生物質(zhì)熱解液和殼聚糖復(fù)合保鮮劑對(duì)辣椒炭疽病菌抑菌作用研究

付長雪,劉芳芳,都璐珩,李范洙,張 先

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)系,吉林延吉 133000)

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生物質(zhì)熱解液和殼聚糖復(fù)合保鮮劑對(duì)辣椒炭疽病菌抑菌作用研究

付長雪,劉芳芳,都璐珩,李范洙*,張 先*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)系,吉林延吉 133000)

為探究生物質(zhì)熱解液在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用及復(fù)合保鮮劑開發(fā),采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析檢測(cè)了生物質(zhì)熱解液的化學(xué)成分,以辣椒炭疽病菌為實(shí)驗(yàn)菌種,用生長速率法進(jìn)行了生物質(zhì)熱解液和殼聚糖對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌實(shí)驗(yàn),通過共毒因子法確定了生物質(zhì)熱解液和殼聚糖的相互作用。結(jié)果表明:生物質(zhì)熱解液和殼聚糖對(duì)辣椒炭疽病菌的EC50值分別為50倍和0.7 g/L;生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MFC)分別為32.5倍和29倍;兩者以不同比例混合使用時(shí)對(duì)辣椒炭疽病菌的抑制具有增效作用,且生物質(zhì)熱解液和殼聚糖EC50溶液按1∶1比例混合時(shí)共毒因子最大。

生物質(zhì)熱解液,殼聚糖,辣椒炭疽病菌,抑菌作用,復(fù)合保鮮劑

生物質(zhì)資源是地球上存在的一種豐富的可再生能源。我國生物質(zhì)資源來源主要分四大類:農(nóng)業(yè)資源、林業(yè)資源、禽類糞便和能源植物。研究發(fā)現(xiàn),生物質(zhì)熱解技術(shù)是生物質(zhì)資源利用的重要途徑[1-2]。

目前,對(duì)生物質(zhì)資源利用的研究主要以木醋液為主,已有大量研究證明其具有促進(jìn)植物生長和防治農(nóng)作物病蟲害及保鮮的作用[3-5],且安全無毒性[6-7]。研究表明,植物中抗菌、殺菌的有效成分主要有香精油,香精油一般為醋、酮、酸和萜烯的化合物,此外單寧、甾體類、黃酮類、有機(jī)酸和蛋白質(zhì)等也具有抑菌作用[8]。生物質(zhì)熱解液(bio-liquid),是生物質(zhì)熱解技術(shù)獲得的生物油精制分離得到的水溶性提取物,其化學(xué)組成主要有有機(jī)酸、醇、酚、醛、酮類等[9],因此推測(cè)生物質(zhì)熱解液也具有一定的抗菌殺菌作用。

殼聚糖是一種天然無毒的高聚物,是甲殼素脫乙酰基的產(chǎn)物[10]。存在廣泛,且安全、無毒、可降解,具有良好的抗菌性和吸附性。與一般的抑菌劑相比有廣譜、抗菌活性高、殺菌率高等優(yōu)點(diǎn)[11]。

辣椒炭疽病,是危害辣椒的主要病害之一。在高溫高濕條件下,流行蔓延快,危害時(shí)間長,危害重,損失大[12]。傳統(tǒng)的預(yù)防措施主要為噴施殺菌劑,盡管達(dá)到了防治效果,但辣椒表面殘留的殺菌劑對(duì)人類健康存在致癌、致畸等慢性毒性。

因此,本實(shí)驗(yàn)以生物質(zhì)熱解液為原料,研究其對(duì)辣椒炭疽病菌的抑制作用并開發(fā)生物質(zhì)熱解液和殼聚糖復(fù)合抑菌劑,研究復(fù)合保鮮劑對(duì)辣椒炭疽病菌抑菌效果,以期為生物質(zhì)資源的綜合利用及綠色復(fù)合抑菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生物質(zhì)熱解液 2012年廣州迪森集團(tuán)提供,以木屑為原料，采用中溫快速熱解法制造的生物油,生物油與水按1∶1比例混合,常壓蒸餾,收集100～120 ℃時(shí)的餾出液；殼聚糖 脫乙酰度大于95%以上，山東省萊州市海力生物制品有限公司；辣椒炭疽病菌 吉林省蔬菜花卉研究院。

