嗜酸乳桿菌產細菌素的提取及其生物特性研究

冉軍艦,焦凌霞,梁新紅,何鴻舉,朱明明,盧艷清,趙瑞香

(河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003)

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嗜酸乳桿菌產細菌素的提取及其生物特性研究

冉軍艦,焦凌霞,梁新紅,何鴻舉,朱明明,盧艷清,趙瑞香*

(河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003)

以嗜酸乳桿菌為研究對象,通過響應面實驗和生物學方法,對該菌細菌素產生條件、細菌素定位和穩定性進行研究。結果表明:該菌產生細菌素的最適培養條件為:培養溫度38 ℃、初始pH7.0、培養時間18 h;在嗜酸乳桿菌發酵液中提取的細菌素具有抑制大腸桿菌生長的作用,主要存在于細胞外;該菌產生的細菌素在40～70 ℃保持較高的活性;在蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后,抑菌活性顯著下降;在pH3.0～10.0之間具有抑菌活性;在紫外照射時間0.25～1 h之間,活性較穩定。此研究結果對該菌產細菌素的分離鑒定及應用提供了重要參考。

嗜酸乳桿菌,細菌素,定位,抑菌活性,穩定性

在生活水平越來越高的今天,人們對各種食品安全的要求也越來越高,而各種化學防腐劑有逐漸被生物活性物質取代的趨勢[1-4]。乳酸菌是公認的安全的微生物,常用于發酵食品的生產中[5-8]。嗜酸乳桿菌屬于乳桿菌屬,在生長代謝過程中產生許多抗菌物質[9-10],其中由核糖體合成的細菌素具有高效、無毒、無殘留等優點而成為食品生物防腐劑的熱點[11]。細菌素根據其化學結構、來源、穩定性和分子量,目前可以分為五類[12-13]:第一類是含有19～50個以上的氨基酸殘基的小分子修飾肽的羊毛硫抗生素,分子量小于5 ku[14];第二類是具有膜活性和疏水性的熱穩定肽(SHSP),分子量小于10 ku[15];第三類是熱敏感大分子蛋白(LHLP),分子量大于30 ku;第四類是復合型大分子復合物;第五類是大多數大腸桿菌等腸內菌所分泌的細菌素,稱為微菌素或大腸桿菌素[16]。目前研究較深入的大多數是第一、二類細菌素,廣泛應用到食品防腐保鮮中的是尼生素(Nisin)[17-20]和片球菌素(Pediocin)[21-24],嗜酸乳桿菌產細菌素接近于第二類細菌素[25]。

Lactobacillusacidophilus是由本課題組自行分離保存的一株細菌,對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等有較強抑制作用[26],但是對于該菌產生細菌素的性質,本課題組還沒有系統研究。為了進一步研究該菌產生細菌素的條件和細菌素的特性,本研究對Lactobacillusacidophilus細菌素進行了細菌素產生條件優化、定位測定和穩定性的測定。這對深入研究Lactobacillusacidophilus的抗菌性,細菌素進行分離、純化和鑒定具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Lactobacillusacidophilus由本實驗室自行分離保存;大腸埃希菌(Escherichiacoli)JM109 實驗室保藏菌株；MRS液體培養基 蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸氫二銨2 g、Mg2SO4·7H2O 0.58 g、K2HPO42 g、硫酸錳0.25 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、吐溫80 1 mL、蒸餾水1000 mL,微調pH6.5，用于Lactobacillusacidophilus的培養；LB培養基 液體培養基:蛋白胨10 g/L,酵母浸膏5 g/L,NaCl 10 g/L,pH7.0;固體培養基:固體培養基加瓊脂15 g/L)用于EscherichiacoliJM109的培養及乳酸菌活性測定。

Kendro D-37520高速冷凍離心機 德國sorvall-Heraeus公司;SW-CJ-1D單人單面垂直凈化工作臺 蘇州智華凈化精密儀器有限公司;Alpha1-2LD plus冷凍干燥機 德國Chirst公司;SHP-250型生化培養箱 上海三發科學儀器有限公司;VCX500超聲波細胞破碎儀 美國Sonics & Materials公司;Lambda 25紫外可見光分光光度計 美國Perkin Elmer公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵上清液的制備 在50 mL MRS液體培養基中接種Lactobacillusacidophilus,于37 ℃恒溫生化培養箱中進行第一次活化,約24 h;將第一次活化的Lactobacillusacidophilus取3%接種到200 mL MRS液體培養基中,于37 ℃恒溫生化培養箱中進行二次活化,約16～18 h。將活化后的Lactobacillusacidophilus按3%的接種量加入到pH6.2的MRS培養基中,37 ℃培養18 h,經4 ℃低溫下,10000 r/min,15 min離心去沉淀,經0.22 μm孔徑無菌濾膜過濾后,放入4 ℃冰箱保存備用[26]。

