寧夏不同綿羊品種中綿羊肺炎支原體的調查

謝秀蘭，額爾和花，黎 帥，馬小明，黎玉瓊，李穎康

(1．寧夏農林科學院動物科學研究所，寧夏 銀川 750002;2．寧夏大學新華學院，寧夏 銀川 750021)

寧夏不同綿羊品種中綿羊肺炎支原體的調查

謝秀蘭1，額爾和花1，黎 帥2，馬小明1，黎玉瓊1，李穎康1

(1．寧夏農林科學院動物科學研究所，寧夏 銀川 750002;2．寧夏大學新華學院，寧夏 銀川 750021)

為了解綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae)在不同品種綿羊中的感染情況，項目采集寧夏鹽池、平羅兩地的4個綿羊品種(灘羊、陶寒雜、杜寒雜和灘寒雜)的鼻拭子標本403份，提取DNA并用綿羊肺炎支原體特異性PCR進行檢測，統計不同品種、年齡段綿羊體內綿羊肺炎支原體的檢出情況。結果表明，灘羊、陶寒雜、杜寒雜和灘寒雜的綿羊肺炎支原體的檢出率依次為52．0%、83．0%、75．5%和85．7%;灘羊在3月齡以下及8月齡以上的檢出率最低，分別為24．2%和34．4%，3月齡至8月齡的檢出率為94．3%;陶寒雜、灘寒雜在各年齡段的檢出率均在74．0%以上;杜寒雜3月齡以下的檢出率為56．3%，3月齡以上的檢出率在82．0%以上。結果表明，寧夏地區規模化飼養的綿羊中，綿羊肺炎支原體廣泛存在，較灘羊而言，其他雜交品種羊更易感染綿羊肺炎支原體。

寧夏地區;灘羊;綿羊肺炎支原體;PCR

綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae)引起綿羊和山羊的非典型性肺炎，該病呈急性或慢性經過，病死率一般為15%～30%，有時高達60%～80%［1-2］。有研究表明，由綿羊肺炎支原體引起的肺炎在不同綿羊品種中的發病率不一［3-4］。寧夏地區主要飼養灘羊、小尾寒羊、蒙古羊、薩福克羊、特克塞爾羊、杜泊羊及以上品種雜交產生的雜種羊，綿羊支原體性肺炎是該地區的高發病。為了進一步分析綿羊肺炎支原體在寧夏不同綿羊品種中的感染情況，本試驗應用PCR方法對灘羊及雜交羊中綿羊肺炎支原體感染情況進行了調查，旨在為進一步分析該病原對宿主感染的差異，以及制定有效的防制措施提供有用的信息。

1 材料

1．1 樣本 隨機采集寧夏鹽池、平羅兩地的灘羊和雜交羊(灘寒雜、杜寒雜、陶寒雜)的鼻拭子標本，每個群體分3個年齡段(3月齡以下，3－8月齡，大于8月齡)，采集33～35例，共403份。鼻拭子標本浸入無菌生理鹽水中，4℃保存。

1．2 菌株 綿羊肺炎支原體標準株Y98由中國農業科學院蘭州獸醫研究所逯忠新、儲岳峰老師惠贈。

1．3 試劑與儀器 2×Taq PCR Master Mix、DL-2 000、Marker I、細菌基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產品;由中國農業科學院蘭州獸醫研究所忠新、儲岳鋒贈送。梯度 PCR儀(T100)，凝膠成像系統(Gel DocXR+)，均購自美國Bio-rad公司。

2 方法

2．1 核酸提取 將鼻拭子標本在生理鹽水中反復擠壓，吸取上清液用于DNA提取。采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作步驟按說明書進行，提取的基因組DNA溶于80μL TE溶液中，－20℃ 保存。

2．2 綿羊肺炎支原體的PCR檢測 參照文獻［5］，合成引物LMF:5'-TGAACGGAATATGTTAGCTT-3'; LMR:5'GACTTCATCCTGCACTCTGT-3'，該引物特異性擴增綿羊肺炎支原體的16S rRNA 361 bp片段。反應體系25μL:模板5μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，ddH2O 5．5μL。反應條件:94℃ 3 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，35 cycles;72℃10 min。取擴增產物5μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳。以綿羊肺炎支原體標準株Y98的基因組DNA為陽性對照，ddH2O為陰性對照，PCR檢測各綿羊群體。

3 結果

3．1 綿羊肺炎支原體的PCR檢測 PCR擴增樣品中的綿羊肺炎支原體，可獲得與預期大小相符的361 bp片段，結果見圖1。

圖1 綿羊肺炎支原體的PCR檢測M1:Marker I;1:Y98 DNA;2～15:nasal swabs DNA;16:Negative control;M2:DL-2 000

3．2 不同綿羊群體肺炎支原體的檢出率 從寧夏鹽池縣、平羅縣兩地的規模化養殖場采集到灘羊、陶寒雜、杜寒雜和灘寒雜4個綿羊品種的鼻腔拭子403份。綿羊肺炎支原體在各綿羊群體鼻拭子中均有很高的檢出率(介于52.0% ～85.7%)，灘羊的檢出率最低(52.0%)，灘寒雜最高(85.7%)。從年齡段來看，灘羊在 ＜3個月齡和＞8個月齡兩個年齡段檢出率為 24.2%和34.4%，3～8月齡為94.3%。其他3個綿羊雜交種的檢出率在各年齡段都較高(56.3% ～100.0%)，但均以3～8月齡為最高(87.1% ～100.0%)，結果見表1。