Shimadzu QP2010 GC/MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司;DHG-9143BS-Ⅲ型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái) 上海新苗醫(yī)療器械機(jī)械制造有限公司;DNP-9082BS-Ⅲ型電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰勒斯儀器有限公司;FA1004B型分析天平 上海昂尼儀器儀表有限公司;SX-700型高壓蒸汽滅菌鍋 日本TOMY公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物質(zhì)熱解液化學(xué)成分GC-MS分析 采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析Shimadzu QP2010 GC/MS。

色譜條件:色譜柱為DB-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱。程序升溫:柱溫50 ℃(保留2 min),以10 ℃/min升溫至280 ℃,保持30 min。汽化室溫度250 ℃,載氣為高純He(99.999%),流速1.0 mL/min;分流進(jìn)樣,分流比20.0,溶劑延遲時(shí)間:1.0 min。

質(zhì)譜條件:離子源為電子轟擊(EI)源;離子源溫度230 ℃,電子能量70 eV,接口溫度280 ℃。質(zhì)量分析器為單四極桿,質(zhì)量范圍20～500 amu,檢測(cè)電壓為0.90 kV。

1.2.2 抑菌率和EC50值測(cè)定 將不同濃度生物質(zhì)熱解液和殼聚糖分別與高壓滅菌(121 ℃、20 min)后冷卻至50 ℃左右的PDA固體培養(yǎng)基混合均勻,分別配制成含不同濃度的生物質(zhì)熱解液和殼聚糖的培養(yǎng)基。以不加熱解液和殼聚糖的培養(yǎng)基為空白對(duì)照(CK)并以含0.05%和0.1%醋酸的培養(yǎng)基為對(duì)照。

在已培養(yǎng)4～5 d的辣椒炭疽病菌平板上,用直徑為5 mm的打孔器在菌落的外緣生長旺盛處制備菌餅,用接種針挑取菌餅,菌絲面朝下輕放于帶藥培養(yǎng)基的中心并與培養(yǎng)基貼合[13]。每個(gè)培養(yǎng)皿中放置一個(gè)菌餅,每個(gè)稀釋濃度重復(fù)3次。

將接種后培養(yǎng)基放置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)至空白對(duì)照組菌落直徑大于培養(yǎng)皿直徑的2/3時(shí),用游標(biāo)卡尺測(cè)量辣椒炭疽病菌生長的菌落直徑(mm),并得出平均值。通過計(jì)算得出各處理濃度對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌率,分析比較熱解液和殼聚糖對(duì)辣椒炭疽病菌菌絲生長的影響。

以橫坐標(biāo)為藥劑濃度的對(duì)數(shù)值,縱坐標(biāo)為菌絲生長的抑菌率值,得出兩種藥劑對(duì)辣椒炭疽病菌的毒力回歸方程,并求得生物質(zhì)熱解液與殼聚糖對(duì)辣椒炭疽病菌的EC50值[14]。

抑菌率(%)=[(空白對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑)]×100

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MFC)測(cè)定 采用直接配制法制備不同稀釋倍數(shù)的含生物質(zhì)熱解液的PDA液體培養(yǎng)基。采用連續(xù)稀釋法制備不同稀釋濃度的含殼聚糖的PDA液體培養(yǎng)基。將PDA液體培養(yǎng)基倒入試管中,每個(gè)試管15 mL,每個(gè)濃度3次重復(fù),以不加生物質(zhì)熱解液和殼聚糖的試管為對(duì)照組。將制備好的辣椒炭疽病菌菌餅接種在試管中,在28 ℃恒溫培養(yǎng)后觀察結(jié)果,每隔12 h觀察一次菌絲的生長情況,連續(xù)觀察一周,以試管內(nèi)完全無菌絲生長的最小濃度為藥劑對(duì)辣椒炭疽病菌的最小抑菌濃度[15]。

在MIC實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,將無菌絲生長的試管中的菌餅接種到PDA培養(yǎng)基中在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一周后判斷菌絲生長情況,以此時(shí)無菌絲生長的最小濃度為藥劑對(duì)辣椒炭疽病菌的最小殺菌濃度。

