羊泰勒蟲病二溫式 PCR診斷方法的建立及初步應(yīng)用

田萬年，薛書江，賈立軍，張守發(fā)

(1．吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林 吉林 132101;2．預(yù)防獸醫(yī)學(xué)吉林省重點實驗室，吉林 吉林 132101;3．延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

羊泰勒蟲病二溫式 PCR診斷方法的建立及初步應(yīng)用

田萬年1，2，薛書江3，賈立軍3，張守發(fā)3

(1．吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林 吉林 132101;2．預(yù)防獸醫(yī)學(xué)吉林省重點實驗室，吉林 吉林 132101;3．延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

為建立特異、敏感、快速的羊泰勒蟲病診斷方法。根據(jù)GenBank已報道的羊泰勒蟲表面蛋白基因(AY274329)設(shè)計合成了1對引物，通過條件優(yōu)化，建立了羊泰勒蟲病二溫式PCR診斷方法。該方法能擴增出335 bp的羊泰勒蟲特異性基因片段，測序結(jié)果與已知基因序列同源性為100%。對羊泰勒蟲基因組DNA的最小檢測量為16 fg/μL，與新孢子蟲、弓形蟲、巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲均無交叉反應(yīng)。與普通PCR相比，二溫式－PCR在敏感性方面無顯著差異，但其反復(fù)升溫降溫時間消耗短。結(jié)果表明，二溫式PCR診斷方法具有較高的特異性和敏感性，可用于羊泰勒蟲病的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

羊泰勒蟲;表面蛋白基因;二溫式PCR

羊泰勒蟲病是由羊泰勒蟲引起的綿羊和山羊的一種經(jīng)蜱傳染的血液原蟲病。本病呈地方性流行，主要以高熱、貧血和消瘦為主要臨床癥狀。該病主要分布于我國的四川、河北、遼寧、內(nèi)蒙古、重慶、廣東、貴州、新疆、甘肅、青海和寧夏等地區(qū)［1－3］。羊泰勒蟲病可引起外地引進羊大量死亡，慢性發(fā)病的羊產(chǎn)肉量和產(chǎn)毛量顯著下降，嚴(yán)重影響?zhàn)B羊業(yè)的發(fā)展。目前羊泰勒蟲病的診斷主要通過血液涂片，顯微鏡檢查為主。但是，隱性感染羊的血液染蟲率較低時，顯微鏡檢測易出現(xiàn)漏檢和誤診。因此，急需建立一種敏感性高、特異性強，用于羊泰勒蟲病早期診斷。PCR方法是一種快速、敏感、特異的診斷方法，已廣泛應(yīng)用寄生蟲病的診斷［4－5］。二溫式PCR方法比常規(guī)PCR方法特異性更強，所需時間更短［6］。目前尚未見應(yīng)用二溫式PCR診斷羊泰勒蟲病的文獻報道。本試驗根據(jù)羊泰勒蟲表面蛋白基因(surface protein，SP)基因序列設(shè)計1對引物，建立了能快速診斷羊泰勒蟲病二溫式PCR方法，為今后羊泰勒蟲病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 血液樣本采自吉林省琿春地區(qū)散養(yǎng)的綿羊45份，無菌采取抗凝血，用PBS洗3次。存于－20℃?zhèn)溆谩Ｍ瑫r制作了血液涂片，甲醛固定保存，供染色鏡檢。新孢子蟲、弓形蟲RH株、巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲基因組DNA由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實驗室保存。

1.2 主要試劑 全血DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DL-2000 DNA Marker等，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 PCR診斷方法的建立

1.3.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上登錄的羊泰勒蟲表面蛋白基因序列(AY274329)，利用Primer Premier 5．0軟件在保守區(qū)設(shè)計了1對二溫式PCR引物，引物 P1:5'－GCGGTCCATGCGGTCCATTTCTTCCTTTA－3'，P2:5'－AGATTCAGTAGCATG AACTGCG－3'，擴增預(yù)期片段大小為335 bp。根據(jù)羊泰勒蟲18S rRNA基因序列(AY262117)設(shè)計普通PCR引物，引物P1:5'－CATCTTCTTTTTGATGAGTTGA－3'，P2:5'－TTTCGTCTTGATAATGAAAAC－3'，擴增預(yù)期片段大小為300 bp。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.3.2 羊泰勒蟲DNA標(biāo)準(zhǔn)模板的制備 將經(jīng)姬姆薩染色后顯微鏡檢查確診為羊泰勒蟲感染的綿羊抗凝血，按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA，抽提的DNA用50μL TE溶解，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCR擴增及退火－延伸溫度的篩選 以提取的羊泰勒蟲DNA為模板，PCR反應(yīng)條件如下: 94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火－延伸30 s，30個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。退火－延伸溫度梯度為59℃ ～64℃。

