AMP依賴的蛋白激酶/叉頭轉錄因子O3a信號通路及氧化應激介導紫鉚因誘導人食管癌細胞凋亡作用的研究

陳少陽++++++岳宏林++++++劉旭

[摘要] 目的 探討紫鉚因（Butein）誘導人食管癌EC109細胞凋亡的作用及AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）/叉頭轉錄因子O3a（FOXO3a）信號通路、氧化應激在該過程中發揮的作用。 方法 常規培養EC109細胞，分別給予Butein處理，首先檢測EC109細胞的活力、遷移能力、氧化應激水平及凋亡指標Caspase 3的活性。采用Western blot法檢測細胞內AMPK、FOXO3a的磷酸化水平及凋亡調節蛋白Bim、Bcl2相關X蛋白（Bax）的表達水平。用Compound C阻斷AMPK后檢測相關指標。建立裸鼠皮下腫瘤模型，給予Butein和Compound C處理，檢測裸鼠體重和腫瘤體積。 結果 Butein處理后，細胞活力下降（P < 0.05）；細胞間距增加（P < 0.05）；Caspase 3活性、NADPH氧化酶活性、ROS含量升高（P < 0.05）；總GSH下降，提示凋亡增加、氧化應激增強；p-AMPK磷酸化水平、p-FOXO3a磷酸化水平升高（P < 0.05）；Bim、Bax表達升高（P < 0.05）；Compound C處理逆轉了這一過程。裸鼠皮下腫瘤檢測發現Butein抑制在體腫瘤增殖，阻斷AMPK可以逆轉該抑制作用。 結論 Butein能顯著促進食管癌EC109細胞凋亡。該作用可能是通過激活AMPK/FOXO3a信號通路來實現的。

[關鍵詞] 紫鉚因；食管癌；AMP依賴的蛋白激酶；叉頭蛋白轉錄因子O3a；氧化應激；凋亡

[中圖分類號] R735.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）06（c）-0025-05

[Abstract] Objective To investigate the effects of Butein on esophagus cancer EC109 cells and the role of AMP-activated protein kinase （AMPK）/forkhead class box O3a （FOXO3a） and oxidative stress in this process. Methods EC109 cell was routine cultured and given Butein， the cell vitality， migration ability， cellular oxidative stress level of EC109 cell and Caspase 3 activity were detected. The AMPK， FOXO3 aphosphorylation level and the expressions of Bim and Bax were detected by Western blot. After Compound C inhibit AMPK， related indicators were detected. The nude mice tumor bearing model was made， Butein and Compound C were given， the weight and tumor volume of nude mice were detected. Results After Butein treatment， cell vitality reduced， the distance between cell boundaries increased， ROS concentration and NADPH oxidase activity increased， total GSH level and Caspase 3 activity reduced （P < 0.05）； AMPKand FOXO3 aphosphorylation and cell apoptosis increased （P < 0.05）； Compound C treatment reversed this process. The nude mice tumor study showed that Butein inhibited the tumor growth and Compound C reversed this effect. Conclusion Butein can induce EC109 cell apoptosis， and this process may be mediated by activation of AMPK/FOXO3a and cellular oxidative stress.

[Key words] Butein； Esophagus cancer； AMP-activated protein kinase； Forkhead class box O3a； oxidative stress； Apoptosis

