肺炎支原體CARDS毒素蛋白多表位拼接抗原的表達(dá)及鑒定

劉寶山，趙芝娜，趙雨杰，王桂珍

?

肺炎支原體CARDS毒素蛋白多表位拼接抗原的表達(dá)及鑒定

劉寶山1，趙芝娜2，趙雨杰3，王桂珍3

目的 探討肺炎支原體CARDS毒素蛋白多表位拼接抗原的免疫反應(yīng)活性。方法 對(duì)CARDS毒素蛋白的抗原表位進(jìn)行分析，選取10個(gè)重要的表位進(jìn)行拼接，反向翻譯后合成并克隆，插入pET28a表達(dá)載體構(gòu)建pET-CARDS表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入受體菌。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的多表位拼接CARDS蛋白使用6×His單克隆抗體和人陽(yáng)性血清進(jìn)行了免疫印跡的檢測(cè)。結(jié)果 CARDS毒素蛋白的多表位拼接抗原表達(dá)載體構(gòu)建成功，誘導(dǎo)后表達(dá)大小為30KDa的重組蛋白，Western blot測(cè)定其能與6×His單克隆抗體和人陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)。結(jié)論 本研究選取的CARDS毒素蛋白抗原表位具有較強(qiáng)的免疫活性，可為Mp感染的診斷提供新的候選抗原。

肺炎支原體；CARDS毒素蛋白；多表位拼接抗原；表達(dá)；鑒定

肺炎支原體(Mycoplasmapneumonia，Mp)是社區(qū)獲得性呼吸道感染的重要病原體，約占社區(qū)獲得性肺炎的10%～40%，并呈增加趨勢(shì)[1]。其不但引起呼吸系統(tǒng)炎癥，而且與哮喘的發(fā)病密切相關(guān)，并可引起廣泛多系統(tǒng)肺外并發(fā)癥[2-3]。

近年來(lái)，一種被稱(chēng)為社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征(community acquired respiratory distress syndrome，CARDS)毒素的抗原在Mp感染中的作用引起人們的關(guān)注。最新研究發(fā)現(xiàn)肺炎支原體毒力因子社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素(community acquired respiratory distress syndrome toxin，CARDS TX)是由MPN372基因編碼的591個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，主要分布于胞膜和胞質(zhì)，具有二核酸腺苷核糖轉(zhuǎn)移酶活性[4]，依靠膜聯(lián)蛋白A2結(jié)合真核細(xì)胞[5]，參與侵犯呼吸道等病理生理過(guò)程[6-7]，因而被認(rèn)為是Mp的一個(gè)重要毒力因子。

2015年司文等在使用重組CARDS毒素蛋白診斷肺炎支原體感染的血清學(xué)ELISA試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)其敏感性高于重組P1蛋白，可作為Mp感染診斷的新抗原[8]，但比市售試劑盒的敏感性低。推測(cè)這可能是因?yàn)槠浞肿恿看?約70 kD)，包被時(shí)分子結(jié)合數(shù)量少，一些抗原表位可能會(huì)被阻擋，從而導(dǎo)致敏感度下降。為了克服這個(gè)缺點(diǎn)，尋找更加有效的抗原位點(diǎn)，提高檢測(cè)的敏感性，本研究對(duì)其候選抗原表位進(jìn)行了拼接表達(dá)，為探討其抗原活性打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 pET28a(+)表達(dá)載體由本試驗(yàn)室保存；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)。

1.1.2 臨床標(biāo)本來(lái)源 臨床肺炎支原體感染患者血清收集于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，抗體效價(jià)大于1∶40 (富士瑞必歐株式會(huì)社生產(chǎn)的賽樂(lè)迪亞-麥可Ⅱ肺炎支原體抗體檢測(cè)試劑盒)。

1.2 方法

1.2.1 CARDS毒素蛋白基因的篩選 根據(jù) GenBank中CARDS毒素蛋白 (MPNE_0433)的基因序列 (CP002077.1)，應(yīng)用在線(xiàn)分析工具 TMHMM進(jìn)行分析，選取目標(biāo)抗原表位進(jìn)行連接，使用大腸桿菌偏好密碼子進(jìn)行反向翻譯后，交生工生物工程(上海)股份有限公司合成并克隆。

