解淀粉芽孢桿菌HRH317抗菌蛋白發酵條件優化及其穩定性研究

秦 楠,繆文玉,李 鑫,郝 林,*

(1.山西中醫學院制藥與食品工程學院,山西太原 030619;2.太原城市職業技術學院管理工程系,山西太原 030027;3.山西農業大學食品科學與工程學院,山西太谷 030801)

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解淀粉芽孢桿菌HRH317抗菌蛋白發酵條件優化及其穩定性研究

秦 楠1,繆文玉2,李 鑫3,郝 林3,*

(1.山西中醫學院制藥與食品工程學院,山西太原 030619;2.太原城市職業技術學院管理工程系,山西太原 030027;3.山西農業大學食品科學與工程學院,山西太谷 030801)

本文以抑菌圈直徑為指標,采用單因素實驗和響應面法對解淀粉芽孢桿菌HRH317菌株產抗菌蛋白的發酵條件進行優化。得到最佳發酵條件為:初始pH為7.0的NB培養液,接種量4%,37 ℃下振蕩培養24 h,轉速為200 r/min。在此條件下抗菌蛋白的抑菌圈直徑達21.85 mm,結果表明該抗菌蛋白具有良好的抑菌效果。穩定性研究結果表明:蛋白在40～80 ℃、pH2～11穩定,對蛋白酶K有一定耐受性。

解淀粉芽孢桿菌,抗菌蛋白,響應面法,穩定性

霉菌是引起采后果蔬腐爛的重要因素之一?；瘜W農藥對環境和農產品的污染直接影響人類的健康,為了保證農產品的衛生和安全,利用微生物之間的寄生、拮抗作用已成為果蔬及糧食防霉的大勢所趨[1-2]。

芽孢桿菌(Bacillus.spp)是拮抗細菌中的重點研究對象。其生長迅速,能夠產生諸如抗菌蛋白、肽等抑菌有效成分,對人體無毒害、不造成環境污染[3-4]。Mohamed等[5]將1-MCP與解淀粉芽孢桿菌共同防治番木瓜病害,結果表明炭疽病和霉軟腐病得到了有效的抑制,既控制了后熟,還保持了果實品質。郝衛寧等[6]研究了由解淀粉芽孢桿菌HC-03制備得到的菌株發酵液、菌懸液及發酵濾液,進行橘子青、綠霉病的防腐實驗,有明顯的抑菌作用。韓玉竹等[7]報道解淀粉芽孢桿菌H15產抗菌肽對糧食防霉方面效果顯著。因此,芽孢桿菌及其代謝產物成為抑制真菌病害最有效的天然生物制劑[8-9]。在農產品防腐保鮮、病原物防治及植株促生等方面表現出良好的前景。本實驗以解淀粉芽孢桿菌HRH317為出發菌株,對發酵時間、溫度、pH、接種量、轉速等條件進行單因素實驗,并通過方差分析從中選出影響顯著的因子進行響應面設計,從而獲得抗菌蛋白的最佳發酵條件,同時對抗菌蛋白的穩定性進行了研究,為后期工業化生產和應用提供理論依據。

表1 單因素水平設計表Table 1 Levels design of single factor

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

解淀粉芽孢桿菌HRH317菌株(BacillusamyloliquefaciensHRH317)(編號:CGMCC No.7314)、禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum) 山西農業大學生物工程實驗室;蛋白酶K(2000～5000 U/mg) solarbio公司;胰蛋白酶(2000～5000 U/mg)、胃蛋白酶(3000～3500 U/mg) 北京奧博星生物技術有限公司;硫酸銨、Tris、牛肉膏、蛋白胨 均為分析純;營養瓊脂(nutrient agar,NA)培養基 牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、NaCl 0.5 g、瓊脂1.5 g、水100 mL;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基 馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 L;營養肉湯(nutrient broth,NB)培養基 牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、NaCl 0.5 g、水100 mL;馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose broth,PDB)液體培養基 PDA培養基中不加瓊脂。

DHP-500型電熱恒溫培養箱 北京光明醫療儀器廠;YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;BS210S電子天平 北京賽多利斯天平有限公司;HZQ-QX全溫振蕩搖床 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司;DL-6MS高速離心機 成都市生科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HRH317菌株抗菌蛋白的制備 將HRH317菌株種子液接種至裝有30 mL發酵培養基的三角瓶中搖床培養獲得發酵液。轉移至EP管離心去沉淀,經孔徑0.22 μm細菌過濾器過濾,即得無菌體培養濾液。緩慢加入硫酸銨至50%飽和度,收集沉淀蛋白。用原1/10體積0.02 mol/L pH6.8的Tris緩沖液溶解,裝入透析袋后采用濃度相同的Tris緩沖液透析過夜,即得到抗菌蛋白[10],蛋白質濃度測定參照文獻[11]。

