牛呼吸道合胞體病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立

李艷婷，侯喜林

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牛呼吸道合胞體病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立

李艷婷，侯喜林

目的 建立牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)檢測方法。方法 以重組純化的BRSV-G蛋白免疫家兔和小鼠，制備抗G蛋白的多克隆抗體(PcAb)和單克隆抗體(MAb)，方陣滴定法優化DAS-ELISA方法抗體工作濃度及反應條件，并對其敏感性、特異性、符合率進行驗證。結果 獲得5株穩定分泌抗G蛋白MAb的雜交瘤細胞株，分泌抗體亞類均為IgG1型κ鏈，Western blot、IFA試驗表明PcAb和MAb均與G蛋白和BRSV發生特異性反應，MAb作為捕獲抗體的最佳包被濃度為2.5 μg/mL，PcAb作為檢測抗體最佳工作濃度為5 μg/mL，判定臨界值為0.22，最低檢測限為1.43 μg/mL，批內和批間重復性試驗變異系數均小于10%，與常引起牛呼吸道疾病的幾種病原均無交叉反應，與RT-PCR的敏感性、特異性、符合率分別為92.0%、100%、95.6%。結論 建立的檢測BRSV的DAS-ELISA方法可用于臨床樣品的大規模檢測,為BRSV疫情的監測和快速診斷奠定了基礎。

牛呼吸道合胞體病毒；G蛋白；多克隆抗體；單克隆抗體；DAS-ELISA

牛呼吸道合胞體病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)是引起犢牛呼吸道疾病的主要病原[1]。BRSV感染引起犢牛的高發病率和高死亡率，給養牛業造成了巨大的經濟損失[2]。自2007年王紅等[3]首次從黑龍江省某牛場成功分離出牛呼吸道合胞體病毒以來，之后我國多個省份陸續報道檢出BRSV病毒[4]，證明BRSV病毒已在我國普遍存在。牛是BRSV的天然宿主且感染率非常高，牛群中血清陽性率可達30%～70%，BRSV感染可引起60%～80%的發病率，20%的死亡率[5]。隨著我國集約化的養殖，需不斷從國外進口優質犢牛，而我國尚未將BRSV列入檢疫范圍[6]，有可能從有該病國家引進帶毒的牛，嚴重制約我國養牛業的發展，因此建立有效地檢測方法對于我國BRSV感染的快速診斷和科學防治具有重要意義。

牛呼吸道合胞體病毒為有囊膜，非節段負鏈RNA病毒，屬于副粘病毒科肺病毒屬，BRSV RNA基因編碼11種蛋白[7]，其中G蛋白促進BRSV病毒與宿主的結合，是主要的保護性抗原，能夠誘導病毒中和抗體的產生[8]。本研究基于馮軍科等[9]對BRSV G蛋白的截短與表達的基礎上，利用有抗原性和特異性的一段基因表達的蛋白進行免疫新西蘭大白兔和BABL/c小鼠，分別制備抗G蛋白的多克隆抗體和單克隆抗體，建立檢測BRSV雙抗體夾心ELISA檢測方法，可為臨床診斷提供簡便快速的檢測工具。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 His-Binding-resin為上海點創生物科技有限公司產品；RPMI-1640培養基為HyClone產品；雙抗為Biosharp產品；胎牛血清為GIBCO產品；BCA蛋白濃度測定試劑盒、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、聚乙二醇融合劑(PEG1450)、HAT、HT均為Sigma產品；單克隆抗體亞類鑒定試劑盒為SouthernBiotech產品；Hi Trap Protein G親和層析柱為GE公司產品；HRP-羊抗鼠IgG為博奧森產品。

1.2 病毒、細胞及實驗動物 BRSV HJ株由黑龍江八一農墾大學預防獸醫實驗室分離鑒定；牛輪狀病毒(BCV)、牛冠狀病毒(BRV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)均由本研究室保存；牛鼻拭子樣品采自黑龍江某規模化養殖場；SP2/0細胞為本研究室保存；清潔級體質量1.5 kg～2.0 kg新西蘭大白兔和6～8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠購自哈爾濱華興家兔養殖基地。