1.2.2 細菌素的提取 本實驗采用硫酸銨鹽析法粗提Lactobacillusacidophilus細菌素。取100 mL發酵培養液,10000 r/min離心20 min,上清在冰浴中緩慢加入硫酸銨至70%飽和度,置于4 ℃冰箱中過夜,10000 r/min離心20 min,棄去上清,用磷酸緩沖液(pH6.8)將沉淀懸浮,懸浮液裝入透析袋中(截留量8000～14000 Da)4 ℃充分去鹽后冷凍干燥,溶于1 mL無菌水測定抑菌效果[27]。

1.2.3 細菌素抑菌效果測定采用牛津杯法測定:將大腸桿菌液100 μL均勻涂布于LB固體培養基上,用牛津杯打孔(孔徑6 mm),細菌素加樣量50 μL/孔,靜置30 min,放入37 ℃培養箱過夜培養后,測定抑菌圈大小。

抑菌圈直徑(mm)=總直徑(mm)-牛津杯直徑(mm)

每個實驗重復4次[27]。

1.2.4 單因素實驗 在排除有機酸、過氧化氫等因素影響的基礎上[28],確定了MRS為產細菌素培養基,基本發酵條件為培養溫度37 ℃,初始pH7.0,培養時間18 h,以抑菌圈為指標,改變1個因素的水平,其他因素水平不變,考察培養溫度,初始pH和培養時間對抑菌效果的影響。其中培養溫度為31、34、37、40、43 ℃,初始pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,培養時間為14、16、18、20、22 h。每個實驗重復3次。

1.2.5 響應面實驗設計 在單因素實驗的基礎上,綜合考慮發酵過程中各個因素對Lactobacillusacidophilus產細菌素活性的影響,采用統計分析軟件Design-Expert8.0建立3因素3水平的Box-Behnken模型,通過實驗確定優化發酵條件。以抑菌圈直徑(Y)為響應值,培養溫度(X1),初始pH(X2),培養時間(X3)為自變量,因素編碼水平見表1。

表1 響應面實驗因素水平編碼值Table 1 Coded table of factors and levels for response surface experiment

1.2.6Lactobacillusacidophilus產細菌素的定位 根據優化的條件培養Lactobacillusacidophilus得到發酵液,采用滲透沖擊法進行提取[29]:先取發酵液室溫離心(8000 r/min,5 min)上清液(S1)凍存;沉淀(P1)10 mL(pH6.8)50 mmol·L-1PBS重懸,離心(4 ℃,8000 r/min,10 min),洗滌2次,上清液(S2)凍存;沉淀(P2)以10 mL,25%蔗糖溶液重懸,于25 ℃振蕩10 min,離心(4 ℃,12000 r/min,15 min),上清液(S3)凍存;沉淀(P3)加冷的雙蒸水重懸,在冰水浴中振蕩10 min,離心(4 ℃,12000 r/min,15 min),上清液(S4)凍存;沉淀(P4)重懸于10 mL(pH6.8)50 mmol/L PBS中,在冰浴中超聲波破碎1 min,重復5次,間隔1 min,再離心(4 ℃,15000 r/min,20 min),上清液(S5)凍存,沉淀(P5)棄去,將S1、S2和S3合并,即為胞外提取液,S4為膜周質提取液,S5為膜內提取液。取3種提取液,按照1.2.3測不同處理樣品的抑菌活性,從而得知細菌素在細胞中的分布情況。

1.2.7 細菌素穩定性的測定 熱穩定性:將經過硫酸銨沉淀的粗提液分別在40、50、60、70、80、90、100 ℃不同溫度條件下水浴處理30 min,在120 ℃的滅菌鍋中靜置30 min,以未經高溫處理的粗提液作為對照,測定經過不同溫度處理的粗提液的抑菌活性,每個處理重復三次[30]。

蛋白酶的穩定性:取三份經過硫酸銨沉淀的2 mL粗提液,分別加入1 mg/mL的胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K溶液20 μL,37 ℃水浴處理60 min,采用牛津杯法測定處理后的粗提液的抑菌活性,以加入20 μL PBS緩沖液(pH6.8)處理的粗提溶液作為對照,每個處理重復三次[31]。

pH的穩定性:將經過硫酸銨沉淀的粗提溶液分別調pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0,處理12 h后調節pH至中性,以未經處理的粗提溶液為對照,采用牛津杯法,測定不同的pH處理后的粗提液的抑菌活性,每個處理重復3次[32]。

