GnRH二聚體和GnRH并列二聚體合成肽疫苗對大鼠的免疫去勢效果

陳文娟，魏 冰，呂傳忠，任東興，陳 庚，付旭彬

(1．天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津 西青 300384;2．天津瑞普生物技術股份有限公司，天津 東麗 300308)

GnRH二聚體和GnRH并列二聚體合成肽疫苗對大鼠的免疫去勢效果

陳文娟1，魏 冰1，呂傳忠2，任東興2，陳 庚2，付旭彬2

(1．天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津 西青 300384;2．天津瑞普生物技術股份有限公司，天津 東麗 300308)

為了比較GnRH二聚體和GnRH并列二聚體單次和兩次免疫對雄性大鼠的免疫去勢效果。將上述兩種GnRH疫苗，分組免疫SD大鼠，免疫后每兩周檢測大鼠血清中的GnRH抗體滴度和血清睪酮水平、睪丸重量和組織結構變化。結果顯示，兩次免疫試驗組的抗體滴度顯著高于單次免疫試驗組的抗體滴度(P＜0.05);GnRH二聚體抗原免疫效果優于GnRH并列二聚體抗原的免疫效果，且差異極顯著(P＜0.01)。免疫組大鼠血清睪酮水平及睪丸重量均極顯著低于空白對照組(P＜0.01)。免疫去勢效果顯著的大鼠只數統計顯示，GnRH二聚體(5/6)和GnRH并列二聚體(4/6)兩次免疫均多于單次免疫(4/6和3/6)。同時，組織學觀察結果可見，免疫組大鼠睪丸組織結構萎縮，曲精小管管徑變窄，內部精母細胞脫落，精子變少或者沒有。表明GnRH二聚體疫苗與GnRH并列二聚體疫苗均能達到去勢效果，前者優于后者，兩次免疫優于一次免疫。

免疫去勢;GnRH二聚體;GnRH并列二聚體;單次免疫;兩次免疫;合成肽疫苗

免疫去勢是用促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)類似物疫苗免疫的方法抑制性器官的發育，以達到去勢目的。采用免疫去勢，可有效防止手術去勢導致的出血、感染情況的發生，具有安全方便、應激小、適合集約化養殖等優點，在促進動物生長、改善肉質、提高肉用家畜生產性能上具有廣闊的應用前景［1－2］。目前，世界范圍內商品化的GnRH疫苗只有碩騰公司旗下CSL動物保健公司(Pflier，CSL animal health，Australia)生產的Improvac 疫苗，用于去除公豬膻味，需要在屠宰前4周和 8周兩次皮下注射(劑量:2 mL/次)［1，3］。合成肽疫苗(synthetic peptide vaccine)是用化學合成法制備具有保護作用的類似天然抗原決定簇的多肽疫苗，隨著合成肽制備技術的發展，合成肽抗原的生產成本大大降低，合成肽疫苗在獸醫臨床上的應用成為現實［4］。因此，在前人研究的基礎上，我們設計并合成了GnRH二聚體抗原肽和GnRH并列二聚體抗原肽，分別單次和兩次免疫雄性SD大鼠，在免疫后不同時間采血，檢測血清中抗體及睪酮水平的變化，進一步分析兩種疫苗及兩種免疫方式在作用過程中的區別，為免疫去勢疫苗的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 健康、體重相近(240 g～280 g)的雄性SD大鼠，購自天津市津南區春樂實驗動物養殖場。

1.2 主要試驗試劑和儀器 GnRH二聚體合成肽抗原、GnRH并列二聚體合成肽抗原(201505，瑞普生物技術股份有限公司);MONTANIDE ISA 61VG佐劑(T30311，賽彼科(上海)特殊化學品有限公司);睪酮放免試劑盒(20151120，北京北方生物技術研究所有限公司);HRP標記的羊抗大鼠IgG(14-16-06，KPL Corporation);TMB單組份顯色液(20151105，Solarbio公司);高剪切分散乳化機(FA25型，FLUKO公司);酶標檢測儀 (Bio-RAD15146型，iMark);臺式冷凍離心機(3K-15型，北京五洲東方科技發展有限公司);醫用冷藏箱(HYC-260型，Haier公司);冰箱(BCD-221CHC型，美菱公司);生化培養箱(SPX-250型，寧波江南儀器廠)。

1.3 多肽疫苗制備 采用固相合成技術合成兩種GnRH抗原肽，分別與Montanide ISA 61VG佐劑進行乳化制成油包水疫苗，終濃度為100μg/mL，分裝后于4℃保存。

