兩者的差異表達蛋白進行比較蛋白質組學研究，找出毒力相關的蛋白，為闡明其致病機制提供線索［3］。本試驗通過對HPS菌體蛋白提取、蛋白上樣量以及第一向等電聚焦電泳pH值范圍的選擇進行比較，建立一套HPS菌體蛋白制樣及蛋白質雙向電泳技術，為篩選HPS毒力相關蛋白奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 HPS血清4型菌株由本實驗室分離、鑒定和保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 胰酪胨大豆肉湯培養基(TSB)、胰酪胨大豆瓊脂培養基(TSA)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，購自北京索萊寶科技有限公司;馬血清，購自Hylone公司。IPG膠條(pH值3～10、pH值3～10 NL和pH值4～7)、IPG覆蓋液、IPG緩沖液、2～D Clean－Up kit蛋白質純化試劑盒，購自GE公司。裂解液為自配，成份為7mol/L尿素，2mol/ L硫脲，4%w/v CHAPS，1%DTT，1mmol/L PMSF。雙向電泳系統:一相Ettan IPGphor 3型，二相Ettan Dalt 6型為GE公司產品。光密度掃描儀(型號GS800)、圖像分析系統為Amer sham Bio sciences公司產品;基質輔助激光解離飛行時間質譜儀(型號4800 Plus MALDI TOF/TOF Analysis)為AB公司產品。

1.2 方法

1.2.1細菌裂解 將在TSA培養基中培養36 h的HPS單菌落接種于TSB培養基中，37℃搖床200 r/ min培養36 h;13 000 r/min(4℃)離心10 min收集菌體，PBS洗滌3次，棄去上清;采用以下3種方法裂解菌體:(1)菌體蛋白在裂解液中，4℃過夜裂解; (2)超聲波細胞破碎儀在冰浴中以200 W的功率破碎細菌，超聲9.9 s，停頓9.9 s，超聲5 min后，4℃裂解4 h;(3)超聲波細胞破碎儀在冰浴中以200 W的功率破碎細菌，超聲9．9 s，停頓9．9 s，超聲5 min后，置于裂解液中，4℃中過夜12 h處理。

1.2.2 菌體蛋白粗提 將獲得的細菌粗蛋白混合液，13 000 r/min(4℃)離心10 min，取上清，用6倍體積含0.07%DTT、10%TCA的丙酮溶液沉淀30 min;1 3000 r/min(4℃)離心20 min，棄上清;沉淀物用含0.07%DTT的丙酮溶液重新懸浮10 min，13 000 r/min(4℃)離心10 min，棄上清，重復2次;裂解液復溶，13 000 r/min(4℃)離心10 min，上清即為粗提的菌體蛋白。

1.2.3 菌體蛋白的純化 應用2－D Clean－Up kit蛋白質純化試劑盒純化粗提的菌體蛋白，方法按試劑盒說明書進行。純化后的菌體蛋白立即使用或－80℃保存備用。

1.2.4 蛋白質定量 用Bradford法測定所提取的菌體蛋白濃度［4］。

1.2.5 2－DE的優化 分別取0.3 mg、0.6 mg和1.0 mg的純化菌體蛋白進行上樣，以確定最佳的蛋白上樣量。分別采用pH值3～10、pH值3～10 NL和pH值4～7的IPG膠條進行第一向等電聚焦電泳，以判斷HPS菌體蛋白的總體分布情況。樣品首先加載于兩性電解質溶液(含8 mol/L尿素，2%w/v CHAPS，0.0078%DTT，0.01%IPG Buffer)中水化，第一向等電聚焦電泳結束后，IPG膠條首先在平衡緩沖液Ⅰ(含6 mol/L尿素，50 mmol/L Tris–HCl pH值8.8，20%v/v甘油，2%w/v SDS，1%DTT)中平衡15 min后，再在平衡緩沖液Ⅱ(含50 mmol/L Tris–HCl，6 mol/L尿素，30%甘油，2%SDS，4% IAA)中平衡15 min。平衡結束后，IPG膠條放置于濃度為12.5%的SDS－PAGE凝膠上，覆蓋含有0.002%溴酚藍的0.5%低熔點瓊脂糖封頂，進行第二向SDS－PAGE電泳，電泳程序首先為600 V，400 mA，2 W/膠，電泳0.5 h后，按 600 V，400 mA，20 W/膠進行，至溴酚藍達到膠底部時結束電泳。