1.2.4 復(fù)配實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 假設(shè)經(jīng)測(cè)定生物質(zhì)熱解液、殼聚糖單劑A、B的EC50值分別為a和b,用共毒因子法評(píng)價(jià)生物質(zhì)熱解液A和殼聚糖B混合液的增效作用。選擇5個(gè)配比,具體配制方法即先配制A、B的EC50溶液,再按體積比1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1混合即得不同配比的混和液[16]。

共毒因子=[(混合液實(shí)際抑制率-混合液理論抑制率)/混合液理論抑制率]×100

當(dāng)共毒因子>20,表示有增效作用;≤-20表示有拮抗作用;-20～20表示有相加作用[17]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 11.5和Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 生物質(zhì)熱解液化學(xué)成分分析

對(duì)生物質(zhì)熱解液化學(xué)成分進(jìn)行GC-MS分析,經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索,并核對(duì)質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)圖譜,各組分的含量按峰面積百分比計(jì)算得出,結(jié)果見表1。從生物質(zhì)熱解液中共分析鑒定出23種組分,酸類物質(zhì)相對(duì)含量最高,占所有檢出物的58.89%,其中醋酸的相對(duì)含量為40.34%;其次是胺類物質(zhì),占所有檢出物的17.84%;酮類物質(zhì)的相對(duì)含量為12.83%,此外還有少量的醇類、酯類、酚類、醛類物質(zhì)。酸類、胺類、酮類物質(zhì)的總含量為89.56%,是生物質(zhì)熱解液的主要組成成分。

相較于翟梅枝[18]等人的研究,除醛類物質(zhì)外,生物質(zhì)熱解液的化學(xué)成分與3種不同木醋液的化學(xué)成分相似,且與生物油[19]的化學(xué)組成種類基本一致,但各物質(zhì)相對(duì)含量有差異。

表1 生物質(zhì)熱解液化學(xué)成分分析表Table 1 Chemical composition of bio-liquid

2.2 生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌作用

結(jié)果表明,生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌有較好的抑菌效果。如表2所示,隨著生物質(zhì)熱解液稀釋倍數(shù)的增加,抑菌效果逐漸減小,在稀釋倍數(shù)為30倍時(shí),生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌率達(dá)到100%;當(dāng)生物質(zhì)熱解液稀釋倍數(shù)大于60倍時(shí),抑菌率低于50%。相較于魏琦[20]等人的竹醋液對(duì)辣椒炭根據(jù)生物質(zhì)熱解液稀釋倍數(shù)與其對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌率,求得生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌的毒力回歸方程為y=10.848x2-45.259x+50.85,R2=0.98391,通過回歸方程得出生物質(zhì)熱解液的EC50值為50倍即20 mL/L,僅為苦參和板藍(lán)根提取物[21]的一半,與金銀花提取物EC50值相接近,說明生物質(zhì)熱解液具有良好的抑菌效果。

表2 生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌抑菌作用Table 2 The antifungal activities of bio-liquid against Colletotrichum nigrum

注:同一列中不同小寫字母代表差異顯著(p<0.05),表4、表6同。疽病菌抑菌效果的研究,相同濃度下,生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌效果略低于竹醋液。熱解液50倍稀釋液的抑菌率相當(dāng)于0.05%醋酸對(duì)照組的抑菌率,40倍稀釋液的抑菌率顯著大于0.1%醋酸對(duì)辣椒炭疽菌的抑菌率。

生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌的最小抑菌濃度見表3及圖2。生物質(zhì)熱解液稀釋36倍及以上時(shí),試管內(nèi)均有菌絲生長,在稀釋32.5倍及以下的試管中,無菌絲生長,以試管內(nèi)無菌絲生長的最小濃度為MIC,由此確定稀釋32.5倍為生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌的最小抑菌濃度。最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)后從無菌絲生長的試管中將菌餅取出接種在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng),進(jìn)一步確定生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌的MFC為稀釋29倍。

圖1 生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌抑菌作用Fig.1 The antifungal activities of bio-liquid against Colletotrichum nigrum