1.2.2 指示菌菌懸液的制備 用接種環挑取一環禾谷鐮孢病菌孢子接入裝有5 mL滅菌生理鹽水的試管中,稀釋102倍后制成濃度為1.0×106個/mL的孢子懸液,備用。

1.2.3 HRH317菌株抗菌蛋白的抑菌活性測定 采用牛津杯法[12]。

1.2.4 HRH317菌株產抗菌蛋白發酵條件的優化

1.2.4.1 單因素影響實驗 本實驗選取不同發酵時間、溫度、pH、接種量、轉速進行單因素實驗,各處理均在培養后,按照1.2.1取濃度(5.81±0.04) mg/mL的抗菌蛋白100 mL進行抑菌活性檢測,記錄抑菌圈直徑作為指標。不同因子梯度條件見表1。

1.2.4.2 響應面法實驗設計 基于單因素實驗結果,采用中心組合實驗Box-Behnken設計方案,以發酵時間(h)、接種量(%)以及轉速(r/min)為考察因素,分別用X1、X2、X3來表示,并以+1、0、-1分別代表變量的水平,按方程xi=(Xi-X0)/ΔX對自變量進行編碼,其中,xi表示變量的編碼值,Xi表示變量的真實值,X0表示實驗中心點變量的真實值,ΔX表示變量的步長變化,抗菌蛋白的抑菌圈直徑Y表示響應值,見表2。

表2 中心組合實驗Box-Behnken設計因素和水平編碼值Table 2 Independent variables and levels in Box-Behnken CCD

1.2.5 穩定性實驗

1.2.5.1 溫度對抗菌蛋白的影響 取100 mL抗菌蛋白分別在40、60、80、100 ℃條件下水浴熱處理30 min,121 ℃條件下熱處理15 min,以未處理的樣品作對照,以禾谷鐮孢菌為指示菌分別做抑菌實驗,測量抑菌圈直徑,每處理設置3個重復。

1.2.5.2 pH對抗菌蛋白的影響 取100 mL抗菌蛋白分別置于11支離心管中,每管6 mL,用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調其pH分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11,最終容積保持10 mL,以加等量蒸餾水稀釋的菌液作為對照,然后37 ℃溫浴4 h,后分別調至中性(pH6.5～7.5),以禾谷鐮孢菌為指示菌分別做抑菌實驗,測抑菌圈直徑,每處理設置3個重復。

1.2.5.3 蛋白酶對抗菌蛋白的影響 取100 mL抗菌蛋白分裝在1.5 mL 離心管中,分別加入5 mg/mL蛋白酶K、5 mg/mL胰蛋白酶、5 mg/mL胃蛋白酶,37 ℃水浴恒溫2 h,以未添加蛋白酶處理的樣品作為對照,以禾谷鐮孢菌為指示菌用牛津杯法做抑菌實驗,每處理設置3個重復。

1.3 數據分析

所有實驗數據均采用Excel 2003、SAS 8.0和Design-Expert(version8.0.6)統計軟件進行處理分析,應用最小差異顯著法(LSD)進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 不同發酵時間對菌株抗菌蛋白抑菌活性的影響 由圖1所示,發酵初期處于遲滯期,沒有代謝大量的發酵產物。隨著發酵時間的不斷延長,抗菌蛋白粗提液抑菌圈直徑呈現先增后降的趨勢,發酵時間對其影響極顯著(p<0.01),并在24 h時達到最大(20.35±0.61) mm。隨時間繼續增長,該菌株由穩定期進入降速期,菌數量逐漸減少,分泌抗菌蛋白能力降低導致抑菌活性逐漸減弱。

圖1 發酵時間對菌株抗菌蛋白抑菌活性的影響Fig.1 Effect of fermentation time on inhibitory activity of antifungal protein of strain HRH317

2.1.2 不同發酵溫度對菌株抗菌蛋白抑菌活性的影響 由圖2所示,隨溫度升高,抑菌活性呈先上升后下降的趨勢,發酵溫度對其影響顯著(p<0.05),當升至37 ℃時抑菌活性最高,抑菌圈直徑(20.84±0.15) mm。說明細菌的生長繁殖及代謝產物的產生隨溫度升高而減少,由此可知,溫度過高不適于菌株的生長。

圖2 發酵溫度對菌株抗菌蛋白抑菌活性的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on inhibitory activity of antifungal protein of strain HRH317