1.2.6 染色、采集與分析 用考馬斯亮藍G－250考染法進行凝膠染色，最后在含有10%甲醇和10%冰醋酸的脫色液進行脫色［5］。染色結束后，通過Image Scanner掃描儀掃描采集圖像，用Image MasterTM2D Platinum7．0軟件進行數據分析。

1.2.7 蛋白質質譜鑒定 隨機挑取14個蛋白質點，將其從凝膠上切取，進行脫色、脫水、干燥、酶解［6］，最后將樣品提取肽段后進行質譜鑒定，獲得PMF圖譜，檢索NCBInr數據庫獲取數據。

2 結果

2.1 細菌裂解方法的確定 以在冰浴中以200 W的功率破碎細菌，超聲9.9 s，停頓9.9 s，超聲5 min后，置4℃過夜12 h的方法獲得的菌體蛋白濃度最高，為40μg/μL。而前2種方法的效果較差，蛋白質未能得到充分裂解，獲得的蛋白質濃度較低為24～33μg/μL。

2.2 蛋白質上樣量的確定 2～DE后，以0.3 mg純化菌體蛋白上樣，檢出的低豐度蛋白較少;以1.0 mg純化菌體蛋白上樣，高豐度蛋白掩蓋部分低豐度蛋白;而以0.6 mg純化菌體蛋白上樣，蛋白分布均勻，無拖尾，檢出率最高。

2.3 IPG膠條的確定 pH值3～10線性膠條有成片模糊現象(圖1 A);pH值4～7膠條中約有5～10%的蛋白質點丟失(圖1 C)。相對于pH值3～10線性和pH值4～7線性膠條而言，pH值3～10非線性膠條獲得的蛋白質點不容易產生成片的模糊現象，能夠盡量多的完整呈現(圖1 B)。

圖1 2－DE圖譜

使用Image MasterTM2D Platinum 7．0分析軟件對pH值3～10非線性膠條的2－DE進行初步分析，可以分辨出600±50個清晰可辨的蛋白質點，這些蛋白質點在酸性和中性區域的中高分子量區域較為集中而堿性低分子量區域則出現較少;選擇蛋白質點分布較為密集的區域進行軟件偵測，結果所有的蛋白質點均能被有效識別，并且沒有出現蛋白質點相互覆蓋的現象;對所選區域蛋白質點進行3D模擬，峰圖顯示，每一個峰代表一個蛋白質點，峰與峰之間相互獨立，峰高錯落有致，說明這些蛋白質點已經被有效的分離。

2.4 質譜鑒定 隨機選取14個蛋白質點進行質譜分析。根據PMF圖譜，采用Mascot軟件進行生物信息學分析，并與NCBInr數據庫進行比對，證實所得的14個蛋白質均為HPS菌體蛋白(表1)。

表1 蛋白質點的質譜鑒定

3 討論

提取純度高的蛋白是2－DE成功的基礎，本研究使用的細菌裂解液中含有尿素、硫脲、CHAPS和DTT，有助于提高細菌蛋白的溶解度，防止蛋白聚集。PMSF作為一種蛋白酶抑制劑，可以防止蛋白的降解。應用超聲破碎的方法可破壞細菌的核酸，防止核酸混雜在蛋白中堵塞IPG膠條孔徑，造成蛋白在膠條酸性端聚集，影響2－DE圖譜的質量。在3種裂解方法的比較中，采用超聲冰浴破碎細菌，裂解液溶解沉淀，4℃過夜12 h裂解的方法獲得的蛋白最多，因此，選擇此方法作為裂解細菌，提取蛋白的最佳方法。同時，還應用2－D Clean－Up kit蛋白質純化試劑盒純化粗提的菌體蛋白，去除提取過程中出現的糖類、鹽分和脂類等有可能對聚焦產生影響的物質。

樣品蛋白上樣量的多少是決定2－DE成功的另一個因素，蛋白上樣量太大，會造成部分蛋白在等電聚焦電泳中沉淀，2－DE圖譜出現重疊或拖尾，影響數據的分析。蛋白上樣量過少，會影響低豐度表達的蛋白的檢出。2－DE圖譜顯示，以0.6 mg純化菌體蛋白上樣，所獲得的結果最好，蛋白分布均勻，無拖尾，檢出率最高。