食管癌是消化系統的常見腫瘤，由于環境、飲食習慣等的差異，世界范圍內食管癌發病率差異很大[1]。我國食管癌高發，每年有近15萬人死于食管癌[2]。多數患者因吞咽困難就醫，然而此時腫瘤多已發生轉移，失去手術根治機會。因此食管癌的治療需要新的治療策略[3]。目前，祖國傳統醫學中藥材提取物的抗癌作用已成為研究熱點[4]，紫鉚因（3，4，2'，4'-四羥基查爾酮，Butein）是漆樹等植物來源的多酚類化合物。研究證實Butein對包括乳腺癌、肺癌、膀胱癌等多種腫瘤具有抑制和殺傷作用[5-7]，但Butein抗食管癌作用及機制尚不明確。AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）是生物能量代謝調節的關鍵分子，也是腫瘤生物學調控的核心分子，研究表明Butein對AMPK有明確的調控作用[8]。叉頭轉錄因子O3a（forkhead class box O3a，FOXO3a）是叉頭轉錄因子家族成員，在腫瘤細胞中介導多種促凋亡因子轉錄[9-13]。AMPK可調控FOXO3a的磷酸化水平[14-15]。本研究通過Butein作用于食管癌EC109細胞系，證實AMPK/FOXO3a信號通路是否介導Butein的抗食管癌作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人食管癌EC109細胞系購自中科院上海細胞庫。Butein、Compound C購自Sigma-Aldrich公司（美國）；抗p-FOXO3a抗體、抗FOXO3a抗體、抗Bim、抗Bax抗體購自Abcam公司（美國）；抗p-AMPK抗體、抗AMPK抗體購自cell signaling technology公司（美國）。裸鼠購自中國醫學科學院實驗動物中心，合格證號：SYXK（京）2013-0019。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及細胞處理 食管癌EC109細胞在完全培養基中常規培養，并置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中。置于37℃細胞培養箱中貼壁24 h，待細胞密度達到80%左右時換成無血清培養基處理12 h，然后給予相應處理。

1.2.2 細胞活力檢測 以每孔1×105的密度接種到96孔板。將細胞分為Control組、25 μmol/L But組、50 μmol/L But組。給予相應處理，CCK法檢測細胞活力。Butein的濃度和處理時間參考其他腫瘤中Butein相關研究及前期預實驗結果，50 μmol/L Butein對食管癌EC109細胞具有較為顯著的殺傷作用[16]。

1.2.3 細胞遷移能力檢測 在6孔板背面用Marker筆劃3條橫線，在孔內用200 μL的槍頭劃線。洗去漂浮細胞，繼續培養常規培養，24 h后測量細胞邊緣間距并記錄。

1.2.4 檢測ROS、總GSH含量和NADPH氧化酶含量及細胞Caspase 3活性

1.2.4.1 ROS檢測 向上清加入DCFH-DA探針，37℃孵育1 h，消化離心重懸后檢測細胞熒光強度。

1.2.4.2 GSH檢測 取50 μL細胞培養上清，加入400 μL試劑一，50 μL試劑二，混勻后于室溫靜置2 min，加入200 μL試劑三，30 s時檢測412 nm波長下的吸光度，為A1，靜置5 min后再次檢測，為A2，計算出總GSH含量。

1.2.4.3 NADPH氧化酶檢測 制備蛋白上清液，首先測定背景對照，進而檢測樣品總活性，最后檢測樣品非特異性活性計算可得NADPH氧化酶活性。

1.2.4.4 Caspase 3活性檢測 制備蛋白上清，取50 μL細胞裂解上清，加入50 μL 2×反應液，加入0.5 μL的DTT，加入5 μL Ac-DEVD-pNA，37℃孵育4 h后，于405 nm波長下檢測吸光度值。

1.3 Western blot

檢測p-AMPK、AMPK、p-FOXO3a、FOXO3a、Bim、Bax等蛋白的表達情況，所用抗體及濃度：p-AMPK、AMPK、p-FOXO3a、FOXO3a、Bim、Bax（1∶1500）、β-actin（1∶2000）。

1.4 裸鼠皮下腫瘤的建立及藥物處理

取對數期的EC109細胞，在每只裸鼠肩部皮下注射0.2 mL細胞液（1×107個腫瘤細胞），每天腹腔注射PBS、5 mg/kg Butein、5 mg/kg Butein+1 mg/kg Compound C。每3天稱重，測量腫瘤體積。第27天處死小鼠并收集腫瘤。

1.5 統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0對數據進行分析，正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Butein對食管癌細胞EC109細胞系的影響

CCK8染色結果顯示Butein處理后細胞活力顯著下降，與Control組相比，活力值分別下降到（70.3±4.6）%、（38.5±4.8）%，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 Butein對食管癌EC109細胞遷移能力的影響

Butein處理，24 h后檢測發現細胞間隙顯著增大，Butein處理組細胞間距增加到Control組的（144.0±8.4）%、（208.0±10.6）%，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖2。