1.2.2 CARDS重組表達(dá)載體的構(gòu)建 提取克隆重組質(zhì)粒和pET表達(dá)載體質(zhì)粒，分別用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，回收CARDS拼接基因片段和線(xiàn)性pET28a載體，連接后轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)菌株。挑選克隆菌株進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，篩選得到 pET-CARDS陽(yáng)性菌株。

1.2.3 重組CARDS毒素蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) pET-CARDS陽(yáng)性菌株培養(yǎng)至OD600為0.5時(shí)，加入IPTG至1 μg/mL，誘導(dǎo) pET-CARDS陽(yáng)性菌株表達(dá)CARDS拼接蛋白，5 h后菌液采樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.2.4 免疫印跡鑒定 誘導(dǎo)菌和未誘導(dǎo)菌進(jìn)行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，分別使用6×His單克隆抗體和人肺炎支原體陽(yáng)性血清作為一抗，使用HRP標(biāo)記的蛋白G作為二抗進(jìn)行免疫印跡，鑒定CARDS拼接蛋白的表達(dá)及免疫活性。

2 結(jié) 果

2.1 CARDS毒素蛋白基因的篩選 采用生物學(xué)軟件DNAMAN分析得到CARDS毒素蛋白的抗原表位(表1)，選擇具有親水性的抗原表位(斜體加粗)，使用linker(灰色底紋)進(jìn)行連接，得到拼接蛋白序列：

將拼接蛋白和CARDS毒素蛋白經(jīng)SMART在線(xiàn)分析，表明兩個(gè)蛋白均含有Pfam: Pertussis _ S1結(jié)構(gòu)域，E-Value分別為4e-31和1.1e-126，具有高度的相似性。

然后采用大腸桿菌偏好密碼子進(jìn)行反向翻譯，組成588 bp大小的基因序列：

將序列兩端分別加上BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成并克隆。

表1 CARDS毒素蛋白的抗原表位分析列表(斜體加粗為選取的抗原表位)

Tab.1 Analysis of antigenic epitopes of CARDS protein (Italics bold is selected)

No．StartpositionSequenceEndposition14PVRFVYRVDL13265LREYVPE71374RRAYLYE804102RQRQVVF1085122ALRTSFA1286138PIAAANVRSAWLVDAVPVE?PGHAHHPAGRVVE1697180NPHYQEL1868194PWLPTPGIATPVHLSIPQAAS?VAD217續(xù)表No．StartpositionSequenceEndposition9223SASLSFACPD23210243PLDKCIA24911256NLQSLPQYASSVKE26912271EDTPVYLRG27913295NNVFLVEV30214306QKSSFPQTIFFWDVYQRICLKD32715329TGAQISLSLTAFTT34216344YAGQLKVHLSVSAVNA35917369QDSAITQFRVSSEL38218400QHDLYVCPLK40919414DLEELQIIVDECTTHAQFVTM43420437ASTFFVDVQL44621450WRGYYYTPQLSG46122471GQIFYDLKTSKIFFV48523490NVFFLHN49624533LTIPSVEG54025542NFRHIRCYAD55126553QQLKVII55927579EDKILVK585

2.2 pET-CARDS表達(dá)載體的構(gòu)建 構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，出現(xiàn)600 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。

M：DL2000 Marker；1：restriction enzyme analysis圖1 質(zhì)粒酶切Fig.1 Restriction enzyme analysis

2.3 重組CARDS毒素蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 重組陽(yáng)性菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后出現(xiàn)一條明顯的30 kD的蛋白條帶(圖2)，與預(yù)期重組蛋白大小一致，表明拼接蛋白得到表達(dá)。

M：Protein Marker；1：Uninduced bacteria；2：Induced bacteria圖2 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.2 Induced expression