1.3 重組蛋白的制備及抗體制備

1.3.1 重組G蛋白的制備 將構建的pET30a-G重組質粒轉化至大腸桿菌BL21感受態細胞，涂布于LB/Kan+平板，37 ℃培養過夜，挑取陽性克隆接種于含50 μg/mL Kan+的LB液體培養基中，37 ℃ 180 r/min振蕩培養12～14 h。按照1∶100的比例將菌液加入到含Kan+的LB液體培養中，37 ℃ 180 r/min振蕩培養至OD600值達到0.3～0.4時，取1 mL作為對照，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續振蕩培養，分別在誘導1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h 后各取1 mL菌液，12 000 r/min離心2 min，收集菌體沉淀加入上樣緩沖液進行SDS-PAGE電泳，檢測蛋白表達量，按照His-Binding-resin說明書純化重組G蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定純化的重組蛋白濃度，分裝，-80 ℃保存備用。

1.3.2 多克隆抗體的制備 取純化后的重組蛋白2 mg，與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后皮下多點注射新西蘭大白兔。15 d后，與首免相同劑量的抗原和等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化，皮下多點注射。30 d后，與二免相同的劑量及接種方式進行接種。37 d后，靜脈單獨注射相同劑量的蛋白抗原進行加強免疫。加強免疫7 d后，心臟采血分離血清，Western blot和IFA鑒定其特異性，血清按照Protein G親和層析柱說明書方法進行抗體純化，分裝，-80 ℃保存備用。

1.3.3 單克隆抗體的制備 用純化的重組蛋白免疫6～8周齡雌性BALB/c小鼠，免疫劑量為100 μg/只，免疫程序參考文獻[10]，每次免疫間隔時間為2周，融合前3 d，檢測小鼠血清抗體效價，效價達到1∶10 000以上時，腹腔單獨注射50 μg抗原進行加強免疫。細胞融合后經過3次亞克隆純化陽性雜交瘤細胞，之后進行擴大培養和凍存。采用SouthernBiotech分型試劑盒對分泌的抗體進行分型，將雜交瘤細胞注射BALB/c小鼠腹腔進行腹水的采集，Western blot和IFA鑒定其特異性，按照Protein G親和層析柱說明書介紹的方法進行抗體純化，-80 ℃保存備用。

1.3.4 間接免疫熒光試驗 參照文獻[11]方法分別驗證多克隆抗體和5株單克隆抗體的特異性。

1.4 雙抗體夾心ELISA方法的建立

1.4.1 操作程序 用0.05 mmol/L pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋單克隆抗體，加入到96孔酶標板內，100 μL/孔，4 ℃包被過夜，次日取出包被好的ELISA板棄盡板中的液體，加入PBST溶液洗滌孔板，200 μL/孔，洗滌3次；每孔加入含5%脫脂乳的PBST溶液200 μL，37 ℃孵育封閉1 h，同樣的洗滌方法PBST溶液洗板3次；加入含有5%脫脂乳的PBST 稀釋后的純化的BRSV病毒液加入反應孔內，陰性對照為未感染BRSV病毒的Vero細胞培養液，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板3次；加入稀釋后的多克隆抗體，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板3次；加入HRP標記的羊抗兔IgG，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板3次；加入TMB底物顯色液，100 μL/孔，室溫避光顯色15 min；之后加入2 mol/L硫酸終止反應，50 μL/孔，測定OD450值，并計算P/N值。

1.4.2 單抗、多抗濃度篩選 按照方陣滴定法，分別將單克隆抗體稀釋至20 μg/mL、10 μg/mL、 5 μg/mL、 2.5 μg/mL、1.25 μg/mL，多克隆抗體稀釋至20 μg/mL、10 μg/mL、 5 μg/mL、 2.5 μg/mL，按照上述DAS-ELISA方法操作程序進行檢測純化BRSV病毒液，酶標儀讀取OD450值，計算P/N值。

1.4.3 反應條件的優化和包被條件的優化 在下列5種條件下用單克隆抗體包被酶標板：37 ℃封閉1 h、37 ℃封閉2 h 4 ℃過夜、37 ℃封閉1 h 4 ℃過夜、37 ℃封閉2 h 4 ℃過夜，分別進行DAS-ELISA反應，確定最適包被條件。