IPG膠條的pH值范圍、線性或非線性分布也影響了蛋白在2－DE中的分布。2－DE圖譜顯示，pH值3～10線性膠條的蛋白發生聚集，影響了分辨率;pH值4～7線性膠條則擴大了蛋白的分布，造成部分蛋白丟失;而pH值3～10非線性膠條的pH值在膠條上呈對數性分布，擴大了膠條上的3～10 pH值的分布，獲得的蛋白質點清晰，效果最好。

本試驗通過對2－DE方法中的細菌裂解方法、蛋白上樣量大小和IPG膠條的選擇等幾個關鍵步驟進行了優化，成功建立了一個適合HPS蛋白組學研究的2－DE方法，獲得的蛋白質點能被有效識別，沒有出現蛋白相互覆蓋的現象，隨機挑取14個蛋白質點進行質譜鑒定，證實均為HPS菌體蛋白，為下一步開展HPS不同血清型菌株的比較蛋白組學奠定了基礎。

［1］ Oliveira S，Pijoan C．Haemophilus parasuis:new trends in diagnosis，epidemiology and control［J］．Vet Microbiol，2004，68:71-75．

［2］ Kielstein P，Rapp－Gabrielson V J．Designation of15 serovars of-Haemophilus parasuis on the basis ofimmunodiffusion using heatstable antigen extracts［J］．J Clin Microbiol，1992，30(4): 862-865．

［3］ Grg A，Obermaier C，Boguth G，et al．Very alkaline immobilized pH gradients for two－dimensionalelectrophoresis ofribosomaland nuclear proteins［J］．Electrophoresis，1997，18(3‐4):328-337．

［4］ Bradford M M．A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding［J］．Anal biochem，1976，72(1):248-254．

［5］ 理查德J．辛普森．蛋白質與蛋白質組學實驗指南［M］．北京:化學工業出版社，2006:180-182．

［6］ 謝宇舟，密克，李軍，等．豬源大腸桿菌O157:H7菌體蛋白雙向電泳方法的建立［J］．中國獸醫雜志，2012，48(10): 31-33．

Establishment of two－dimensional electrophoresis assay for proteome analysis of Haemophilus parasuis

XIE Yu-zhou1，2，LI Jun1，2，FENG Shi-wen1，2，PENG Hao1，2，PAN Yan1，2，XUAN Xiong-biao1，2，CHEN Ze-xiang1，2，XU Li-gan1，2，YANG Wei1，2

(1．Guangxi Veterinary Research Institute，Nanning 530001，China; 2．Guangxi Key Laboratory of Animal Vaccines and New Technology，Nanning 530001，China)

To establish a two－dimensional electrophoresis(2－DE)assay for proteome analysis of Haemophilus parasuis and to get an electrophoretogram with a clear background，high protein point resolution and good repeatability，2－DE program was optimized，and various sample preparation methods，different loading quantities and IPG strip selection were studied．Samples were ultra－sounded with ice bath in 5 minute(9．9 s/every 9．9 s)followed by deposited at4℃ at24 hours．0．6 mg total protein was loaded onto pH3－10 nolinear IPG strip for 2－DE followed by staining with Coomassie Brilliant Blue G–250 nitrate．14 proteins were randomly chosen to identify by mass spectrum，and detection rate was 100%．

Haemophilus parasuis;two-dimensional electrophoresis;bacterial protein;proteomes

s:CHEN Ze-xiang;XU Li-gan

S852.65+1

A

0529-6005(2017)06-0046-04

2016-02-24

廣西科技攻關項目(桂科攻0993009－1);廣西基本科研業務費專項(桂科專項13－2);廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室專項(13-051-27-A-4)

謝宇舟(1984-)，女(壯族)，助理研究員，碩士，主要從事動物病原學研究，E-mail:Rain_1113@163．com

李軍(1971-)，男，副研究員，博士，研究方向為動物疫病防控與病原分子生物學，E-mail:jlee9981@163．com

注:李軍與謝宇舟對本文具有同等貢獻

陳澤祥，E-mail:xjszexiang@163.com;許力干，E-mail:xuligan@163.com