2.4 表達(dá)蛋白的免疫印跡鑒定 用6×His單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡分析，出現(xiàn)特異性的條帶(圖3A)。用人肺炎支原體陽(yáng)性血清作為一抗進(jìn)行免疫分析，在30 kD處也出現(xiàn)特異性的條帶(圖3B)。

A：WB by 6 HIS monoclonal antibody；B：WB by Human positive serum M：Protein marker；1：Uninduced bacteria；2：Induced bacteria圖3 重組蛋白的免疫印跡Fig.3 Western-blot of rCARDS

3 討 論

Mp的CARDS 毒素蛋白由591個(gè)氨基酸構(gòu)成，其 N-末端為 ADP-核糖基化活化所必須，C-末端和完整的 CARDS毒素一樣有誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞空泡化 (Vacuolization)的作用[4]。因此認(rèn)為，CARDS毒素蛋白可能為Mp的毒力因子，參與Mp的增殖、接合，并與感染的持久化及呼吸道炎癥反應(yīng)有關(guān)。2011年P(guān)eters等在難治性哮喘患者的血清標(biāo)本檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，Mp陽(yáng)性組、持續(xù)陽(yáng)性組中 CARDS毒素和P1蛋白的IgM抗體顯著比Mp陰性組高，從而表明它們具有較好的免疫性，有希望能用來(lái)發(fā)展一種 Mp的診斷方法[9]。2013年Novella等檢測(cè)了相關(guān)肺炎患者支氣管灌洗液中的Mp CARDS毒素的核酸、蛋白及血清中的抗體，結(jié)果顯示，CARDS毒素DNA、蛋白及抗體的檢出率均高于P1蛋白，約40%的被檢者CARDS毒素分析陽(yáng)性[10]。

Kannan等在Mp感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，用重組CARDS毒素蛋白和P1黏附蛋白檢測(cè)感染小鼠血清中的抗體，兩種重組蛋白抗原檢測(cè)的抗體效價(jià)無(wú)明顯差異[2]。2015年司文等重組表達(dá)了CARDS毒素蛋白，對(duì)肺炎支原體感染血清的ELISA試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其敏感性高于重組P1蛋白，但檢測(cè)的敏感性仍低于商品試劑[8]。

為提高CARDS毒素蛋白作為包被抗原的敏感性，本研究將其候選抗原表位進(jìn)行了拼接，表達(dá)后可以和肺炎患者的陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，這提示其具有較好的反應(yīng)原性，可純化后進(jìn)行包被，比較敏感性的高低。

至于拼接蛋白的反應(yīng)原性是某個(gè)抗原表位的作用，還是某些抗原表位的共同作用，以及哪個(gè)抗原表位起主導(dǎo)作用，尚需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

[1] Li ZW，Xiao GW，Zhang GX，et al.Mycoplasmapneumoniaeinfection and drug resistance in children in Meizhou area from 2010 to 2014[J]. Chin J Zoonoses，2016，32(03): 306-311.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.019(in Chinese)

李舟文，肖光文，張國(guó)雄，等. 梅州地區(qū)2010-2014年兒童肺炎支原體感染及耐藥情況分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2016,32(03):306-311.

[2] Kannan TR，Krishnan M，Ramasamy K，et al. Functional mapping of community-acquired respiratory distress syndrome (CARDS) toxin ofMycoplasmapneumoniaedefines regions with ADP-ribosyltransferase，vacuolating and receptor-binding activities[J]. Mol Microbiol，2014，93(3): 568-581. DOI: 10.1111/mmi.12680

[3] Wang XM，Zheng DX，Liang SY，et al. Analysis of assays to community-acquiredMycoplasmapneumoniaeinfection in the elderly patients[J]. Chin J Zoonoses，2015，31(02): 189-190.DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2015.02.021 (in Chinese)

王希敏，鄭東旭，梁雙吟，等. 老年獲得性肺炎支原體感染的檢測(cè)與分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2015,31(02):189-190.