2.1.3 不同pH對菌株抗菌蛋白抑菌活性的影響 由圖3所示,抑菌活性隨pH提高呈現出先增加后下降的趨勢,pH對其影響顯著(p<0.05)。pH會影響細胞中代謝酶的活性,從而對其生長和代謝造成影響[13]。在pH2～4之間,抗菌蛋白抑菌活性相對較弱,表明菌株不能很好利用營養物質導致生長緩慢;在pH5～7之間,抑菌圈逐漸增大,并在pH7時抑菌活性最高,抑菌圈直徑(19.96±0.89) mm;此后,抑菌活性隨pH升高逐漸降低。結果表明該菌株對過酸和過堿的條件都比較敏感,抑菌活性受到影響。

圖3 pH對菌株抗菌蛋白抑菌活性的影響Fig.3 Effect of pH values on inhibitory activity of antifungal protein of strain HRH317

2.1.4 不同接種量對菌株抗菌蛋白抑菌活性的影響 由圖4 所示,抑菌活性隨著接種量的增加呈現出不斷增大然后緩慢降低的趨勢,接種量對其影響極顯著(p<0.01),并在4%時抑菌活性達到高峰,抑菌圈直徑達(20.23±0.71) mm。隨著接種量增大,抑菌活性開始出現降低的趨勢,這是由于在一定量培養基內,菌數增加產生空間與營養競爭,從而抑制菌體正常的生長,進而致使抑菌物質減少。因此,4%的接種量有利于抗菌粗蛋白的分泌和積累。

圖4 接種量對菌株抗菌蛋白抑菌活性的影響Fig.4 Effect of inoculation volume on inhibitory activity of antifungal protein of strain HRH317

2.1.5 不同搖床轉速對菌株抗菌蛋白粗提液抑菌活性的影響 由圖5所示,抑菌活性隨著轉速的加快呈現出先升后降的趨勢,搖床轉速對其影響極顯著(p<0.01),在轉速為150 r/min時,抑菌活性最高,抑菌圈直徑為(21.89±0.88) mm。搖床轉速是影響抗菌蛋白抑菌活性的主要因子,搖床發酵培養可增加通氣量。轉速太慢,通氣量小,不利于菌體生長;轉速過快,可能會導致菌體自溶,使生物量減少[14]。

圖5 搖床轉速對菌株抗菌蛋白抑菌活性的影響Fig.5 Effect of shaker rotation speed on inhibitory activity of antifungal protein of strain HRH317

2.2 響應面分析

2.2.1 響應面實驗設計與結果 如表3所示,17個實驗點中12個是析因點,5個是零點,析因點是自變量取值在X1、X2、X3所構成的三維頂點,零點表示區域的中心點,其中重復零點實驗5次,用以估算實驗誤差。

表4 二次回歸模型的方差分析結果Table 4 Analysis of variance for each item of developed quadratic regression model

注:* 代表差異顯著(p<0.05),**代表差異極顯著(p<0.01)

表3 Box-Behnken設計方案及抑菌直徑Table 3 Box-Behnken CCD matrix and response values of inhibition zone diameter(IZD)

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗 利用Design-Expert(version8.0.6,Stat-EaseInc.,MinneapolisN. USA)軟件對表3實驗數據通過多元回歸擬合,獲得抑菌圈直徑(Y)對發酵時間(X1)、接種量(X2)和轉速(X3)的二次多項回歸模型為:

Y=20.95-1.02X1+0.67X2-0.020X3+1.13X1X2-0.45X1X3+0.19X2X3-0.761X12-1.24X22-0.70 X32

從方差分析表4中得出模型F值為5.59,對應的p<0.05,達到顯著水平,失擬項的p=0.6533>0.05不顯著,說明該模型擬合程度較好,實驗誤差小,可以用此模型預測解淀粉芽孢桿菌HRH317抗菌蛋白發酵條件對抑菌活性的影響。回歸方程系數顯著性檢驗結果:X1時間的一次項極顯著(p<0.01),X2接種量的一次項及二次項顯著(p<0.05),交互項X1X2顯著(p<0.05),其他項均不顯著。由F值得出實驗各因素對抑菌活性影響的主次順利為:X1>X2>X3,即時間>接種量>轉速。