紫外線的穩定性:將經過硫酸銨沉淀的粗提液置于30 W紫外光下,距離30 cm,照射0.25、0.5、1、1.5、2 h,以不用紫外光照射的粗提液為對照,采用牛津杯法,取20 μL檢測其抑菌活性[32]。

1.3 數據分析

抑菌圈直徑采用十字交叉法測量,每個實驗三次重復,采用平均值±標準誤差,用SPSS(18.0)軟件對數據進行分析處理,方差分析顯著水平為p=0.05。

2 結果與分析

2.1Lactobacillusacidophilus的抑菌效果

Lactobacillusacidophilus發酵培養液抑菌活性測定結果如圖1所示,和對照相比,樣品作用于大腸桿菌均有明顯的抑菌圈,說明Lactobacillusacidophilus可以產生抑菌物質,對大腸桿菌具有較好的抑菌作用。

圖1 菌液對大腸桿菌的抑菌效果Fig.1 Inhibitory effect of fermentation broth on Escherichia coli注:a. 抑菌物質;b. CK。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 培養溫度對抑菌效果的影響 從圖2可以看出,在溫度31～43 ℃范圍內,抑菌圈直徑隨著溫度的升高增大后減小,在低于37 ℃時,抑菌圈直徑的增加有顯著性差異,而在高于37 ℃時,抑菌圈直徑沒有顯著增加,在43 ℃時有下降的趨勢,可能是抑菌物質在溫度較高時會部分失活[33],因此,培養溫度選擇34～40 ℃之間為宜。

圖2 溫度對抑菌效果的影響Fig.2 Effect of temperature on antagonistic effect

2.2.2 初始pH對抑菌效果的影響 由圖3可知,在初始pH5.0～9.0范圍內,抑菌圈直徑隨著初始pH的升高先增大后減小,在初始pH高于7.0后,抑菌圈直徑隨著初始pH的升高而降低,不同于大多數乳酸菌在弱酸性環境中生長,說明細菌素的產生是菌株對不良環境的應激反應[33]。因此,選擇初始pH6.0～8.0之間較好。

圖3 初始pH對抑菌效果的影響Fig.3 Effect of initial pH on antagonistic effect

2.2.3 培養時間對抑菌效果的影響 由圖4可知,隨著培養時間的延長,抑菌圈直徑逐漸增大并趨于穩定,其中在18 h內,抑菌圈直徑的增大有顯著性差異,而在18 h后,抑菌圈直徑基本保持不變,已經趨于穩定,說明該菌發酵產生的抑菌物質已達到最高值,而且培養時間過長會使部分抑菌物質失活或者被菌體吸附[32],所以綜合考慮,選擇培養時間16～20 h。

圖4 培養時間對抑菌效果的影響Fig.4 Effect of time on antagonistic effect

2.3 響應面優化實驗結果

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析 按照表1設計的因素水平,采用Box-Behnken實驗設計,對Lactobacillusacidophilus發酵條件進行優化研究,結果見表2～表4。

表2 響應面設計與結果Table 2 Response surface design and corresponding response values

表3 回歸方程系數顯著性檢驗表Table 3 Significant test of regression equation coefficient

表4 響應面模型的方差分析結果Table 4 ANOVA for response surface model

表3的數據結果顯示,R2(決定系數)為0.9917表示該模型能夠解釋99%的響應值變化,失擬項不顯著說明該模型擬合程度良好,實驗誤差小。模型p=0.0001表明該響應面設計模型為顯著模型。

從表4回歸方程系數顯著性檢驗可知,在p=0.05顯著水平,模型一次項X1、X2和X3都顯著;交互項X1X2顯著,X1X3和X2X3不顯著;二次項X12和X32顯著,X22不顯著。各因素對抑菌活性的影響不是簡單的線性關系,利用軟件對表4中的數據進行二元回歸分析,得到各因子對抑菌圈直徑(Y)影響的二次多項回歸模型:

Y=-378.94+12.37X1+17.65X2+9.05X3-0.25X1X2-0.03X1X3-0.12X2X3-0.13X12-0.33X22-0.19X32

2.3.2 響應面雙因素交互分析 二階回歸模型的響應面和等高線圖分別見圖5～圖7,通過圖中因素對響應值的直觀分析,可以對兩因素間的交互作用進行評價,并根據回歸方程求出優化工藝條件。

