硫酸酯化牡蠣多糖對(duì)3種腫瘤細(xì)胞抑制及凋亡的影響

趙冠華,佟長(zhǎng)青,李 偉,曲 敏

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連 116023)

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硫酸酯化牡蠣多糖對(duì)3種腫瘤細(xì)胞抑制及凋亡的影響

趙冠華,佟長(zhǎng)青,李 偉,曲 敏*

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連 116023)

采用氯磺酸-吡啶法制備得到硫酸酯化牡蠣多糖(SCGP),通過(guò)CCK-8法檢測(cè)其對(duì)人胃癌細(xì)胞AGS、人卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞活力的影響,并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明,SCGP對(duì)3種腫瘤細(xì)胞細(xì)胞活力有不同程度的抑制效應(yīng),其中對(duì)AGS細(xì)胞抑制效應(yīng)最明顯。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明,SCGP對(duì)AGS細(xì)胞有很明顯的促進(jìn)凋亡作用。本研究結(jié)果表明SCGP對(duì)AGS腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的抑制效應(yīng)。

牡蠣多糖,硫酸酯化,抗腫瘤,凋亡

牡蠣是全球最大養(yǎng)殖貝類,也是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類之一。牡蠣肉質(zhì)鮮美可口并且具有藥用價(jià)值,被稱為“海底牛奶”[1]。牡蠣多糖是牡蠣體內(nèi)重要的活性物質(zhì)之一,在抗腫瘤、抗疲勞、抗凝血和增強(qiáng)機(jī)體免疫等方面都具有較好的生物活性[2]。

將硫酸基團(tuán)引入到多糖的羥基上使其生物活性發(fā)生強(qiáng)烈的變化,能使多糖表現(xiàn)出其修飾前所沒(méi)有的生物活性[3]。硫酸酯化多糖具有抗腫瘤[4]、抗病毒[5]、抗凝血[6]、抗氧化[7]、增強(qiáng)免疫[8]等多種生物活性。其中其所具備的抗腫瘤能力更是引起廣泛的關(guān)注。但是硫酸酯化牡蠣多糖的抗腫瘤活性篩選研究并不多,楊靜峰[9]利用降解的硫酸酯化牡蠣多糖研究其對(duì)Hela細(xì)胞的影響,發(fā)現(xiàn)其對(duì)Hela細(xì)胞抑制作用并不明顯。高蒙蒙[10]研究了硫酸酯化牡蠣多糖對(duì)HL-60細(xì)胞和K562細(xì)胞有一定的抑制作用。其他硫酸多糖也大多具有抗腫瘤活性,Wang等[3]對(duì)硫酸酯化脫脂米糠多糖抑制HepG2細(xì)胞進(jìn)行研究,其具有較強(qiáng)的癌細(xì)胞抑制作用。Karnjanapratum等[8]研究3種礁膜硫酸多糖發(fā)現(xiàn)它們對(duì)AGS細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用。Zhang J[11]發(fā)現(xiàn)硫酸酯化黑靈芝多糖可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。Wei[12]研究發(fā)現(xiàn)紅芪多糖經(jīng)硫酸酯化后,抑制BGC-823細(xì)胞和A549細(xì)胞能力顯著增強(qiáng),并具有凋亡效果。Wang等[13]研究了硫酸化滸苔多糖抑制HepG2細(xì)胞可能的凋亡途徑。

本文對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期制備得到的粗牡蠣多糖[14]進(jìn)行硫酸酯化修飾,制備硫酸酯化牡蠣多糖(SCGP),以人胃癌細(xì)胞AGS、人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3和人肝癌細(xì)胞HepG2作為受試細(xì)胞,通過(guò)CCK-8法評(píng)價(jià)其抗腫瘤活性,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,以期為牡蠣的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗牡蠣多糖(CGP) 本實(shí)驗(yàn)室前期制備所得;氯磺酸、吡啶、N,N-二甲基酰胺(DMF)、硫酸鉀(K2SO4)、三氯乙酸(TCA)、氯化鋇(BaCl2)、溴化鉀(KBr)、葡萄糖胺(Gln) 美國(guó)Sigma公司;胎牛血清(FBS) 美國(guó)Hyclone公司;DMEM高糖、F12K、青霉素/鏈霉素(P/S) 美國(guó)Gibco公司;CCK-8檢測(cè)試劑盒 日本Dojindo公司;凋亡檢測(cè)Annexin V-APC-PI Apoptosis Kit試劑盒 天津三箭生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為分析純；人胃癌細(xì)胞AGS、人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3和人肝癌細(xì)胞HepG2 中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);AGS細(xì)胞和SK-OV-3細(xì)胞的培養(yǎng)基 F12K+10%胎牛血清(FBS)+1%青霉素/鏈霉素(P/S)+1%葡萄糖胺(Gln);HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)基 DMEM高糖+10%胎牛血清(FBS)+1%青霉素/鏈霉素(P/S)+1%葡萄糖胺(Gln)。

