沙門菌烈性噬菌體的分離鑒定及生物學特性的試驗

馬建偉，任慧英，鄒 玲，劉煥奇，單 虎，劉文華

(青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109)

沙門菌烈性噬菌體的分離鑒定及生物學特性的試驗

馬建偉，任慧英，鄒 玲，劉煥奇，單 虎，劉文華

(青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109)

從商品肉鴨場采集鴨糞及墊料，以實驗室保存的沙門菌為宿主菌，采用雙層平板法分離到1株烈性噬菌體。對分離到的噬菌體進行純化、效價測定、裂解譜測定、形態觀察，并且進行了最佳感染復數、溫度跟pH值穩定性和一步生長曲線的生物學特性研究。結果表明，該噬菌體形成的蝕斑均勻透亮，效價能達到109PFU/mL以上，并能裂解多株沙門菌菌株，為寬裂解譜噬菌體，透射電鏡顯示，該噬菌體為長尾噬菌體;最佳感染復數為0.001;一步生長曲線測定表明，該噬菌體的潛伏期為15 min，暴發期為30 min，暴發量約為320;該噬菌體的溫度、pH值耐受性良好;紫外線照射60 min后效價降低3個梯度，由此可見該噬菌體分離株可作為潛在開發的生物消毒劑菌株。

沙門菌;噬菌體;蝕斑;最佳感染復數;一步生長曲線

沙門菌廣泛分布在自然界中，是一種對人和動物有致病性的革蘭陰性桿菌。在獸醫臨床上沙門菌會引起雞、鴨、豬、羊等多種動物患病，目前臨床上仍以抗生素治療為主，但抗生素的大量使用導致沙門菌耐藥性越來越嚴重，給養殖業造成了嚴重的經濟損失。同時沙門菌也是一種重要的食源性致病菌［1－2］，是人類健康的一大威脅。

噬菌體是一種能夠特異侵染細菌并能將細菌裂解的病毒，噬菌體以自身特定的配體與細菌表面的特定受體結合，沙門菌噬菌體只侵染沙門菌，不會對正常菌群產生影響，并且不受細菌耐藥性的限制，在殺死宿主菌的同時能夠大量增殖，是一種天然而且安全的殺菌劑。在臨床上已經有噬菌體應用于治療細菌感染的報道，并且取得了不錯的療效［3－4］。在Bruttin A等［5］研究報道中，使用T4噬菌體進行大腸桿菌病的治療探究中，人和動物都沒有出現不良反應。在抗生素濫用，細菌耐藥性越來越嚴重的今天，將噬菌體作為治療細菌感染的新方法越來越引起人們重視。本研究使用雙層平板法分離得到了1株沙門菌噬菌體，分析了該噬菌體的生物學特性，為今后應用到沙門菌病治療及環境消毒中提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 本次試驗用沙門菌菌株由實驗室從臨床病死鴨中分離鑒定并保存。糞便及墊料采集自山東沂南、淄博、濰坊等地商品肉鴨場。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 取鴨糞及墊料加入200 mL無菌

1.2.2 菌種的復蘇及菌懸液的制備 復蘇凍存的沙門菌，挑取生長的單菌落于LB肉湯中，置于搖床中震蕩培養，制備菌懸液備用。

1.2.3 雙層平板法分離噬菌體 取3 mL 1.2.1中的母液與增殖好的沙門菌菌懸液各取200μL混合后，37℃震蕩培養過夜。取培養之后的增殖液10 000 r/min離心5 min后用0.22μm的細菌濾器過濾。取200μL濾液與100μL菌懸液混合之后置于37℃溫箱中孵育5 min，將混合液加入融化之后冷卻至45℃左右的含0.7%瓊脂的LB上層瓊脂中混勻，將上層瓊脂倒入下層營養瓊脂上，待凝固后置于37℃溫箱中培養6～10 h，觀察有無噬菌斑生長。1.2.4 噬菌體的純化 用無菌鑷子扣取單個噬菌斑置于盛有1 mL生理鹽水無菌EP管中，40℃水浴30 min，水浴結束后10 000 r/min離心5 min，將浸出液適當稀釋后與相應的宿主菌再次鋪雙層平板，再重復扣取單個噬菌斑進行純化，直到得到大小和形態均一的蝕斑，純化7代。