封閉液種類的優化 分別選擇5%脫脂奶粉、10%脫脂奶粉、5%BSA、10%犢牛血清、1%明膠作為封閉液，進行DAS-ELISA反應，計算P/N值，選擇最佳封閉液種類。

酶標二抗稀釋度的優化 將酶標二抗分別按照1∶1 000、 1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000比例進行稀釋，按照上述DAS-ELISA方法進行操作，通過分析結果確定最適酶標二抗稀釋度。

顯色時間的優化 將顯色時間分別設為5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，分別進行顯色測定OD450值，以確定最佳顯色時間。

1.4.5 DAS-ELISA特異性試驗 采用優化的DAS-ELISA方法檢測本實驗室保存的BRSV、BPIV3、IBRV和BCV 4種病毒，同時設BRSV標準陰、陽性對照及細胞培養液空白對照，檢測建立的DAS-ELISA方法的特異性。

1.4.6 DAS-ELISA重復性試驗 批內重復性試驗 以優化的DAS-ELISA方法在同一塊酶標板內檢測5份BRSV陽性樣品，每份重復3孔，計算批內重復性變異系數。

批間重復性試驗 用不同批次的單抗分別包被5塊酶標板，以同樣的方法在5塊酶標板上分別檢測上述5份BRSV陽性樣品，每份重復3孔，計算批間重復性變異系數。

1.4.7 靈敏性試驗 將純化的BRSV病毒定量后，按照1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000倍比稀釋，進行DAS-ELISA檢測，計算最低病毒檢出量。

1.4.8 DAS-ELISA與RT-PCR符合率試驗 將本實驗室保存的45份牛鼻拭子樣品，反復凍融3次，10 000 r/min離心5 min，取上清液，同時采用優化的DAS-ELISA檢測方法和RT-PCR對樣品進行檢測，比較2種方法的檢測結果，確定建立的DAS-ELISA與RT-PCR的符合率。

2 結 果

2.1 目的蛋白的表達及純化 將構建的pET30a-G重組質粒轉化至大腸桿菌BL21感受態細胞，對不同的誘導時間進行SDS-PAGE分析，可見最佳誘導時間為4 h，目的蛋白大小約為36 kD (圖1)，與預期大小相符。用His-Binding-resin對表達產物進行純化，BCA試劑盒檢測純化后的蛋白濃度為2 mg/mL左右。

1：未誘導的 2：誘導的pET-30a;3～8：經IPTG 誘導后1～6 h表達產物; M：低分子量蛋白Marker1: pET-30a-G without inducing by IPTG; 2: pET-30a;3-8: Expressed products induced by IPTG from 1 to 6 h respectively; M: Protein molecular weight marker.圖1 不同誘導時間表達產物SDS-PAGE鑒定結果Fig.1 SDS-PAGE analysis of the expression products of different induction time

1：裂解物上清;2：純化后的表達產物;M：低分子量蛋白Marker1: Supernatant of lysis; 2: The protein after purification; M: Protein molecular weight marker圖2 表達產物純化結果Fig.2 Purification of the expressed protein

2.2 抗體的純化鑒定 用rProteinG親和層析柱對采集的兔血清進行純化，并測定純化后的濃度，SDS-PAGE電泳分析可見在55 kD和24 kD有特異性條帶(圖3)，因多克隆抗體為針對不同抗原表位的混合抗體，所以24 kD左右條帶呈現均勻彌散狀，純化后濃度為1.3 mg/mL。

小鼠腹腔注射陽性雜交瘤細胞誘生腹水，用rProteinG親和層析柱進行純化，進行SDS-PAGE分析，55 kD和24 kD處出現兩條特異性條帶(圖4)，分別為重鏈和輕鏈。BCA試劑盒測定純化單克隆抗體濃度，5株單克隆抗體濃度分別為2.1 mg/mL、1.9 mg/mL、 1.7 mg/mL、2.0 mg/mL、1.6 mg/mL。

1：純化的多克隆抗體；M：低分子量蛋白Marker 1: Purified PcAb; M: Protein Molecular Weight Maker 圖3 多克隆抗體純化結果Fig.3 Results of the PcAb after purification