660-IR紅外光譜儀 美國(guó)Agilent公司;MuLTiSJAN MK3酶標(biāo)儀、Microcl 17R離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司;MCO-15AC 型CO2恒溫培養(yǎng)箱 日本SANYO公司;DMLLLED型倒置顯微鏡 德國(guó)Leica公司;Accuri C6流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 硫酸酯化牡蠣多糖(SCGP)的制備 牡蠣多糖的硫酸酯化采用氯磺酸-吡啶法[9]。向放置在冰水浴中,并帶有冷凝攪拌裝置的250 mL三頸燒瓶中加入50 mL吡啶,充分?jǐn)嚢韬?緩慢加入10 mL氯磺酸,反應(yīng)40 min,制得酯化試劑備用。稱取2.0 g前期制備的粗牡蠣多糖,溶于40 mL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中,充分?jǐn)嚢韬蠹尤氲窖b有酯化試劑的三頸燒瓶中,60 ℃水浴,攪拌3 h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫,加入20% NaOH溶液調(diào)至pH7.0。之后加入3倍體積的95%乙醇過(guò)夜,離心(8000 r/min,10 min)得沉淀。沉淀溶解于水中,透析3 d,真空冷凍干燥得到硫酸酯化修飾產(chǎn)物。

1.2.2 硫酸根含量的測(cè)定及紅外光譜(IR)分析 SCGP硫酸基含量的測(cè)定方法采用明膠-比濁法[15]。稱取樣品3 mg加入1 mL 1 mol/L鹽酸,100 ℃水解6 h,冷卻后揮發(fā)干燥,殘?jiān)儆? mL蒸餾水溶解。用硫酸鉀溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,以0.2 mL鹽酸溶液作為空白,分別加入三氯乙酸3.8 mL、氯化鋇-明膠溶液1.0 mL,室溫靜置15 min,OD360 nm測(cè)吸光值A(chǔ)1;以1.0 mL明膠溶液代替氯化鋇溶液,同法測(cè)吸光值A(chǔ)2;以硫酸基毫克數(shù)為橫坐標(biāo),縱坐標(biāo)為吸光值(A1-A2)。

紅外光譜分析:將CGP和SCGP分別與KBr混合研磨,壓片后在4000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描檢測(cè),以KBr為掃描背景。

1.2.3 體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用CCK-8法進(jìn)行測(cè)定SCGP對(duì)AGS細(xì)胞等三種腫瘤細(xì)胞存活率的影響。

SCGP多糖溶解于PBS,配成10 mg/mL的母液,培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。將細(xì)胞懸浮液接種于96孔培養(yǎng)板中,AGS細(xì)胞鋪板密度為8000/孔,SK-OV-3細(xì)胞和HepG2細(xì)胞鋪板密度為6000/孔,37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將SCGP加入細(xì)胞培養(yǎng)板中,使其終濃度分別為2、20、200 和1000 μg/mL,分別處理12、24、36、60 和84 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,混勻后培養(yǎng)箱中孵育2 h,以不含細(xì)胞、加入藥物的培養(yǎng)基作為空白組,測(cè)定450 nm處的OD值,按下列公式計(jì)算SCGP對(duì)細(xì)胞存活抑制率:

細(xì)胞存活抑制率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(空白組OD值-培養(yǎng)基OD值)×100

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡 將細(xì)胞懸浮液接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,AGS細(xì)胞和HepG2細(xì)胞接種量為1×105/孔,SK-OV-3細(xì)胞接種量為8×104個(gè)/孔,37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜,加入SCGP至終濃度達(dá)到1000 μg/mL,空白組不做處理,溶劑組加入等體積PBS,繼續(xù)培養(yǎng)96 h后,收樣檢測(cè)。用EP管分別收集各孔中的培養(yǎng)上清,4 ℃ 1000 r/min 離心5 min,收集培養(yǎng)上清中的細(xì)胞。同時(shí),用胰酶消化底面貼壁的細(xì)胞,4 ℃ 1000 r/min 離心5 min,收集細(xì)胞,與前面離心的細(xì)胞混合。PBS洗滌細(xì)胞2次,4 ℃ 1000 r/min 離心5 min,收集細(xì)胞。每個(gè)樣品用200 μL binding buffer重懸細(xì)胞,輕輕吹勻,加入藻藍(lán)蛋白(APC)混勻,再加入液體PI染液染色,20 ℃避光孵育20 min,上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCGP硫酸根含量及其紅外光譜(IR)結(jié)果