在培養時間為18 h的條件下,培養溫度和初始pH的交互作用結果顯示最優值分別是培養溫度37 ℃,初始pH為7,抑菌圈直徑達到最大值14.45 mm(圖5),在培養溫度一定的條件下,抑菌圈直徑隨著pH的增加而增大,當pH接近8時,抑菌圈直徑增加緩慢;在pH一定的條件下,抑菌圈的直徑隨著溫度的升高而增大,當溫度超過38 ℃后,繼續升高溫度,抑菌圈直徑呈下降趨勢,且后者的下降變化速率比前者上升的變化速率更快。從等高線圖可以看出,響應值對培養溫度的變化比對初始pH的變化更為敏感,兩者的交互作用極為顯著。

圖5 培養溫度和初始pH對抑菌圈直徑的 交互作用響應面模型Fig.5 Response surface model plot showing the effects of temperature and initial pH on antagonistic diameter

圖6 培養溫度和培養時間對抑菌圈直徑的 交互作用響應面模型Fig.6 Response surface model plot showing the effects of temperature and time on antagonistic diameter

在pH為7的條件下,培養溫度和培養時間的交互作用結果顯示最優值分別是培養溫度37 ℃,培養時間18 h,抑菌圈直徑達到最大值14.61 mm(圖6),在培養溫度一定的條件下,抑菌圈直徑隨著培養時間的增加而增大,當培養時間超過18 h后,再延長培養時間抑菌圈直徑反而下降,但是后者下降的變化速率比前者上升的變化速率明顯要慢;在培養時間一定的條件下,抑菌圈的直徑隨著培養溫度的升高而增大,當溫度超過38 ℃后,繼續升高溫度,抑菌圈直徑呈下降趨勢,后者的下降變化速率和前者上升的變化速率相當。從等高線圖可以看出,響應值對培養時間的變化比對培養溫度的變化更為敏感,但兩者的交互作用不顯著。

在培養溫度為37 ℃的條件下,初始pH和培養時間的交互作用結果顯示最優值分別是初始pH為7,培養時間18 h,抑菌圈直徑達到最大值14.61 mm(圖7),在初始pH一定的條件下,抑菌圈直徑隨著培養時間的增加而增大,當培養時間超過18 h后,再延長培養時間,抑菌圈直徑反而下降,但是后者下降的變化速率比前者上升的變化速率明顯要慢;在培養時間一定的條件下,抑菌圈的直徑隨著初始pH的升高而增大,當pH超過7后,繼續增加pH,抑菌圈直徑呈下降趨勢,后者下降的變化速率比前者上升的變化速率更快。從等高線圖可以看出,響應值對培養時間的變化比對初始pH的變化更為敏感,兩者的交互作用不顯著。

圖7 初始pH和培養時間對抑菌圈直徑的 交互作用響應面模型Fig.7 Response surface model plot showing the effects of initial pH and time on antagonistic diameter

2.3.3 培養條件優化及驗證實驗 通過design expert 8.0優化的培養條件為:培養溫度38.13 ℃,初始pH為7.00,培養時間17.87 h,抑菌圈直徑最大值為16.47 mm。結合實際情況,可將培養溫度38 ℃,初始pH為7,培養時間18 h作為實際操作的工藝參數。在優化的培養條件重復進行五次實驗,結果如表5所示,標準偏差較小,實驗結果穩定,可以進行下一步應用。

表5 驗證實驗Table 5 Verification test

2.4Lactobacillusacidophilus產細菌素的定位

Lactobacillusacidophilus菌體不同部位抑菌活性測定結果如圖8所示,胞外提取液的抑菌活性最高,其次是周質空間,而胞內提取液幾乎沒有抑菌活性,說明Lactobacillusacidophilus菌體在胞內產生的細菌素為可溶性物質,大部分分泌到了胞外培養液中,由此確定Lactobacillusacidophilus產的細菌素為胞外酶。

圖8 Lactobacillus acidophilus產細菌素定位Fig.8 Bacteriocin localization of Lactobacillus acidophilus

2.5Lactobacillusacidophilus產細菌素的穩定性

2.5.1 對熱的穩定性 將經過硫酸銨沉淀的粗提液分別在不同的溫度條件下進行處理,以未經溫度處理的粗提液作為對照,不同溫度處理的粗提液的抑菌活性如圖9所示。

圖9 溫度對細菌素抑菌活性的影響Fig.9 Inhibitory activity of the bacteriocin treated by different temperature