1-5：分別為1E3、2B4、3F6、4B8、5F7腹水純化SDS-PAGE結果; M：低分子量蛋白Marker 1-5：The results of 1E3，2B4，3F6，4B8，5F7 SDS-PAGE analysis of purified ascites; M: Protein molecular maker 圖4 單克隆抗體純化結果Fig.4 Results of the mAb after purification

2.3 抗體Western blot檢測 將純化的重組G蛋白經SDS-PAGE電泳轉膜后，以制備的多克隆抗體作為一抗，與酶標二抗結合，DAB顯色。可見36 kD處有特異性條帶(圖5)，與陰性血清無反應，表明抗原和抗體能夠很好地結合。

Western blot對5株單抗的特異性進行鑒定，結果顯示，在36 kD處出現特異性條帶(圖6)，而SP2/0細胞上清不能與目的蛋白發生特異性結合。

1,2：多克隆抗體；3：陰性對照；M：低分子量蛋白Marker 1,2: PcAb serum; 3: Negative control; M: Protein molecular Maker圖5 多克隆抗體Western blot鑒定結果Fig.5 Results of the PcAb of Western blot

1～5：分別為1E3、2B4、3F6、4B8、5F7 雜交瘤細胞培養上清；6：SP2/0細胞培養上清；M：低分子量蛋白Marker 1-5: 1E3，2B4，3F6，4B8，5F7; 6: AP2/0; M: Protein molecular marker圖6 單克隆抗體Western blot鑒定結果Fig.6 Results of the mAb of Western blot

2.4 間接免疫熒光檢測 分別將多克隆抗體和5株單克隆抗體進行間接免疫熒光檢測，檢測結果顯示多克隆抗體和5株單克隆抗體均與感染BRSV的Vero細胞發生特異性反應，陰性對照無熒光反應(圖7)。

A：多克隆抗體；B～F.1E3、2B4、3F6、4B8、5F7；G：陰性兔血清；H：SP2/0細胞培養上清A: PcAb; B-F: 1E3，2B4，3F6，4B8，5F7; G: Negative rabbits serum; H: SP2/0.圖7 單克隆抗體、多克隆抗體間接免疫熒光鑒定結果Fig.7 IFA identification of MAbs and PcAb reacted with BRSV

2.5 單抗、多抗最佳工作條件的確定 通過方陣滴定試驗測定結果，可見當單抗最佳包被濃度為2.5 μg/mL，多抗最佳工作濃度為5 μg/mL時P/N值最大(表1)。

表1 單抗多抗最適工作濃度的確定

Tab.1 Determination of the optimal concentration of MAb and PAb

多抗工作濃度(μg/mL)ConcentrationofPcAb單抗包被濃度(μg/mL)ConcentrationofmAb201052．51．2520+2．8492．7822．7212．6032．402-0．3530．2980．2560．2350．203P/N8．0719．33610．62911．07711．83310+2．7962．6972．6442．5672．464-0．3400．2810．2050．2020．192P/N8．2249．59812．89812．70612．8315+2．6082．5672．5262．4452．133-0．3150．2630．1910．1760．165P/N7．9629．76013．22513．89212．922．5+2．5632．4792．4572．1421．928-0．2910．2560．1880．1640．153P/N8．8089．68413．06913．06112．601

注： + ：陽性；- :陰性

Note：“+”means positive; “-”means negative

分別對包被條件、封閉液種類、酶標二抗濃度、及顯色時間等條件進行優化。結果顯示，最佳包被條件為4 ℃過夜，最佳封閉液為5%脫脂乳，最佳酶標二抗稀釋度為1∶5 000，最佳顯色時間為20 min(圖8～圖11)。

圖8 最佳包被條件的選擇Fig.8 Optimization temperature and time of coating antibody

圖10 最佳酶標二抗稀釋度的選擇Fig.10 Optimization dilution of enzyme-labeled antibody

圖9 最佳封閉液的選擇Fig.9 Selection for optimal blocking reagents

圖11 最佳顯色時間的選擇Fig.11 Determination of substrate optimal reaction time

2.8 特異性試驗 試驗結果表明，建立的DAS-ELISA方法與BCV、BRV、IBRV以及BPIV3均無交叉反應(表2)，表明該方法特異性良好。

2.9 重復性試驗 對5份陽性樣品分別進行批內重復性試驗和批間重復性試驗，試驗結果表明批內重復性試驗變異系數為3.79%～4.12%，批間重復性試驗變異系數為2.96%～6.55%，變異系數均小于10%(表3)，表明建立的DAS-ELISA方法重復性良好。