1.2.5 噬菌體效價的測定 增殖采用液體增殖法。扣取單個噬菌斑制備單一噬菌體浸出液，取500μL浸出液跟200μL宿主菌懸液與LB肉湯混合之后37℃震蕩培養，取增殖液10 000 r/min離心5 min，離心后的增殖液適當稀釋后取200μL稀釋液與100μL宿主菌鋪雙層平板測定效價。

1.2.6 噬菌體裂解譜的測定 采用點樣法［6］進行裂解譜的測定。取100μL待測菌懸液于營養瓊脂平板上，用無菌棉棒充分涂勻，待菌液充分吸收后，取2.5μL噬菌體增殖液點到涂好菌的營養瓊脂上，待噬菌體增殖液充分吸收之后，將平板置于37℃溫箱中培養10 h。

1.2.7 噬菌體的形態觀察 取噬菌體增殖液15μL滴加到微孔銅網上，自然沉降15 min，用濾紙吸收多余的液體，滴加10μL 2%磷鎢酸染色5 min，用濾紙吸收多余的液體，自然干燥，之后透射電鏡觀察。

1.2.8 噬菌體最佳感染復數(MOI)的測定 首先增殖噬菌體跟宿主菌，測定噬菌體與宿主菌效價，按照感染復數為:0.001、0.01、0.1、1、10的比例各取200μL宿主菌跟噬菌體加入盛有5 mL LB肉湯的試管中，將試管置于37℃震蕩培養3 h，測定增殖液效價，每個感染復數做兩個重復。

1.2.9 噬菌體一步生長曲線的繪制 按照最佳感染復數各取200μL噬菌體增殖液與宿主菌混合，13 000 r/min離心30 s，棄上清，再用500μL LB肉

其他模相合系數為0, 像s1,1,0, s2,2,1等. 我們發現該線性增長率與重力加速度g和球界面初始半徑r0有關: 隨著重力加速度的增大而增大, 隨著初始半徑的增大而減小. 而這些非零模耦合系數與g無關, 只與初始半徑有關: 隨著初始半徑的增大而減小.

湯洗滌2次并離心棄上清。用預熱的LB肉湯混懸沉淀(總體積5 mL)，置于搖床中培養，同時開始計時，在0時刻及每隔15 min取出150μL，13 000 r/ min離心1 min測定效價，每個時間做兩個重復。

1.2.10 噬菌體溫度穩定性試驗 取150μL噬菌體增殖液于1.5 mL離心管中，置于40、50、60、70、80℃水浴中作用20、40、60 min，每個溫度梯度做兩個重復，作用結束后測定效價，繪制噬菌體效價在不同溫度下隨時間的變化曲線。

1.2.11 噬菌體pH值穩定性試驗 取900μL不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的LB肉湯與100μL噬菌體增殖液混合，混合之后置于溫箱中，作用1 h、2 h、3 h，作用結束之后立即測定效價，繪制噬菌體效價隨pH值變化的曲線。

1.2.12 噬菌體紫外線穩定性試驗 取4 mL噬菌體增殖液于75 mm無菌平皿中，將平皿置于超凈臺距紫外燈(功率30 W)40 cm處，開紫外燈連續照射。每隔10 min取100μL噬菌體增殖液測定效價，連續測定60 min，繪制噬菌體效價隨紫外線照射時間變化曲線。

2 結果

2.1 噬菌體分離結果 分離到1株噬菌體，命名為BS3，純化7代之后，通過增殖測定效價，效價能達到109PFU/mL，該噬菌體在平板上噬菌斑形態見圖1。

圖1 噬菌體BS3噬菌斑

2.2 噬菌體裂解譜的測定 噬菌體BS3對實驗室保存的32株沙門菌可以裂解其中的18株，由此可知噬菌體BS3為寬裂解譜噬菌體。

2.3 噬菌體電鏡觀察 在透射電鏡下清晰看到噬菌體BS3由多面體的頭部和細長的尾部組成，從平面圖上可以看到頭部為六邊形，頭部直徑約60 nm，尾部長度約120 nm(圖2)。