表1 不同綿羊群體肺炎支原體的PCR檢測率

4 討論

綿羊肺炎支原體是引起綿羊和山羊支原體性肺炎的主要病原之一［6-8］。臨床上健康羊的上呼吸道也能分離出綿羊肺炎支原體［9］。據張莉等［10］對河北省的6個種羊場綿羊、山羊血清學檢測發現，綿羊肺炎支原體的自然病例的陽性檢出率為84.2%;冷青文等［11］研究表明，人工圈養盤羊鼻拭子中綿羊肺炎支原體陽性率為29%，野生盤羊的陽性率高達66.7%;黃秀君等［12］研究表明，四川攀枝花地區山羊的綿羊肺炎支原體陽性率為 46.0%;Rong G等［13］對海南山羊血清標本檢測結果表明，綿羊肺炎支原體的陽性率為31.7%;Akwuobu C A等［14］對尼日利亞的綿羊和山羊鼻拭子中支原體的檢測結果發現，病羊和健康羊只，支原體的分離率分別為16.2%和29.1%，綿羊肺炎支原體在健康羊和有呼吸道癥狀的羊群中都具有很高的檢出率。本項目中，綿羊肺炎支原體在4個綿羊品種中的檢出率在52.0%－85.7%(注:待檢羊只無明顯呼吸道癥狀)，高的檢出率未必意味著高的發病率和死亡率，羊只的高帶菌率給該病的防控帶來了困難。

綿羊肺炎支原體具有宿主易感性差異。郭晗等［15］研究顯示，青海地區綿羊陽性率為30．4%，明顯高于山羊(19．7%)，提示綿羊對綿羊肺炎支原體的易感性要高于山羊。黃秀君［12］、沈文等［16］調查表明，盤羊雜交羊在感染支原體后表現出了典型的肺炎癥狀，而巴什拜羊癥狀輕微，表現出抗性;陶岳等［17］研究顯示，湖羊的發病率是20．4%，死亡率為18．2%，病死率達89．3%，同群細毛羊發病較湖羊少，波爾山羊對本病有一定的抵抗力;冷青文等［18］研究表明，巴什拜羊具有較為豐富的遺傳多樣性，HaeⅢBC為綿羊肺炎支原體抗性基因，HaeⅢDD為綿羊肺炎支原體的易感基因型;Pst IA和Pst IB、HaeⅢC分別是巴什拜羊綿羊肺炎支原體易感和抗性相關等位基因;何存利等［4］研究發現，寧夏羊場外來品種羊陽性率高于地方品種，1歲以上的羊只陽性率41．2%，明顯高于1歲以下羊只的17．4%，區外引進優良品種(母羊以小尾寒羊為主，公羊以陶塞特，薩福克等國外肉羊品種居多)，其抗病能力與本地羊相比明顯較弱。本試驗中，灘羊綿羊肺炎支原體的檢出率為52．0%(其中3月齡以下和＞8月齡的檢出率僅有24．2%和34．3%)，明顯低于雜交羊的檢出率，結合何存利的研究結果，表明灘羊這一地方品種羊對綿羊肺炎支原體具有較高抵抗力，而其抗綿羊肺炎支原體的機制還有待于深入研究。

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［18］ 冷青文，閆遵祥，李志遠，等．巴什拜羊OLA-DRB3基因多態性與綿羊肺炎支原體感染相關性研究［J］．中國畜牧雜志，2015，51(17):6-9，22．

The survey of Mycoplasma ovipneumoniae in different sheep breeds in Ningxia area

XIE Xiu-lan1，Eerhehua1，LI Shuai2，MA Xiao-ming1，LI Yu-qiong1，LI Ying-kang1
(1．Institute of Animal Science，Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Yinchuan 750002，China;2．Xinhua College of Ningxia University，Yinchuan 750021，China)

To study the infection rate of Mycoplasma ovipneumoniae in different sheep breeds，403 nasal swabs of4 sheep breeds (Tan sheep，Dorset-Small Tailed Han hybrids，Dubo-Small Tailed Han hybrids and Tan-Small Tailed Han hybrids)were collected from Yanchi and Pingluo counties in Ningxia area，DNA was extracted and gene of Mycoplasma ovipneumoniae was amplified by (PCR)，and positive rates of different sheep breeds and age stages were analyzed．The results showed that positive rates in Tan sheep，Dorset-Small Tailed Han hybrids，Dubo-Small Tailed Han hybrids and Tan-Small Tailed Han hybrids were 52.0%，83.0%，75.5%and 83.0%，respectively．Tan sheep had the lowest positive rate at age stages of under 3 months and older than 8 months，which were 24.2%and 34.4%，respectively．Positive rate at age stages of3 to 8 months was 94.3%;positive rates for all age stages of Dorset-Small Tailed Han hybrids and Tan-Small Tailed Han hybrids were above 74.0%．Positive rate of Dubo-Small Tailed Han hybrids under 3 months was 56.3%，and were above 82.0%at the age stages of more than 3 months．The results suggest that Mycoplasma ovipneumoniae pread in large scale sheep farms in Ningxia region and sheep hybrids was more susceptible to Mycoplasma ovipneumoniae than Tan sheep．

Ningxia area;Tan sheep;Mycoplasma ovipneumoniae;PCR

LI Ying-Kang

S85

A

0529-6005(2017)06-0011-03

2016-05-09

寧夏自然科學基金項目(NZ13127);中國農業科學院蘭州獸醫研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室開放基金資助(SKLVEB2012KFKT004)

謝秀蘭(1980- )，女(回族)，副研究員，碩士，主要從事動物病原分子生物學研究，E-mail:275896605@qq．com

李穎康，E-mail:1377730935@qq．com