用明膠-比濁法測(cè)得SCGP硫酸根含量為28.96%,取代值(DS)為0.66。如圖1所示,牡蠣多糖CGP和SCGP的紅外光譜特征峰類似。與牡蠣多糖相比,SCGP在1257.35 cm-1處存在一個(gè)不同于牡蠣多糖的特征吸收峰,這個(gè)特征峰為>S=O伸縮振動(dòng)峰,說(shuō)明其發(fā)生了硫酸酯化反應(yīng)[16]。另外,SCGP在811 cm-1處有一強(qiáng)吸收,說(shuō)明硫酸基取代的空間構(gòu)象是平伏型[17]。

圖1 牡蠣多糖CGP與SCGP紅外光譜Fig.1 IR spectra of CGP and SCGP

2.2 SCGP對(duì)3種腫瘤細(xì)胞活力的抑制作用

由圖2a可知,SCGP對(duì)AGS細(xì)胞具有一定的抑制效果,除培養(yǎng)時(shí)間60 h抑制效果較之前有所下降外,其他時(shí)間點(diǎn)均呈現(xiàn)一定的時(shí)間與劑量依賴性。低濃度(2、20 μg/mL)時(shí),SCGP對(duì)AGS細(xì)胞活力的抑制活性不明顯,高濃度時(shí)抑制活性顯著。在濃度為1000 μg/mL,培養(yǎng)時(shí)間為84 h時(shí),SCGP對(duì)AGS細(xì)胞的抑制率為48.99%。由圖2b可知,SCGP在短時(shí)間、低濃度時(shí),對(duì)SK-OV-3細(xì)胞沒(méi)有明顯的抑制作用。當(dāng)SCGP濃度為1000 μg/mL,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,SK-OV-3抑制率逐漸提高,在培養(yǎng)時(shí)間36、60、84 h時(shí),抑制率分別為13.03%、16.48%、24.10%。由圖2(c)可知,SCGP在低濃度時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用,而SCGP濃度為1000 μg/mL,培養(yǎng)時(shí)間84 h時(shí),抑制率為29.42%。

圖2 SCGP對(duì)3種腫瘤細(xì)胞抑制率的影響Fig.2 Effect of SCGP on the inhibition rates of three kinds of carcinoma cell

由上可知,SCGP主要對(duì)AGS腫瘤細(xì)胞具有一定程度的抑制效果。SCGP對(duì)AGS細(xì)胞的抑制作用明顯比對(duì)SK-OV-3細(xì)胞和HepG2細(xì)胞強(qiáng),說(shuō)明AGS細(xì)胞對(duì)其更加敏感。研究表明不同的多糖對(duì)AGS細(xì)胞、SK-OV-3細(xì)胞和HepG2細(xì)胞抑制可能為直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、抑制腫瘤細(xì)胞的入侵和轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞途徑[18-21],推測(cè)SCGP可能對(duì)3種腫瘤細(xì)胞抑制機(jī)理有所不同。

2.3 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

用Annexin-V和PI染色法,在流式細(xì)胞儀檢測(cè)的圖3中,可分為四類:Q1象限為壞死細(xì)胞,其細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)不完整;Q2象限內(nèi)為凋亡晚期細(xì)胞,其細(xì)胞質(zhì)膜滲透受到損傷;Q3象限為凋亡早期細(xì)胞;Q4象限為正常活細(xì)胞。用Q2和Q3之和計(jì)算細(xì)胞凋亡率。由圖3可知,1000 μg/mL SCGP對(duì)AGS細(xì)胞處理96 h后,凋亡率從9.02%±0.39%上升到19.76%±0.27%(p<0.05),表明SCGP對(duì)AGS細(xì)胞有很明顯的促進(jìn)凋亡作用。1000 μg/mL SCGP對(duì)SK-OV-3細(xì)胞處理96 h后,凋亡率從17.52%±1.37%降到9.74%±0.09%(p<0.05),表明SCGP對(duì)SK-OV-3細(xì)胞有很明顯的抑制凋亡的作用。而1000 μg/mL SCGP對(duì)HepG2細(xì)胞處理96 h后影響變化較小。