1.4 動物免疫與采血 8周齡的SD大鼠，隨機分為A、B、C、D、E共5組，每組6只。一周后背部皮下兩點注射，每只0.5 mL，其中C、E組于兩周后加強免疫一次，方法同第一次免疫，詳細免疫情況見表1。常規飼養，自由飲食。于免疫前一天(即0周)和免疫后每兩周眼眶后靜脈叢采血一次，3 000 r/min(4℃)離心10 min，收集血清，－20℃保存備用，連續采集10次。

表1 動物分組與免疫

1.5 大鼠血清睪酮檢測 采用碘［125I］睪酮放射免疫分析法，由北京北方生物技術研究所有限公司檢測。

1.6 間接ELISA方法檢測大鼠血清GnRH抗體GnRH合成肽抗原以常規方法包被，隨后以2%BSA進行封閉，待檢的陰性和陽性血清分別倍比稀釋后加樣置37℃溫育，然后加HRP－羊抗大鼠二抗，置37℃溫育，洗滌后加TMB避光顯色，終止反應，室溫放置3 min后測量各孔吸光度值A450nm。繪制抗體滴度－A450nm曲線，計算樣品血清的抗體滴度。

1.7 睪丸外觀及組織學觀察 首次免疫后第18周，摘取SD大鼠兩側睪丸，測量睪丸的重量(除去附睪后)，然后置于10%福爾馬林緩沖液中固定，待用。常規脫水、透明、浸蠟進行組織包埋，切片，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，H.E.染色)后鏡檢。

2 結果與分析

2.1 免疫后小鼠安全評價 通過觀察，試驗期內所有免疫大鼠未出現異常癥狀。

2.2 大鼠血清抗體檢測結果 免疫及針對GnRH二聚體和GnRH并列二聚體抗原肽的抗體檢測結果表明，空白組大鼠血清的抗體滴度接近于零，而試驗組大鼠免疫后0～6周血清抗體滴度迅速上升，極顯著高于空白對照組(P＜0.01)，6周后趨于平穩，到免疫后第18周滴度在2.5以上。GnRH二聚體與GnRH并列二聚體兩次免疫的抗體滴度均高于單次免疫的抗體滴度，在免疫后第6、10周差異顯著(P＜0.05)。同時，免疫原性上GnRH二聚體優于GnRH并列二聚體，在免疫后第10、12、16、18周差異極顯著(P＜0.01)(圖1)。

2.3 大鼠血清睪酮檢測結果 免疫后第4周，Gn-RH二聚體抗原肽與GnRH并列二聚體抗原肽免疫組的血清睪酮與空白對照組的相比較，含量極顯著下降(P＜0.01)，首次免疫后第18周仍維持在較低水平(圖3)。如果以血清睪酮含量≤0.1 ng/mL作為免疫去勢效果顯著的判定標準，統計顯示，GnRH二聚體抗原肽兩次免疫試驗組5只大鼠去勢效果顯著、GnRH并列二聚體抗原肽兩次免疫試驗組4只大鼠去勢效果顯著，均多于GnRH二聚體抗原肽單次免疫(4只)和GnRH并列二聚體抗原肽單次免疫(3只)，與抗體檢測結果相符。

2.4 睪丸重量 睪丸稱重結果顯示，所有免疫組大鼠睪丸重量均極顯著低于空白對照組(P＜0.01)。C組大鼠睪丸重量為(0.33±0.13)g，均低于其他3個 免疫組，免疫組之間差異不顯著(P＞0.05)(表2)。

圖1 免疫后不同時期對照組、免疫組大鼠血清抗GnRH抗體滴度(log10)

圖2 免疫后不同時期空白對照組、免疫組大鼠血清中GnRH抗體滴度(log10)

圖3 免疫后不同時期對照組、免疫組大鼠血清中睪酮濃度(ng/mL)

表2 對照組、免疫組大鼠睪丸重量

2.5 睪丸組織學觀察 組織染色結果顯示，空白對照組(見中插彩版圖4 a、b)大鼠睪丸組織結構完整，曲細精管內的精原細胞逐漸向管腔發育，明顯分化成初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞和精子。免疫組C組的大鼠睪丸明顯萎縮，曲細精管管徑變小，精原細胞脫落，管腔中僅有少量精原細胞，無成熟精子細胞(見中插彩版圖4 c、d)。