根據模型方程繪制響應面圖,分別見圖6～圖8。其中每個響應面分別代表兩個變量在恒定值(取零水平值)下,另外兩個獨立變量之間的相互作用。

圖6顯示在轉速水平為0,即150 r/min時,發酵時間與接種量對抑菌圈直徑的交互影響效應,二者具有顯著交互作用(p<0.05)。抑菌圈直徑隨著發酵時間逐漸延長呈下降趨勢,這是由于菌齡過大,細菌菌體可能會出現形態變異、自溶等現象,生理代謝活動漸趨停滯,可代謝抑菌物質的活菌數量降低,故而致使抑菌物質抗菌蛋白產量減少。當接種量范圍在3%～4%時抑菌圈直徑呈現遞增趨勢,隨著接種量的繼續加大,抑菌圈直徑逐漸下降。

圖6 發酵時間與接種量對抑菌圈直徑的響應面及等高線圖Fig.6 Three-dimensional response surface graphs and the contour plots of fermentation time and inoculation volume on IZD

圖7顯示在接種量水平為0,即4%時,轉速與發酵時間對抑菌圈直徑的交互作用不顯著。發酵時間曲線表現較為平緩,在24～48 h的范圍內變化不太明顯。轉速曲線有增長趨勢,表明隨著轉速的加快,搖瓶內發酵液的溶氧量不斷增加,菌株的生長繁殖加快,發酵液的抑菌活性也隨之增加。

圖7 發酵時間與轉速對抑菌圈直徑的響應面及等高線圖Fig.7 Three-dimensional response surface graphs and the contour plots of fermentation time and shaker rotation speed on IZD

圖8顯示在發酵時間水平為0,即24 h時,轉速與接種量對抑菌圈直徑的交互作用不顯著。轉速曲線表現較為平緩,抑菌圈直徑在100～200 r/min的范圍內變化不太明顯。接種量范圍在3%～4%時抑菌圈直徑呈增加趨勢,隨著接種量的繼續加大,抑菌圈直徑逐漸下降。

圖8 轉速與接種量對抑菌圈直徑的響應面及等高線圖Fig.8 Three-dimensional response surface graphs and the contour plots of shaker rotation speed and inoculation volume on IZD

2.2.4 驗證性實驗 通過Design-Expert(version8.0.6)軟件分析,獲得解淀粉芽孢桿菌HRH317產抗菌蛋白發酵工藝的最適條件為:發酵時間24.4 h,接種量4.05%,轉速219 r/min,所得抗菌蛋白對禾谷鐮孢菌抑菌作用強。考慮實際操作的方便性,將最適發酵參數修正為:發酵時間24 h,接種量4%,轉速200 r/min,在最適條件下進行了3組重復性實驗,平均抑菌圈直徑為21.85 mm,與預測值22.05 mm擬合度良好,無顯著性差異(p>0.05),表明實驗確定的模型條件可以用于預測實際值,此方程有效可靠。

2.3 穩定性實驗結果

2.3.1 溫度對抗菌蛋白抑菌活性的影響 如圖9所示,該抗菌蛋白熱穩定性良好。在40～60 ℃下處理30 min后,其抑菌效果變化不大,表明穩定性較好;溫度升至80 ℃下處理30 min,與對照相比其抑菌活性下降了30.9%,穩定性受到影響;在100 ℃處理30 min抑菌活性顯著下降。結果表明,該抗菌蛋白在40～80 ℃具有良好的熱穩定性。

圖9 溫度對抗菌蛋白抑菌活性的影響Fig.9 Effect of temperature on inhibitive activity of antifungal protein注:柱子上方不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。圖10同。

2.3.2 pH對抗菌蛋白抑菌活性的影響 如圖10所示,抗菌蛋白對酸、堿具有很好的穩定性。與對照相比,在pH7～8 范圍內抑菌活性基本不變,在pH2和pH11時仍分別保留原有活性的63.6%、71.4%。結果表明該抗菌蛋白pH范圍較寬,同時說明其具有良好的酸堿穩定性。因此實際應用中該抗菌蛋白可適應酸性、中性、堿性的條件。

圖10 pH對抗菌蛋白抑菌活性的影響Fig.10 Effect of pH value on inhibitive activity of antifungal protein

表5 蛋白酶對抗菌蛋白抑菌活性的影響Table 5 Effect of the protease on inhibitive activity of antifungal protein

注:抑菌圈直徑數據后的小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05)。2.3.3 蛋白酶對抗菌蛋白抑菌活性的影響 由表5可見,蛋白酶K與對照相比差異不顯著(p>0.05),表明抗菌蛋白對其有一定耐受性;經胰蛋白酶及胃蛋白酶處理,與對照相比,活性顯著下降,表明抗菌蛋白對二者敏感,即抗菌蛋白可被人體消化系統中的蛋白酶消化掉,不會對腸道內有益微生物菌群造成影響,同時也不會對人體產生不利的影響。因此該抗菌蛋白在食品果蔬防腐及生防中將會有很好的應用。