表3 生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌的MIC和MFC測(cè)定Table 3 MIC and MFC of bio-liquid against Colletotrichum nigrumon

圖2 生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌的MIC和MFC測(cè)定Fig.2 Effects of Bio-liquid against Colletotrichum nigrumon MIC and MFC

圖3 殼聚糖對(duì)辣椒炭疽病菌抑菌作用Fig.3 The antifungal activities of chitosan against Colletotrichum nigrum注：圖中左下角的數(shù)字為殼聚糖濃度，單位g/L。

注:試管內(nèi)有菌絲生長用“+”表示,無菌絲生長用“-”表示,表5同。2.3 殼聚糖對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌作用

殼聚糖對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌作用如表4及圖3所示,隨著殼聚糖濃度的升高,菌落直徑逐漸減小，抑菌率逐漸增加。當(dāng)殼聚糖濃度大于0.7 g/L時(shí),對(duì)辣椒炭疽病菌抑菌率均大于50%,表明殼聚糖對(duì)辣椒炭疽病菌也有較好的抑制作用。已有大量研究證明[22-24]殼聚糖作為一種廣譜抑菌劑,可以有效抑制多種細(xì)菌、真菌的生長和繁殖,一方面,殼聚糖可以和病菌表面產(chǎn)生的酸性物質(zhì)如磷壁質(zhì)酸、莢膜多糖等相互作用[25]形成復(fù)雜的高分子電解質(zhì),改變細(xì)胞膜的通透性,使膜功能發(fā)生紊亂,細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)電解質(zhì)、蛋白質(zhì)和內(nèi)酶外滲,從而產(chǎn)生抑菌效果;另一方面,大分子的殼聚糖會(huì)吸附在微生物細(xì)胞表面,形成一層高分子膜,阻止了營養(yǎng)物質(zhì)向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸[26]從而起到殺菌和抑菌作用。

表4 殼聚糖對(duì)辣椒炭疽病菌抑菌作用Table 4 The antifungal activities of chitosan against Colletotrichum nigrum

根據(jù)殼聚糖濃度對(duì)數(shù)值與抑菌率的幾率值求得殼聚糖對(duì)辣椒炭疽病菌的毒力回歸方程為y=0.55677x2+1.2848x+0.75555,R2=0.98026,得出殼聚糖對(duì)辣椒炭疽病菌的EC50值為0.7 g/L。

從表5及圖4可以看出,殼聚糖濃度為0.625 g/L以下時(shí),試管中有菌絲生長,殼聚糖濃度1.25 g/L開始,無菌絲生長,以無菌絲生長的最低濃度作為殼聚糖對(duì)辣椒炭疽病菌的最小抑菌濃度,即殼聚糖對(duì)辣椒炭疽病菌的MIC為1.25 g/L。不同濃度的殼聚糖所對(duì)應(yīng)的平板中均有菌絲生長,說明殼聚糖對(duì)辣椒炭疽病菌僅有抑制作用,無殺菌作用。

表5 殼聚糖對(duì)辣椒炭疽病菌的MIC測(cè)定Table 5 Effects of chitosan against Colletotrichum nigrum on MIC

表6 生物質(zhì)熱解液與殼聚糖不同比例混合液對(duì)辣椒炭疽病菌的抑制作用Table 6 The acaricidal activities of mixtures containing different proportions of bio-liquid and chitosan against Colletotrichum nigrum

圖4 殼聚糖對(duì)辣椒炭疽病菌的MIC測(cè)定Fig.4 MIC of chitosan against Colletotrichum nigrum

2.4 生物質(zhì)熱解液和殼聚糖復(fù)合保鮮劑對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌作用