3 討論

GnRH是下丘腦調節生殖系統的一種重要性激素，通過刺激垂體前葉分泌促黃體素(luteinizing hormone，LH)進而調節睪丸生長、發育。主動免疫可使動物產生GnRH抗體，中和內源性GnRH，導致下丘腦-垂體-睪丸軸功能的破壞，抑制LH和FSH促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)的釋放，使被免疫動物表現睪丸萎縮和重量減輕，血清睪酮水平下降，從而達到免疫去勢的效果［5］。

Brunius C等研究表明，GnRH疫苗可以誘導抗體的產生，通過間接ELISA方法檢測血清中GnRH抗體滴度［4，6］，可對免疫去勢效果評價提供參考。本研究中，使用GnRH二聚體及并列二聚體合成肽疫苗免疫的大鼠均可產生免疫應答，采用單次免疫和兩次免疫均能抑制睪丸生長，使睪丸重量極顯著減輕。與對照組相比，免疫組大鼠睪丸組織結構萎縮，曲精小管管徑變窄，內部精母細胞脫落，精子變少甚至缺如。因此，組織結構變化表明，GnRH合成肽疫苗與以往報道的GnRH疫苗一樣，能夠誘導免疫去勢。

睪酮主要由睪丸間質細胞合成和分泌，血清中睪酮濃度的高低可以間接反映去勢疫苗對睪丸機能及生殖性能的影響的程度［5，12－13］。本研究顯示，免疫后伴隨著GnRH抗體滴度的快速升高，血清中睪酮濃度迅速下降，免疫后第4周至第18周，GnRH二聚體及并列二聚體免疫組大鼠血清中睪酮濃度極顯著低于空白組，這一結果與以往報道的GnRH疫苗作用機制相符［7－9］。值得注意的是，免疫組B組B-2、B-3大鼠和免疫組C組C-1大鼠的睪酮水平沒有顯著下降，其抗體滴度也比組內其他大鼠的抗體滴度低，這一現象說明不同大鼠對GnRH肽抗原肽的免疫反應存在個體差異。因此，為提高該疫苗免疫的有效率，有必要通過改進疫苗的抗原結構、加入免疫增強劑(如蛋白脂質體或細胞表位［10－11］)、使用免疫佐劑或改變不同的劑型等措施來進一步增強疫苗的效力［14－15］。

本研究同時發現，合成肽抗原的分子量大小與抗原性強弱不呈正相關，GnRH二聚體抗原分子量小，但誘導產生的抗體滴度卻高于分子量大的Gn-RH并列二聚體，造成這一現象的原因可能是GnRH并列二聚體的抗原表位被覆蓋。

GnRH二聚體兩次主動免疫可以刺激大鼠機體免疫應答產生GnRH抗體，同時血清睪酮濃度下降至較低水平，并且能夠維持至少14周，說明該疫苗在免疫去勢研究上具有一定的價值。就動物飼養而言，有望用于控制寵物能育性、減少雄性動物攻擊性、去除動物性肉制品中膻味等的疫苗開發;就人類醫藥而言，可通過抑制性激素分泌而進行性激素依賴性疾病的治療，如前列腺癌和乳腺癌，以及子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、頷下腺體癌，垂體病癥和其他激素敏感性腫瘤等。

［1］ Han X F，Li J L，Zhou Y Q，etal．Active immunization with Gn-RH-tandem-dimer peptide in young male rats reduces serum reproductive hormone concentrations，testicular development and spermatogenesis［J］．Asian Journal of Andrology，2015，18(3):485-491．

［2］ Goodwin D，Simerska P，Chang C H，et al．Active immunisation of mice with GnRH lipopeptide vaccine candidates:Importance of T helper or multi-dimer GnRH epitope［J］．Bioorganic＆Medicinal Chemistry，2014，22(17):4 848-4 854．

［3］ 劉志南，楊漢春．公豬異味控制疫苗效力試驗［J］．中國獸醫雜志，2011，47(7):18-20．

［4］ Finstad C L，Wang C Y，Kowalski J，et al．Synthetic luteinizing hormone releasing hormone(LHRH)vaccine for effective androgen deprivation and its application to prostate cancer immunotherapy［J］．Vaccine，2004，22(9-10):1 300-1 313．

［5］ Ferro V A．Current advances in antifertility vaccines for fertility control and noncontraceptive applications［J］．Expert Review of Vaccines，2002，1(4):443-452．

［6］ Meloen R H，Turkstra J A，Lankhof H，et al．Efficient immunocastration ofmale piglets by immunoneutralization of GnRH using a new GnRH-like peptide［J］．Vaccine，1994，12(8):741-746．