綜上所述,SCGP對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的凋亡作用,尤其對(duì)AGS細(xì)胞具有明顯的凋亡誘導(dǎo)作用。SCGP對(duì)AGS細(xì)胞的凋亡作用明顯比對(duì)其他兩種腫瘤細(xì)胞的強(qiáng),研究表明不同來(lái)源的多糖對(duì)AGS細(xì)胞、SK-OV-3細(xì)胞、HepG2細(xì)胞凋亡途徑可能為下調(diào)抗細(xì)胞凋亡Bcl-2和Bcl-xL基因表達(dá)、激活p53基因表達(dá)和細(xì)胞凋亡線粒體途徑、引起細(xì)胞色素C的釋放和活化Caspase誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19,22-24]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK-8和流式細(xì)胞檢測(cè)共同證明SCGP使AGS細(xì)胞增殖活性受到了明顯抑制并能使細(xì)胞發(fā)生凋亡。

3 結(jié)論

腫瘤是威脅健康并且死亡率很高的疾病之一,研究表明含有硫酸基團(tuán)的多糖有較好的抗腫瘤活性。本文用實(shí)驗(yàn)室前期制備的粗牡蠣多糖,通過(guò)氯磺酸-吡啶法制備得到了硫酸酯化牡蠣多糖SCGP,對(duì)3種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出一定的抑制活性和凋亡作用。在1000 μg/mL SCGP對(duì)AGS細(xì)胞和HepG2細(xì)胞處理96 h后,都顯現(xiàn)出凋亡作用。尤其是對(duì)AGS細(xì)胞的抑制、凋亡作用明顯,可進(jìn)一步研究。而SCGP對(duì)人卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞凋亡效果不顯著,反而起到抑制凋亡作用。

圖3 SCGP對(duì)3種腫瘤細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 The effects of SCGP on apoptosis of three kinds of carcinoma cell line

正常的細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡保持一種平衡狀態(tài),當(dāng)細(xì)胞過(guò)度增殖或凋亡減少就可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[25]。目前多糖抗腫瘤的主要途徑為抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯、抑制腫瘤細(xì)胞的入侵、黏附、轉(zhuǎn)移、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力和影響腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等[26]。SCGP的抗腫瘤作用機(jī)理尚不清楚。因?yàn)橛绊懥蛩狨セ嗵腔钚缘囊蛩睾芏?比如取代值(DS)、分子量、硫酸根取代位、空間結(jié)構(gòu)等,同時(shí)多糖分子量較大,不容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,加之機(jī)體對(duì)多糖的吸收、代謝和運(yùn)輸效果都不佳,所以不易在細(xì)胞內(nèi)達(dá)到足夠的濃度[27]。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、分子生物學(xué)及科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,在以后研究中,將對(duì)SCGP進(jìn)行更加深入探討,明確抗腫瘤機(jī)制及構(gòu)效關(guān)系,為牡蠣多糖的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

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Effect of sulfated polysaccharide fromCrassostreagigason inhibition and induction of three kinds of carcinoma cell

ZHAO Guan-hua,TONG Chang-qing,LI Wei,QU Min*

(College of Food Science and Engineering,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

Sulfated polysaccharide fromCrassostreagigsa(SCGP)was derived by using the chlorosulfonic acid-pyridine method. The inhibitory effects of SCGP on AGS cells,SK-OV-3 cells,and HepG2 cells were evaluated using CCK-8 assay,and the apoptosis changes were analyzed by flow cytometry. The results showed that SCGP significantly inhibited the growth of three cell. The inhibitory effect of SCGP was better on AGS cells than other cells. The flow cytometry results showed that SCGP could effectively induce the apoptosis of AGS cells. The results suggest that SCGP has inhibitory effect on growth of AGS cells.

Crassostreagigsapolysaccharide;sulfated modification;antitumor activity;apoptosis

2017-01-13

趙冠華(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：海洋藥源生物活性物質(zhì)開(kāi)發(fā)，E-mail:lookgo@qq.com。

*通訊作者:曲敏(1976-)，女，博士，研究方向：海洋藥源生物活性物質(zhì)開(kāi)發(fā)，E-mail:qumin2008@163.com。

海洋局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201405017-03)。

TS254.1

A

1002-0306(2017)13-0302-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.056