2.10 靈敏性試驗 用建立的DAS-ELISA法檢測倍比稀釋后的病毒液，結果表明隨著稀釋度的增大其OD450值呈線性下降，當稀釋度為1∶32 000(病毒含量1.43 μg/mL)時，結果為陽性，而當稀釋度為1∶64 000(病毒含量0.71 μg/mL)時，結果為陰性(表4)。表明建立的DAS-ELISA法最低檢測量為1.43 μg/mL，具有較高的靈敏度。

表2 雙抗體夾心ELISA方法特異性試驗

Tab.2 Result of specific test for DAS-ELISA

待測樣品SamplesBRSVBCVBRVIBRVBPIV3OD4502．3980．1640．1820．1920．127P/N13．5711．3151．2451．3021．073S0．0180．0210．0230．0190．022結果判定Result+----

注： + ：陽性；- :陰性

Note：“+”means positive; “-”means negative

表3 DAS-ELISA方法重復性試驗

Tab.3 Repeatability assay for DAS-ELISA

樣品Sampleno．批間重復Introbatch批內重復Interbatchx±SCVx±SCV12．431±0．0214．052．397±0．0203．9322．423±0．0223．932．413±0．0224．0732．392±0．0173．862．425±0．0196．5542．386±0．0194．122．419±0．0233．7452．296±0．0153．792．422±0．0172．96

表4 DAS-ELISA法靈敏性試驗結果

Tab.4 Sensitivity test results of DAS-ELISA

BRSV稀釋倍數DilutionofBRSV病毒含量(μg/mL)ConcentrationsofthevirusOD450ValueofOD450P/N值ValueofP/N標準差S結果Result1∶100045．762．57714．150．020+1∶200022．882．32512．770．021+1∶400011．442．10411．560．019+1∶80005．721．5278．3900．015+1∶160002．861．0315．6640．018+1∶320001．430．4932．7080．016+1∶640000．710．2011．1040．014-空白對照0．000．182-

注： + ：陽性；- ：陰性

Note：“+”means positive; “-”means negative

2.11 符合率試驗 45份疑似BRSV感染的牛鼻拭子同時使用DAS-ELISA檢測方法和RT-PCR檢測方法進行檢測，結果見表5。在DAS-ELISA中，23份樣品被確定為陽性，在RT-PCR中，25份樣品被確定為陽性，兩種方法的敏感性、特異性、符合率分別為92.0%、100%、95.6%。

表5 DAS-ELISA方法與RT-PCR方法符合率結果

Tab.5 The coincidence rate of DAS-ELISA method and RT-PCR method

RT?PCR檢測結果RT?PCRtestresultsDAS?ELISA檢測結果DAS?ELISAtestresults陽性陰性總數陽性23225陰性02020總數232245

3 討 論

近年來，隨著我國養牛業的不斷發展，需不斷地從國外引進優質奶牛，而我國未將BRSV列入檢疫范圍，市場上也無商品化疫苗，因此及時檢測出BRSV病毒，盡早淘汰BRSV陽性牛，對我國養牛業的發展意義重大。目前國內外報道的牛呼吸道合胞體病毒的診斷方法主要有病毒的分離鑒定、血清中和實驗、補體結合實驗、免疫熒光檢測、RT-PCR方法等，而病毒的分離鑒定作為病毒檢測的“黃金標準”，但病毒分離周期長，成本高，因此不適合臨床樣品大批量的檢測，上述其他檢測方法均需專業設備、特殊試劑、專業人員，因此基層大規模檢測難以普及。有研究表明BRSV暴發后會出現很高的血清轉換可達22%～53%[12]，因此只檢測BRSV抗體會出現假陽性結果，因此抗原的檢測對于確定是否感染BRSV是必要的。而DAS-ELISA檢測方法是測定抗原的一種常用的方法，與普通ELISA不同之處為多加了一層抗體，因此提高了檢測的特異性[13]。

雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)方法在基層臨床大規模檢測中使用比較普及[14]，近年來我國學者分別對牛傳染性鼻氣管炎病毒[15-16]、牛皰疹病毒[17]、牛病毒性腹瀉病毒[18]建立了DAS-ELISA檢測方法，用該方法同IDEXX公司抗原檢測試劑盒和RT-PCR檢測同一批臨床樣品，符合率均很高，可用于臨床樣品的檢測。本實驗室曾成功建立了牛輪狀病毒DAS-ELISA檢測方法[19]和牛副流感病毒3型DAS-ELISA檢測方法[13]，經臨床樣品檢測該方法與RT-PCR試驗相比符合率分別為95%和94.6%，為臨床的檢測和開展病原學研究奠定了一定的基礎。而有關BRSV的DAS-ELISA檢測方法還未見報道，因此本研究在馮軍科等對BRSV G基因截短表達的基礎上選用具有抗原性的G1段基因進行表達，原核表達的蛋白制備的抗體滴度較高且具有較好的反應原性[19]，因此利用原核表達的G蛋白作為抗原制備兔抗G蛋白高免多克隆抗體和鼠抗G蛋白單克隆抗體，獲得5株分泌抗體亞類均為IgG1型κ鏈的單克隆細胞株，利用獲得的抗體進行建立檢測BRSV的DAS-ELISA檢測方法，因該方法具有較高的敏感性，選用同動物源的抗體會產生非特異性，因此選用1株單克隆抗體和多克隆抗體分別作為捕獲抗體和檢測抗體，大大的降低了非特異性，經不斷傳代和細胞凍存復蘇，間接ELISA檢測1E3雜交瘤細胞分泌抗體最為穩定，因此選擇1E3為捕獲抗體，多克隆抗體為檢測抗體。通過方陣滴定試驗對抗體的濃度進行摸索，確定單抗濃度2.5 μg/mL，多抗5 μg/mL時效果最好，并對包被條件、封閉液種類、酶標二抗稀釋度、顯色時間等進行了進一步的優化，提高了其敏感性，建立的DAS-ELISA方法與牛輪狀病毒、牛冠狀病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛副流感病毒3型無交叉反應，特異性良好，最低可檢出1.43 μg/mL BRSV病毒。用建立好的DAS-ELISA檢測方法檢測45份樣品，與RT-PCR方法的敏感性、特異性、符合率分別為92.0%、100%、95.6%。本研究建立的DAS-ELISA檢測方法準確度高、重復性好、敏感度高，能在短時間內直接檢測樣品中BRSV抗原，較其他檢測方法更為省時省力，適用于獸醫基層大批量樣本的檢測，為BRSV的流行病學調查和診斷提供了有效的技術手段。

[1] Taylor G，Wyld S，Valarcher JF，et al. Recombinant bovine respiratory syncytial virus with deletion of the SH gene induces increased apoptosis and pro-inflammatory cytokinesinvitro，and is attenuated and induces protective immunity in calves[J]. J General Virol，2014，95(6): 1244-1254. DOI: 10.1099/vir.0.064931-0

[2] Sarmiento-Silva RE，Nakamura-Lopez Y，Vaughan G. Epidemiology，molecular epidemiology and evolution of bovine respiratory syncytial virus[J]. Viruses，2012，4(12): 3452-3467. DOI: 10.3390/v4123452

[3] Wang H，Hou XL，Piao FZ. Isolation and identification of bovine respiratory syncytial virus[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2009，40(9): 1414-1419. (in Chinese)

王紅，侯喜林，樸范澤. 牛呼吸道合胞體病毒的分離鑒定[J]. 畜牧獸醫學報，2009，40(9): 1414-1419.

[4] Shi HF，Zhu YM，Gao YR，et al. Detection of bovine respiratory syncytial virus by a reverse transcriptase-nested-polymerase chain reaction in bovine clinical samples[J]. Chin J Pre Vet Med，2010，32(3): 238-240. (in Chinese)

史鴻飛，朱遠茂，高欲燃，等. 套式RT-PCR檢測牛呼吸道合胞體病毒的研究[J]. 中國預防獸醫學報，2010，32(3): 238-240.