［7］ Ferro V A，Harvey M J，Colston A，et al．Part II:influence ofdimerization ofa modified GnRH-Ipeptide sequence on a male antifertility vaccine［J］．American Journalof Reproductive Immunology，2002，48(6):372-380．

［8］ Turkstra J A，Oonk H B，Schaaper W M，et al．The role ofthe individual amino acids of a GnRH-tandem-dimer peptide used as an antigen for immunocastration of male piglets determined with systematic alanine replacements［J］．Vaccine，2001，20(3-4):406-412．

［9］ Talwar C P．Vaccines and passive immunological approaches for the control of fertility and hormone-dependent cancers［J］．Immunological Reviews，1999，171(1):173-192．

［10］ Talwar G P，Vyas H K，Purswani S，et al．Gonadotropin-releasing hormone/human chorionic gonadotropinβbased recombinant antibodies and vaccines［J］．Journal of Reproductive Immunology，2009，83(1-2):158-163．

［11］ Zamaratskaia G，Rydhmer L，Andersson H K，et al．Long-term effect of vaccination against gonadotropin-releasing hormone， using ImprovacTM，on hormonal profile and behaviour ofmale pigs［J］．Animal Reproduction Science，2008，108(1-2):37-48．

［12］ Claus R，Rottner S，Rueckert C．Individualreturn to Leydig cell function after GnRH-immunization of boars［J］．Vaccine，2008，26(35):4 571-4 578．

［13］ Sáenz L，Neira-Carrillo A，Paredes R，et al．Chitosan formulations improve the immunogenicity of a GnRH-I peptide-based vaccine［J］．International Journal of Pharmaceutics，2008，369 (1-2):64-71．

［14］ Earl E R，Waterston M M，Aughey E，etal．Evaluation oftwo Gn-RH-I based vaccine formulations on the testes function of entire Suffolk cross ram lambs［J］．Vaccine，2006，24(16):3 172-3 183．

［15］ Zeng X Y，Turkstra J A，Meloen R H，etal．Active immunization against gonadotrophin-releasing hormone in Chinese male pigs:effects of dose on antibody titer，hormone levels and sexual development［J］．Animal Reproduction Science，2002，70(4):223-233．

Efficacy of Immunocastration Vaccines Composed of GnRH-dimer or GnRH-tandem-dimer Peptides in Rats

CHEN Wen-juan1，WEI Bing1，LV Chuan-zhong2，REN Dong-xing2，CHEN Geng2，FU Xu-bin2
(1．College of Animal Science and Animal Medicine，Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China;2．Tianjin Ringpu Bio-Technology Co.，Ltd.，Tianjin 300308，China)

This study was performed to evaluate the castration efficacies of GnRH-dimer and GnRH-tandem-dimer peptide vaccines in male SD rats by single and double immunization．GnRH-dimer and GnRH-tandem-dimer peptides were prepared as emulsion vaccines．The testosterone concentration and GnRH antibodies in the sera，weight of testes and histological structural changes were observed．The results showed that in immunization groups，GnRH-dimer and GnRH-tandem-dimer peptide vaccines both induced higher titer anti-GnRH antibodies(P＜0．01)．The antibody titers of double immunization group were significautly higher than those of single immunization group(P＜0．05)．In the GnRH-dimer immunized group，the titers of anti-GnRH antibodies were higher than those immunized with GnRH-tandem-dimer vaccine(P＜0．05)．Serum testosterone and testis weights indicated that the concentrations in all immunization groups were lower than those of control group(P＜0．01)．Significantly，in the groups which were immunized twice，the serum testosterone of 5 rats in Gn RH-dimer group and 4 rats in Gn RH-tandem-dimer group was even decreased to be undetectable．However，the corresponding number was 4 and 3 when the rats were immunized once with the respective vaccine．Meanwhile，the testes were observed atrophy in tissue structure as well as a narrowing of the internal diameter of seminiferous tubule，shedding of internal spermatocyte and less or even no sperm．Gn RH dimer vaccine and Gn RH-tandem-dimer vaccine respectively have significant effect of immunocastration in rats．The effect of double immunization is better，and GnRH-dimer peptide is more promising than Gn RH-tandem-dimer peptide as a vaccine candidate．

Immunocastration;GnRH-dimer;GnRH-tandem-dimer;Immunization;Synthetic peptide vaccine

FU Xu-Bin

2017-02-27

國家科學技術部資助項目(2014DFA31180)

陳文娟(1991-)，女，碩士生，研究方向為預防獸醫學，E-mail:cwj128534@163．com

付旭彬，E-mail:fxb@ringpu．com

S852．4

A

0529-6005(2017)06-0014-04