[4] Becker A，Kannan TR，Taylor AB，et al. Structure of CARDS toxin，a unique ADP-ribosylating and vacuolating cytotoxin fromMycoplasmapneumonia[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2015，112(16): 5165-5170. DOI: 10.1073/pnas.1420308112

[5] Somarajan SR，Al-Asadi F，Ramasamy K，et al. Annexin A2 mediatesMycoplasmapneumoniaecommunity-acquired respiratory distress syndrome toxin binding to eukaryotic cells[J]. MBio，2014，5(4): e01497-14. DOI: 10.1128/m Bio.01497-14

[6] TR Kannan OM.MycoplasmapneumoniaeCommunity Acquired Respiratory Distress Syndrome toxin expression reveals growth phase and infection-dependent regulation[J]. Mol Microbiol，2010，76(5): 1127-1141. DOI: 10.1111/j.1365-2958.2010.07092.x

[7] Kannan TR，Coalson JJ，Cagle M，et al. Synthesis and distribution of CARDS toxin duringMycoplasmapneumoniaeinfection in a murine model[J]. J Infect Dis，2011，204(10): 1596-1604. DOI: 10.1093/infdis/jir557

[8] Si W，Zhou SG，Liu BS，et al. Clinical application of recombinantMycoplasmapneumoniaeCARDS toxin protein in detection ofMycoplasmapneumoniae: A preliminary study[J]. Chin J Microbiol，2015(11): 1262-1265. (in Chinese)

司文，周世冠，劉寶山，等. 重組肺炎支原體CARDS毒素蛋白臨床檢測(cè)應(yīng)用的初步研究[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2015(11):1262-1265.

[9] Peters J，Singh H，Brooks EG，et al. Persistence of community-acquired respiratory distress syndrome toxin-producingMycoplasmapneumoniaein refractory asthma[J]. Chest，2011，140(2): 401-407. DOI: 10.1378/chest.11-0221

[10] Novella L，Sanz F，F(xiàn)ernández-Fabrellas E，et al. Differential characteristics of patients with mild acute respiratory distress syndrome due to community-acquired pneumonia admitted to icu[J]. Chest，2014，145 (3_MeetingAbstracts): 176A. DOI: 10.1378/chest.1775773

Expression and identification of recombinant chimeric CARDS ofMycoplasmapneumoniae

LIU Bao-shan1，ZHAO Zhi-na2，ZHAO Yu-jie3,WANG Gui-zhen3

(1.ShenyangAgricultureUniversity，Shenyang110866，China;2.ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110016，China;3.ChinaMedicalUniversity，Shenyang110013，China)

We expressed multi-epitope chimeric protein of CARDS toxin protein ofMycoplasmapneumonia(Mp) in prokaryotic cells，and purified and investigated its immunoreactivity. A recombinant multi-epitope chimeric gene including ten critical epitopes was connected by linker and cloned into prokaryotic expression vector pET-28a(+)，and transformed intoE.coliBL21(DE3) cells for expression under induction of IPTG. The antigenicity of expressed recombinant protein was identified with 6×His monoclonal antibody and human positive serum by Western blot. The recombinant expression vector pET-CARDS was constructed and the about 30 kDa recombinant chimeric protein expressed in BL21(DE3) successfully. Western blot analysis showed that it can react respectively with 6×His monoclonal antibodies and human positive serum. This study showed that the chimeric CARDS protein has an obvious immunoreactivity and a potential to be a new antigen for the diagnosis of Mp infection.

Mycoplasmapneumonia; CARDS toxin; chimeric; expression; identification

Wang Gui-zhen，Email: gzw004@126.com

遼寧省社會(huì)科學(xué)發(fā)展基金(No.20122225019)項(xiàng)目資助

王桂珍，Email:gzw004@126.com

1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，沈陽(yáng) 110866； 2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，沈陽(yáng) 110016； 3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，沈陽(yáng) 110013

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.003

R375

A

1002-2694(2017)07-0588-04

2016-06-29 編輯：張智芳

Supported by the Department of Science and Technology of Liaoning Province (No. 20122225019)