[5] Ma L. Preparation of monoclonal antibody against nucleoprotein of bovine respiratory syncytial virus，and experimental infection of guinea pig with the virus[D]. Beijing: CAAS，2013. (in Chinese)

馬磊.牛呼吸道合胞體病毒單抗的制備和實驗感染豚鼠的研究[D].北京：中國農業科學院，2013.

[6] Ma L，Zhu YM，Cai H，et al. Prokaryotic expression and preparation of monoclonal antibody of the nucleoprotein of bovine respiratory syncytial virus (BRSV)[J]. J Chin Biotechnol，2012，32(12): 20-24. DOI: 10.13523/j.cb.20121204 (in Chinese)

馬磊,朱遠茂,蔡紅,等.牛呼吸道合胞體病毒核蛋白的表達及其單克隆抗體的制備[J].中國生物工程雜志，2012，32(12): 20-24.

[7] H?gglund S，Hu K，Blod?rn K，et al. Characterization of an experimental vaccine for bovine respiratory syncytial virus[J]. Clin Vaccine Immunol，2014，21(7): 997-1004. DOI: 10.1128/CVI.00162-14

[8] Brady RP，Topliff CL，Kelling CL.Invitroexpression of full-length and truncated bovine respiratory syncytial virus G proteins and their antibody responses in BALB/c mice[J]. Vaccine，2004，22(27/28): 3762-3768. DOI:10.1016/j.vaccine.2004.03.020

[9] Feng JK，Xue F，Li J. Expression and identification truncated glycoprote in G of bovine respiratory syncytial virus inEscherichiacoli[J]. J Chin Biotechnol，2008，28(12): 24-29. DOI: 10.13523/j.cb.20081205 (in Chinese)

馮軍科,薛飛,李嬌.牛呼吸道合胞體病毒G蛋白的截短表達與鑒定[J].中國生物工程雜志，2008，28(12): 24-29.

[10] Chen H，Ou Q，Tang Y，et al. Development and evaluation of a DAS-ELISA for rapid detection ofTembusuvirus using monoclonal antibodies against the envelope protein[J]. PLoS One，2014，9(5): e96366. DOI: 10.1371/journal.pone.0096366

[11] Yang Q，Zhang Q，Tang J，et al. Lipid rafts both in cellular membrane and viral envelope are critical for PRRSV efficient infection[J]. Virology，2015，484: 170-180. DOI: 10.1016/j.virol.2015.06.005

[12] Weng SG. Epidemic and diagnosis of bovine respiratory syncytial virus (BRSV)[J]. China Dairy Cattle，2013，8: 45-47. (in Chinese)

翁善鋼. 牛呼吸道合胞體病毒的流行與診斷[J]. 中國奶牛，2013，8: 45-47.

[13] Li LY，Li YT，Yu LY，et al. Establishment and evaluation of a double antibody sandwich ELISA for detecting bovine parainfluenza virus type 3[J]. Chin J Pre Vet Med，2016，38(2): 122-136.DOI: 10.3969/j.issn.1008-0589.2016.02.11(in Chinese)

李麗陽，李艷婷，余麗蕓，等.牛副流感病毒3型雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立[J]. 中國預防獸醫學報，2016，38(2): 122-136.

[14] Niu HM，Huang XM，Han KK，et al. Development of double antibody sandwich ELISA for detection of duck or goose Flavivirus[J]. JIA，2013，12(9): 1638-1643.

[15] Zhou YH. Identification of an antigen epitope on the glycoprotein with monoclonal antibody and establishment of a double antibody sandwich ELISA for detection for infectious bovine rhinotracheitis viru[D]．Beijing: CAAS，2015. (in Chinese)

周躍輝.牛傳染性鼻氣管炎病毒糖蛋白gD單抗制備及其抗原表位鑒定與雙抗夾心ELISA的建立[D].北京：中國農業科學院，2015.