2.3 Butein對凋亡相關蛋白Caspase 3活性和氧化應激指標NADPH氧化酶活性、活性氧自由基含量、總GSH含量的影響

25 μmol/L的Butein、50 μmol/L的Butein處理24 h后，與Control組相比，Caspase 3活性、NADPH氧化酶活性、ROS含量均升高；總GSH下降。提示凋亡增加、氧化應激增強，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖3。

2.4 Western blot檢測Butein處理后細胞內AMPK、FOXO3a磷酸化水平變化

25 μmol/L的Butein、50 μmol/L的Butein處理后，p-AMPK磷酸化水平升高；p-FOXO3a磷酸化水平升高；Bim、Bax表達升高；差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖4。提示Butein處理后AMPK和FOXO3a激活，凋亡增強。

2.5 Compound C抑制AMPK對Butein誘導的FOXO3a激活和細胞凋亡的影響

Compound C是AMPK分子的特異性阻斷劑，將細胞分為Control組、50 μmol/L的Butein處理組、50 μmol/L的Butein+5 μmol/L Compound C處理組。發現FOXO3a磷酸化水平分別為Control組的（248.0±16.4）%、（176.0±16.4）%；Bim分別為Control組的（182.5±14.3）%、（142.8±10.2）%；Bax分別為Control組的（251.2±19.1）%、（198.2±12.5）%；差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖5。提示Compound C處理一定程度上逆轉了Butein的抗EC109作用。

2.6 Butein及Compound C聯合處理對裸鼠在體腫瘤的影響

三組裸鼠體重差異無統計學意義（P > 0.05）。腫瘤體積分別為（915±39）、（440±34）、（581±38）mm3，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖6。可見Butein腹腔注射顯著降低了裸鼠皮下腫瘤色生長速度，而AMPK活性抑制劑Compound C處理后一定程度上逆轉了Butein的抗腫瘤作用。

3 討論

本研究體外實驗證實，Butein處理顯著抑制了EC109細胞增殖和遷移能力。氧化應激指標和凋亡指標檢測發現，Butein處理顯著激活了EC109細胞氧化應激，表現為GSH含量下降、ROS含量增加以及NADPH活性增強。凋亡檢測發現Butein處理上調了Caspase 3的活性、上調了凋亡相關蛋白Bim、Bax的表達。

AMPK在腫瘤發生、增殖、轉移等過程中扮演重要角色[17-18]。流行病學研究發現，AMPK下調與腫瘤發生關系密切，亦有研究發現，激活AMPK可以顯著抑制腫瘤細胞增殖，誘導其凋亡[19-20]。上述證據提示AMPK可能是腫瘤進展中的關鍵分子，調控其表達、活性可能是腫瘤治療的手段之一。本研究重點關注了Butein處理后AMPK的磷酸化水平。本研究給予EC109細胞梯度濃度的Butein處理后，發現AMPK的磷酸化水平劑量依賴地上調。FOXO3a是叉頭轉錄因子家族的成員，能介導多種促凋亡因子的轉錄。同時FOXO3a又是AMPK的磷酸化底物，本研究檢測了FOXO3a的磷酸化水平，發現Butein激活AMPK的同時，上調了FOXO3a的磷酸化水平。為了進一步明確AMPK在該過程中對FOXO3a的調控作用，本研究給予AMPK阻斷劑Compound C處理，發現抑制AMPK活性后，FOXO3a的磷酸化水平降低，Butein對細胞活性的抑制能力減弱。為了進一步驗證Butein的抗食管癌作用及AMPK/FOXO3a在其中發揮的作用，本研究建立了裸鼠皮下腫瘤模型，給予Butein和Compound C處理，發現Butein處理顯著降低了皮下腫瘤體積，而Butein聯合Compound C處理后腫瘤體積增大，提示抑制AMPK拮抗了Butein的抗腫瘤作用。

以上證據從離體、在體水平，以及正反兩個角度證實，Butein能顯著抑制食管癌EC109細胞的增殖、遷移能力，激活氧化應激，促進細胞凋亡。該作用可能是通過激活AMPK/FOXO3a信號通路來實現的。本研究進一步明確了Butein的抗食管癌作用，為進一步開發基于Butein的抗食管癌藥物及治療策略提供了理論參考。

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