2.4 噬菌體最佳感染復數測定 噬菌體BS3感染復數(MOI)測定結果見表1。

表1 噬菌體BS3感染復數測定結果

從表中可以看出，當MOI=0.001時，噬菌體BS3增殖后測定得到的噬菌體效價最高，因此噬菌體BS3的最佳感染復數為0.001。

2.5 噬菌體一步生長曲線結果 本次測定得到的噬菌體BS3的一步生長曲線，見圖3。

圖3 噬菌體BS3一步生長曲線

從噬菌體BS3的一步生長曲線可以看出，噬菌體BS3潛伏期約為15 min，暴發期約為30 min，根據暴發量公式:暴發量=暴發末期噬菌體效價/感染初期宿主菌濃度，計算所得暴發量約為72。

2.6 噬菌體溫度穩定性試驗 試驗測定得到的BS3溫度穩定性曲線，見圖4。

從噬菌體BS3效價隨溫度變化曲線上可以看出，噬菌體BS3在40℃下作用1 h之后可以保持原活性，在50℃跟60℃下作用20 min之后效價略有下降，但效價仍能達到108PFU/mL。在70℃作用20 min后效價下降較快，下降到106PFU/mL，作用1 h之后效價下降到僅為25 PFU/mL。在80℃左右20 min之后完全失活。

圖4 噬菌體BS3溫度穩定性

2.7 噬菌體pH值穩定性試驗 試驗測定得到的BS3的pH值穩定性曲線，見圖5。

圖5 噬菌體BS3pH值穩定性

從噬菌體pH值穩定性曲線上可以看出，噬菌體BS3在pH值4～12范圍內作用3 h后仍能保持原活性。在pH值2跟pH值13條件下作用1 h之后失活，在pH值3條件下作用1 h后效價略有下降，但仍能達到107PFU/mL，作用3 h效價下降較快，下降到104PFU/mL。

2.8 噬菌體紫外線穩定性試驗 試驗得到的噬菌體BS3紫外線穩定性曲線見圖6。

圖6 噬菌體BS3紫外線穩定性

從噬菌體BS3效價隨紫外線照射時間變化曲線上可以看出，隨著照射時間的延長，噬菌體的效價不斷下降，照射60 min后效價為107PFU/mL，說明該噬菌體分離株對紫外線耐受力較強。

3 討論

溫度和pH值的耐受力是衡量噬菌體穩定性的重要指標，本次分離到的噬菌體通過測定，在60℃下作用1 h，噬菌體BS3能保持108PFU/mL以上的活性，溫度耐受性比較強，在現實環境不會達到這么高的溫度，即便育雛期溫度也不過35℃，因此溫度基本不會對噬菌體產生影響。噬菌體BS3在pH值4～11范圍內均能保持108PFU/mL以上的效價，而在實際生產中，pH值變化主要是在使用一些酸性或堿性消毒劑的時候發生的，但這種變化不會劇烈波動，因此在應用到環境消毒中時pH值對該噬菌體的活力影響不大。

不同地區分離到的沙門菌噬菌體的生物學特性不一致，尤其是在pH值耐受性、最佳感染復數、一步生長曲線以及裂解譜等方面存在較大差異。如包紅朵等［7］分離的2株沙門菌噬菌體分別在pH值6～11和pH值6～9范圍內穩定，相比本研究分離的噬菌體，pH值耐受范圍窄;其測定的2株噬菌體的最佳感染復數為0.1和0.01，潛伏期長，暴發量小。朱育瑋［8］分離到的噬菌體在pH值4下作用60 min，存活率為15.1%，pH值耐受性較差。江艷華等［9］報道的最佳感染復數與本研究相同，均為0.001。