生物質(zhì)熱解液EC50值溶液與殼聚糖EC50值溶液按照不同比例混合后,通過毒力回歸方程求得生物質(zhì)熱解液與殼聚糖對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌率,相加即為復(fù)合保鮮劑對(duì)辣椒炭疽病菌的理論抑菌率。生物質(zhì)熱解液EC50值溶液與殼聚糖EC50值溶液不同混合比例的實(shí)際抑菌率、理論抑菌率及相互作用如表6所示。當(dāng)生物質(zhì)熱解液和殼聚糖復(fù)配比例為1∶2、1∶1、2∶1、5∶1時(shí),實(shí)際抑菌率均為理論抑菌率的2倍左右,且對(duì)應(yīng)的共毒因子均大于20,表明生物質(zhì)熱解液與殼聚糖配合使用有增效作用。復(fù)配比例為1∶5時(shí),共毒因子小于20,表明生物質(zhì)熱解液和殼聚糖僅有相加作用無增效作用。復(fù)配比例為1∶1時(shí)共毒因子最大,為82.74,即稀釋50倍生物質(zhì)熱解液與0.7 g/L殼聚糖按1∶1比例混合作為本實(shí)驗(yàn)較好的復(fù)配比例。但就抑菌率來看,混合比例為5∶1時(shí)對(duì)辣椒炭疽病菌的實(shí)際抑菌率最大,且顯著高于其他混合比例。因此,實(shí)際如何應(yīng)用,還需進(jìn)一步考慮和驗(yàn)證經(jīng)濟(jì)成本以及不同比例混合液對(duì)辣椒保鮮效果等問題。此外生物質(zhì)熱解液以及與殼聚糖的復(fù)合劑對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

圖5 生物質(zhì)熱解液與殼聚糖不同比例混合液 對(duì)辣椒炭疽病菌的抑制作用Fig.5 The acaricidal activities of mixtures containing different proportions of bio-liquid and chitosan against Colletotrichum nigrum

3 結(jié)論

對(duì)生物質(zhì)熱解液化學(xué)成分進(jìn)行GC-MS分析,結(jié)果表明:酸類、胺類、酮類物質(zhì)的相對(duì)含量占89.56%,是生物質(zhì)熱解液的主要組成成分。以辣椒炭疽病菌為供試植物病原菌,采用生長速率法評(píng)價(jià)了生物質(zhì)熱解液與殼聚糖的抑菌活性。生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌的EC50值為50倍,最小抑菌濃度為32.5倍，最小殺菌濃度為29倍;殼聚糖對(duì)辣椒炭疽病菌的EC50值為0.7 g/L,最小抑菌濃度為1.25 g/L,殼聚糖對(duì)辣椒炭疽病菌無殺菌效果。生物質(zhì)熱解液和殼聚糖復(fù)合使用對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌效果表明:兩者之間有增效作用,50倍生物質(zhì)熱解液與0.7 g/L殼聚糖溶液1∶1比例的混合液增效作用最大。

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Study on the antibacterial effect of bio-liquidand chitosan compound preservative onColletotrichumnigrum

FU Chang-xue,LIU Fang-fang,DU Lu-heng,LI Fan-zhu*,ZHANG Xian*

(College of Agriculture,Yanbian University,Yanji 133000,China)

In order to explore the application of bio-liquid in agricultural production and preservative development,Gas chromatograph mass spectrometer was used to analyze the chemical composition of bio- liquid,Colletotrichumnigrumwas used as experimental strain,antibacterial experiment of bio-liquid and chitosan onColletotrichumnigrumwere experimented by growth rate method,and the interation between bio-liquid and chitosan was determined by the co-toxity factor method.The results showed that EC50of bio-liquid and chitosan onColletotrichumnigrumwere 50 times and 0.7 g/L. The minimum inhibitory concentration of biomass pyrolysis liquid on Pepper Anthracnose(MIC)and minimum bactericidal concentration(MFC)were 32.5 times and 29 times. Bio-liquid and chitosan mixed in different proprotions has synergistic effect,bio-liquid and chitosan EC50solution mixed by 1∶1 ratio has the largest co-toxicity factor.

biomass-liquid;chitosan;Colletotrichumnigrum;antimicrobial effect;compound preservative

2016-11-18

付長雪(1994-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工，E-mail：1633078222@qq.com。

*通訊作者:李范洙(1965-)，男，博士，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工，E-mail：fzli@ybu.edu.cn。 張先(1963-)，女，博士，副教授,研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工，E-mail：zhangdory@aliyun.com。

吉林省重點(diǎn)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20130204045NY)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)13-0286-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.053