1.3.4 PCR產(chǎn)物的鑒定 將回收的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司序列測定。

1.3.5 特異性試驗 以羊泰勒蟲基因組DNA為試驗樣本，以新孢子蟲、弓形蟲RH株、巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲基因組DNA為對照樣本，進行二溫式和普通PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

1.3.6 敏感性試驗 用紫外分光光度計測定已提取的羊泰勒蟲DNA的D260nm值，計算DNA含量。以10倍為梯度進行連續(xù)稀釋成7個不同濃度，按照最適退火－延伸溫度進行二溫式和普通PCR擴增，對比其敏感性。

1.4 臨床樣本的檢測試驗 應(yīng)用所建立的二溫式PCR方法對采自吉林省琿春地區(qū)的45份血液樣品進行檢測。同時，與常規(guī)PCR和血液涂片鏡檢相對比，比較陽性檢出率。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增 對羊泰勒蟲基因組DNA進行PCR擴增后經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)335 bp的特異性DNA條帶(見圖1)，與預(yù)期的片斷大小相一致。

圖1 二溫式PCR擴增結(jié)果

2.2 測序與序列比較 將PCR產(chǎn)物純化后送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，結(jié)果表明，其核苷酸該序列與GenBank上登錄的羊泰勒蟲表面蛋白基因序列(AY274329)同源性為100%，表明吉林省琿春地區(qū)流行的羊泰勒蟲與國內(nèi)呂氏泰勒蟲親緣關(guān)系較近。

2.3 退火－延伸溫度的篩選 退火－延伸溫度梯度為59℃ ～64℃。其中，61℃時目的條帶最亮，因此，把61℃定為最佳的退火－延伸溫度(見圖2)。

圖2 二溫式PCR退火－延伸溫度的篩選試驗

2.4 特異性試驗 將以羊泰勒蟲、新孢子蟲、弓形蟲、巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲基因組DNA為模板，分別用二溫式和三步法進行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。電泳結(jié)果顯示，僅羊泰勒蟲DNA樣本擴增后出現(xiàn)特異性DNA條帶，與預(yù)期片斷大小相符，而作為對照樣本的新孢子蟲、弓形蟲、巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲基因組DNA均無此擴增條帶出現(xiàn)(見圖3)。

圖3 特異性擴增試驗

2.5 敏感性試驗 根據(jù)DNA分光光度法測定陽性模板DNA濃度為1．6 ng/μL。將所取的DNA依次做10倍梯度稀釋，分別進行PCR擴增，反應(yīng)結(jié)果進行瓊脂糖凝膠電泳檢測(見圖4)。當(dāng)DNA含量為16 fg/μL時，也能擴出特異目的條帶。

2.6 臨床樣本檢測 對采自吉林省琿春地區(qū)45份血液樣本分別進行二溫式PCR方法、普通PCR和血液涂片進行檢測。二溫式PCR和普通PCR方法的陽性率均為40%(18/45)，兩檢測方法檢出結(jié)果差異不顯著(P＞0．05)，而血涂片陽性率為17．78% (8/45)，且血液涂片鏡檢診斷為陽性的樣本經(jīng)二溫式PCR診斷均為陽性，表明二溫式PCR方法更為敏感。部分血液樣本進行二溫式PCR方法擴增結(jié)果(見圖5)。

圖4 敏感性試驗

圖5 部分血液樣本二溫式PCR檢測結(jié)果

3 小結(jié)與討論

目前國內(nèi)報道的羊泰勒蟲有3個種，呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和綿羊泰勒蟲。甘肅省主要由呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲混合感染;貴州、廣東和重慶僅存在呂氏泰勒蟲;新疆喀什僅存在綿羊泰勒蟲。本試驗根據(jù)羊泰勒蟲表面蛋白基因序列設(shè)計的特異性引物，經(jīng)PCR擴增出335 bp的基因片段，測序結(jié)果表明，該段基因與GenBank上羊泰勒蟲China 1基因同源性達到100%，結(jié)果表明，吉林省琿春地區(qū)流行的羊泰勒蟲為呂氏泰勒蟲，本試驗結(jié)果豐富了羊泰勒蟲流行病學(xué)資料，為吉林省琿春地區(qū)羊泰勒蟲病的綜合防治提供了參考依據(jù)。據(jù)報道，羊泰勒蟲病PCR診斷方法目的基因為18S rRNA基因序列。李有權(quán)等［2］基于18S rRNA基因序列對國內(nèi)流行羊泰勒3個種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，尤氏泰勒蟲和綿羊泰勒蟲各地方株之間差異較小，而呂氏泰勒蟲各蟲株之間差異較大，表明國內(nèi)羊泰勒蟲種間差異較大。大量研究結(jié)果表明，一些保守的抗原蛋白為目標(biāo)序列建立的診斷方法已得到了廣泛應(yīng)用［7－9］。因此，我們在對吉林省琿春地區(qū)羊泰勒蟲表面蛋白基因測序基礎(chǔ)上，針對該地區(qū)流行的羊泰勒蟲病建立二溫式PCR診斷方法，特異性試驗表明，該引物只能擴增出羊泰勒蟲表面蛋白基因片段，而不能擴增出瑟氏泰勒蟲、巴貝斯蟲、新孢子蟲和弓形蟲的基因組DNA，對該地區(qū)羊泰勒蟲病的臨床診斷方面具有一定的應(yīng)用價值。