當噬菌體室外應用時，對紫外線的穩定性是必須要考慮的一個因素。逯凱［10］分離到的大腸桿菌噬菌體，在紫外燈下照射14 min后完全失活。本研究分離到的噬菌體在紫外燈下照射60 min，仍保持有107PFU/mL效價，這可能主要與噬菌體本身的特性有關，此外，也會收到紫外波長、照射時間、距離以及光復活酶等因素的影響。總之，該噬菌體的寬噬性及對溫度、pH值和紫外線的良好耐受性為其臨床應用奠定了基礎。

［1］ 陳玲，張菊梅，楊小鵑，等．南方食品中沙門氏菌污染調查及分型［J］．微生物學報，2013，53(12):1 326-1 333．

［2］ Majowicz S E，Musto J，Scallan E，et al．The Global Burden of Nontyphoidal Salmonella Gastroenteritis［J］．Clinical Infectious Diseases，2010，6:882-889．

［3］ S M，M Y，H N，etal．Experimentalprotection ofmice againstlethal Staphylococcus aureus infection by novel bacteriophage phi MR11［J］．The Journal of Infectious Diseases，2003，4:613-624．

［4］ Huff W E，Huff G R，Rath N C，et al．Therapeutic efficacy of bacteriophage and Baytril(enrofloxacin)individually and in combination to treat colibacillosis in broilers［J］．Poultry Science，2004，12:1 944-1 947．

［5］ A B，H．B．Human volunteers receiving Escherichia coli phage T4 orally:a safety testofphage therapy［J］．Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2005，7:2 874-2 878．

［6］ 袁品坦．噬菌體感染的快速檢測及其生產挽救［J］．發酵科技通訊，2003，01:29-30．

［7］ 包紅朵，張鵬禹，周艷，等．沙門氏菌裂解性噬菌體的分離鑒定及其生物學特性［J］．食品科學，2015，36(5):131-136．

［8］ 朱育瑋．沙門氏菌噬菌體的分離鑒定及生物學特性研究［D］．聊城:聊城大學，2015．

［9］ 江艷華，李風鈴，王聯珠，等．一株沙門氏菌裂解性噬菌體的分離鑒定及生物學特性［J］．微生物學通報，2015，42(3): 534-542．

［10］ 逯凱．多價噬菌體Bp7生物學特性及其尾絲蛋白gp37生物信息學分析［D］．青島:青島農業大學，2013．

Study on the biological characteristics of an isolated virulent Salmonella Bacteriophage

MA Jian-wei，REN Hui-ying，ZOU Ling，LIU Huan-qi，SHAN Hu，LIU Wen-hua

(College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China)

With the preserved salmonella strains as host bacteria，salmonella bacteriophage was isolated by double plate method from duck feces and bedding from duck frams．Then the isolated bacteriophage was purified and tested for the titer，sis spectrum and morphology．The biological properties were identified by optimal multiplicity of infection(MOI)，pH and thermostability and one-step growth experiment．The plaques were symmetrical and bright，and the titer of this bacteriophage was more than 109PFU/mL．This bacteriophage not only caused bacteriolysis to hoststrain，butalso lysed another salmonella．The ultrastructure under TEM showed thatit was siphovirus．The MOI of BS3 was 0．001．One step growth showed that the latent period was 15min，the burst period was 30min and the burst size was 72．The stability to pH and temperature was excellent．The titer was decreased three gradients after ultraviolet ray irradiation for 60min．This bacteriophage can be used as a potential biological disinfectant．

Salmonella;Bacteriophage;Plaque;MOI;one-step growth curve

LIU Wen-hua

S852．61+2

A

0529-6005(2017)06-0024-04

2016-12-26

山東省現代農業產業技術體系—牛產業創新團隊項目(SDAIT-09-03);山東省高等學校優勢學科創新團隊培養計劃項目

馬建偉(1991-)，男，碩士生，從事獸醫微生物學與免疫學研究，E-mail:790968345@qq．com

劉文華，E-mail:wenhualiu2668@126．com