3 討論與結論

菌株產抗菌物質能力的高低對微生物相關產品的生產和開發起著決定性的作用,然而微生物的發酵條件優化恰恰又是一個關鍵步驟。響應面法所需實驗次數少,而且可以預測因素之間的相互作用,此方法進行參數優化的應用越來越廣泛[15-16]。郝秋娟等[17]采用分段控溫工藝優化解淀粉芽孢桿菌BS5582產蛋白,得到最佳條件:接種量6.67%、轉速500 r/min,發酵溫度35 ℃、經過27 h發酵后溫度降至32 ℃繼續發酵,蛋白酶活在47.75 h達到9838 U/mL。方傳記[18]對ES-2-4產脂肽類抗菌物質產量的發酵條件采用Plackett-Burman Design 方法進行優化,得到最佳條件,葡萄糖42 g/L、L-谷氨酸鈉14 g/L、溫度27 ℃、轉速200 r/min、接種量4%、裝液量50 mL、搖床培養36 h,此條件下脂肽類抗菌物質的產量為6.76 g/L。本實驗采用單因素與響應面法對解淀粉芽孢桿菌HRH317產抗菌蛋白的發酵條件進行了初步研究,研究結果表明,發酵時間、搖床轉速及接種量是影響抗菌蛋白產量的主要因素,其中,接種量與發酵時間有顯著的交互作用。最佳條件為:在初始pH為7.0的NB培養液,接種量4%,37 ℃下振蕩培養24 h,轉速為200 r/min,在此條件下抗菌蛋白的抑菌圈直徑達21.85 mm。

目前,國內關于芽孢桿菌抗菌蛋白的研究仍處于探索抗菌混合物基本特性的階段,很多研究成果是有關脂肽類抗菌素,抗菌蛋白的報道相對較少[19-21]。芽孢桿菌抗菌蛋白一般具有抗真菌和細菌等特性,其抗菌譜廣、穩定性高、對熱、酶不敏感[22]。本研究中,實驗菌株所產抗菌蛋白在40～80 ℃熱穩定性良好,在100 ℃與121 ℃下分別處理30 min與15 min,抑菌活性顯著下降。這與學者劉永峰[23]研究枯草芽孢桿菌Bs-916胞外抗菌蛋白在120 ℃時仍具有一定的抑菌活性一致。所產抗菌蛋白有較寬的pH范圍,說明耐酸堿性好。對蛋白酶K不敏感,這與學者張寶俊[24]和王軍華[25]研究的解淀粉芽孢桿菌LP-5抗菌蛋白和解淀粉芽孢桿菌Q-12抗菌蛋白均對蛋白酶K不敏感相同,但對胰蛋白酶、胃蛋白酶較敏感這一方面有區別。這說明該抗菌蛋白能被人體蛋白酶所降解,這對其在果蔬和食品防腐領域應用具有重要意義。

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Optimization and stabilization of antifungal proteinfromBacillusamyloliquefaciensstrain HRH317

QIN Nan1,MIAO Wen-yu2,LI Xin3,HAO Lin3,*

(1.College of Pharmaceutical and Food Engineering,Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Taiyuan 030619,China;2.Department of Management Engineering,Taiyuan City Vocational College,Taiyuan 030027,China;3.College of Food Science and Engineering,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)

This paper is concerned with the antifungal protein extraction from the strainsBacillusamyloliquefaciensHRH317. The inhibitive circle diameter as evaluating indicator,the fermentation condition were optimized by single factor experiments and response surface methodology(RSM). The results showed the optimized extraction parameters were that the initial pH value of nutrient broth medium(NB)was 7,inoculation volume of 4%,37 ℃,and the shaker rotation speed 200 r/min. The inhibitive circle diameter was up to 21.85 mm. The results indicated that the antifungal protein was proved to have strong inhibition effect. The antifungal protein was tested to have strong tolerant to proteinase K,which could be steady with 40～80 ℃ and pH2～11.

Bacillusamyloliquefaciens;antifungal protein;response surface methodology;stability

2016-12-23

秦楠(1981-),男,博士,講師,研究方向:食品微生物及功能食品加工,E-mail:bszy6688@163.com。

*通訊作者:郝林(1957-),男,博士,教授,研究方向:食品微生物與發酵技術,E-mail:sxhaolin2014@163.com。

山西省衛計委科研項目(201601115);山西中醫學院博士科研啟動基金資助；國家科技支撐計劃(2012BAD38B07)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)13-0130-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.024