目前我國對于羊泰勒蟲病的診斷主要通過血液涂片鏡檢來確診本病，但由于染色劑及相似病原體等人為因素影響鏡檢結(jié)果的判定，不適于對該病的早期診斷。應(yīng)用二溫式PCR方法診斷羊泰勒蟲是較好的方法，該方法與常規(guī)PCR診斷方法相比具有特異性強、擴增時間短特點，提高了該病的診斷的效率。通過對45份血液樣本的PCR檢測，陽性率為40%(28/45)，而血液涂片染色鏡檢出的陽性率為17．78%(8/45)，二者檢測的陽性符合率為100%。因此基于羊泰勒蟲表面蛋白基因建立的二溫式PCR方法是一種特異性強、敏感性高，且比常規(guī)PCR更省時的檢測技術(shù)，為羊泰勒蟲病的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效方法。

［1］ 郭淑珍，馬登錄，牟永娟，等．中國北方地區(qū)羊泰勒蟲病流行病學(xué)凋查［J］．中國獸醫(yī)寄生蟲病，2005，13(4):15-17．

［2］ 李有全，彭欲率，劉志杰，等．中國部分地區(qū)羊泰勒蟲病的流行病學(xué)調(diào)查及分類鑒定［J］．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45(16):3 422-3 429．

［3］ 袁延慶，李有全，劉志杰，等．我國南方地區(qū)羊泰勒蟲病的流行病學(xué)調(diào)查［J］．中國獸醫(yī)科學(xué)，2013，43(06):551-556．

［4］ 鄭進峰，羅金，謝俊仁，等．環(huán)形泰勒蟲裂殖體表面蛋白基因PCR診斷方法的建立［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2014，41(1):47-50．

［5］ 金春梅，許應(yīng)天，張守發(fā)，等．牛瑟氏泰勒蟲病PCR診斷方法的建立［J］．畜牧與獸醫(yī)，2007，39(5):46-48．

［6］ 盛明宏，于建敏，王志亮，等．羊泰勒蟲PCR檢測方法的建立和初步應(yīng)用［J］．中國動物檢疫，2007，24(7):20-22．

［7］ 羅金，劉光遠(yuǎn)，田占成，等．基于環(huán)形泰勒蟲Tams1基因多態(tài)性的二溫式－PCR檢測方法的建立［J］．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45(20):4 300-4 309．

［8］ 王軼男，賈立軍，薛書江，等．牛瑟氏泰勒蟲ITS基因PCR診斷方法的建立［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2012，39(8):80-83．

Establishment and Primary Application of Two－temperature PCR Method for Detection Theileriosis in goats and sheep

TIAN Wan-nian1，2，XUE Shu-jiang3，JIA Li-jun3，ZHANG Shou-fa3
(1．College of Animal Science，Jilin Agricultural Science and Technology College，Jilin 132101，China;2．Key Lab of Preventive Veterinary Medicine in Jilin Province，Jilin 132101，China;3．College of Agriculture，Yanbian University，Yanji133002，China)

To establish a rapid，specific and sensitive method for the detection of Theileriosis in goats and sheep，a pair of specific primers was designed and synthesized according to Theileria sp surface protein(SP)gene in GenBank(AY274329)and a two－temperature PCR assay was established．A 335 bp gene fragment was amplified，and had 100%of homology with the known gene sequence．The minimum detectable amount of DNA was 16 fg/μL．The method showed no cross reaction with Neoapora caninum，Toxoplasma gondii RH strain，Babesia gibsoni and Theileria sergenti．Compared with common PCR，two－temperature PCR had no significant difference in sensitivity．But，the method took a short time with repeated heating and cooling．The results showed that the PCR method was specific and sensitive．This study provided a method for rapid clinical diagnosis and epidemiological investigation of Theileriosis in goats and sheep．

ovine and captine theileriosis;surface protein(SP)gene two－temperature PCR

ZHANG Shou-fa

S852.273

A

0529-6005(2017)06-0043-03

2016-09-27

吉林省科技發(fā)展計劃項目(20150623004TC);吉林省重點學(xué)科培育項目(吉農(nóng)院合字［2015］第x030號);吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院種子基金項目(吉農(nóng)院合字［2014］第Z07號)

田萬年(1980－)，男，講師，博士，主要從事動物寄生蟲病研究，E-mail:wannian2000@hotmail．com

張守發(fā)，E-mail:shoufazhang@sina．com