[16] Ma H，Bian CZ，Wang YF，et al. Development and preliminary application of monoclonal antibody against IBRV gC and identification of its biological characteristic[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2013，44(10): 1637-1644. DOI: 10.11843/j.issn.0336-6964.2013.10.018 (in Chinese)

馬輝，邊傳周，王永芬，等. 牛傳染性鼻氣管炎病毒gC蛋白單克隆抗體的制備與初步應用[J]. 畜牧獸醫學報，2013，44(10): 1637-1644.

[17] Li YL. Development of monoclonal antibodies against BHV-1 gB and establishment of double-antibody sandwich ELISA method[D]. Yangzhou: Yangzhou University，2013. (in Chinese)

李艷莉.牛皰疹病毒Ⅰ型gB基因的單克隆抗體制備及雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立[D]. 揚州：揚州大學，2013.

[18] Li Z，Ma SQ，Chen WF，et al. Establishment and preliminary application of the sandwich ELISA method for quick detection of bovine viral diarrhea virus[J]. J Gansu Agr Univ，2012，47(3): 13-19. DOI: 10.13432/j.cnki.jgsau.2012.03.028 (in Chinese)

李倬，馬省強，陳文芳，等. 牛病毒性腹瀉病毒夾心ELISA快速檢測方法的建立與初步應用[J]. 甘肅農業大學學報，2012，47(3): 13-19.

[19] Hou MR. Isolation and identification of bovine rotavirus and establishment of double antibody sandwich ELISA[D]. Daqing: Heilongjiang Bayi Agricultural University，2011. (in Chinese)

侯美如. 牛輪狀病毒的分離鑒定及其雙抗體夾心ELISA方法建立[D]. 大慶：黑龍江八一農墾大學，2011.

[20] Cai L，Zhang H，Gao LD，et al. Cloning and expression of hantavirus nucleoprotein gene of Hunan03 and its immunogenicity[J]. Chin J Zoonoses，2016，32(08): 711-716. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.006 (in Chinese)

蔡亮，張紅，高立冬，等. 漢坦病毒Hunan03株S基因克隆、表達及核蛋白免疫原性分析[J]. 中國人獸共患病學報，2016，32(08): 711-716.

Establishment and evaluation of DAS-ELISA for detecting bovine respiratory syncytial virus

LI Yan-ting，HOU Xi-lin

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity，Daqing163319，China)

In order to develop a double antibody sandwich assay (DAS-ELISA) for detecting bovine respiratory syncytial virus (BRSV)，New Zealand white rabbits and BALB/c mice were immunized with the purified G protein as an antigen to prepare anti-G protein polyclonal and monoclonal antibodies. The antibody concentration and reaction conditions of DAS-ELISA were optimized by square titration，and its sensitivity，specificity，and coincidence rate were validated. Five hybridoma were stably secreting MAb which subclass belonged to IgG1κ. Western blot and IFA test showed that PcAb and MAb could react specifically with G protein and BRSV. The PcAb and MAb as the capture antibody and detection antibody respectively，and their optimal working concentrations were determined to be 2.5 μg/mL and 10 μg/mL，the critical value 0.22 and the detection limit of 1.43 μg/mL，batch，inter-assay coefficient of variation less than 10%. The DAS-ELISA had no cross-reaction with several pathogens which often caused bovine respiratory disease. When 45 nasal swabs of clinical samples were simultaneously detected by the DAS-ELISA and RT-PCR，the sensitivity，specificity and coincidence rate were 92.0%，100%，95.6%，respectively. It’s indicated that the established DAS-ELISA detection method can be used to detect a large number of clinical samples. It was the foundation of monitoring and quick diagnosis for BRSV.

bovine respiratory syncytial virus; G protein; polyclonal antibody; monoclonal antibody; DAS-ELISA

Hou Xi-lin，Email: xly_hou@163.com

黑龍江八一農墾大學研究生創新科研項目(No. YJSCX2016-Y18)和黑龍江省教育廳資助項目(No. 12521372)聯合資助

侯喜林，Email：xly_hou@163.com

黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.011

R373.1

A

1002-2694(2017)07-0628-09

2016-12-21 編輯：張智芳

Supported by the Graduate Student Innovation Research Project in Heilongjiang Bayi Agricultural University (No. YJSCX2016-Y18) and the Funded Projects by Department of Education in Heilongjiang Province (No. 12521372)