從圖9可以看出,Lactobacillusacidophilus產生的細菌素受溫度的影響較大,當溫度低于70 ℃時,雖然隨著溫度升高該細菌素質抑菌活性有所下降,但沒有顯著性差異,總體上比較穩定;在溫度達到80 ℃時,細菌素質的抑菌活性大幅下降,與之前的抑菌活性相比有顯著性差異;當溫度達到100 ℃時細菌素失去活性,說明該細菌素質有很好的熱穩定性。

2.5.2 對蛋白酶的穩定性 取三份經過硫酸銨沉淀的粗提液分別加入胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K溶液進行處理,后測定其抑菌活性,以加入20 μL PBS緩沖液(pH6.8)處理的粗提液作為對照,測定結果如圖10所示。

圖10 蛋白酶對細菌素抑菌活性的影響Fig.10 Inhibitory activity of the bacteriocin treated by different proteinase

從圖10可以看出,經蛋白酶處理后的粗提液與未經蛋白酶處理的粗提液相比,抑菌活性明顯下降,有顯著性差異,特別是蛋白酶K的影響最大,說明該細菌素對蛋白酶敏感。

2.5.3 對pH的穩定性 將經過硫酸銨沉淀的粗提液分別用不同pH處理,以未經處理的粗提液為對照,測定不同的pH處理后的粗提液的抑菌活性,結果如圖11所示。

圖11 pH對細菌素抑菌活性的影響Fig.11 Inhibitory activity of the bacteriocin treated by different pH

從圖11可以看出,細菌素的抑菌活性受pH的影響很大,該細菌素在中性條件下比較穩定,在強酸性和強堿性條件下抑菌活性顯著下降,與中性條件下的抑菌活性相比有顯著性差異,在pH達到10.0以上或者3.0以下失去抑菌活性,說明該細菌素的活性pH范圍很廣。

2.5.4 對紫外線的穩定性 將經過硫酸銨沉淀的粗提液置于紫外光下,距離30 cm,照射不同時間進行處理,以不用紫外光照射的粗提液為對照,測定其抑菌活性,結果如圖12所示。結果表示,隨著紫外線照射時間的延長,粗提液的穩定性受到影響,經過差異性分析發現紫外照射超過1 h其抑菌活性有顯著性降低。

圖12 紫外線對細菌素抑菌活性的影響Fig.12 Inhibitory activity of the bacteriocin treated by ultraviolet irradiation

3 結論

乳酸菌細菌素是乳酸菌在代謝過程中產生的多肽類的抑菌物質,具有無毒、高效、耐酸、耐高溫等特點,可用來代替化學防腐劑應用于食品保鮮。本課題組保存的一株Lactobacillusacidophilus所產生的細菌素對大腸桿菌有很好的抑制作用,在MRS培養基中,Lactobacillusacidophilus產生細菌素的最適條件為培養溫度38 ℃,初始pH7.0,培養時間18 h,抑菌圈直徑為16.47 mm,在此條件下驗證實驗結果為16.21 mm,相對偏差小,說明該工藝條件穩定。通過硫酸銨鹽析對發酵液中的細菌素進行提取,發現沉淀有抑菌作用,初步可以斷定為蛋白類物質,且通過定位實驗發現細菌素大部分存在于細胞外。細菌素在40～90 ℃有活性,具有良好的熱穩定性;在蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后,抑菌活性大大降低;在pH3.0～10.0之間具有抑菌活性;紫外照射時間超過1 h,其抑菌活性有顯著性的減低。本研究對于Lactobacillusacidophilus產生的細菌素的分離、純化和鑒定等后續工作奠定了理論基礎。

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Extraction of bacteriocin produced byLactobacillusacidophilusand biology characteristic analysis

RAN Jun-jian,JIAO Ling-xia,LIANG Xin-hong,HE Hong-ju,ZHU Ming-ming,LU Yan-qing,ZHAO Rui-xiang*

(Henan Institute of Science and Technology,School of Food Science,Xinxiang 453003,China)

Response surface methodology was used to optimize the conditions for producing bacteriocin,biological methods was applied for localization of bacteriocin and the stabilization of bacteriocin ofLactobacillusacidophilus. Results showed that the optimal bacteriocin production forLactobacillusacidophiluswere:38 ℃,pH7.0 and 18 hours in MRS medium.Lactobacillusacidophilusfermentation broth could inhibit the growth ofEscherichiacoliwhich was mainly in the extracellular extracts. The bacteriocin had good heat stability under 40～70 ℃. The inhibitory activity was decreased by the treatment with proteinase K,pepsin and trysin. The active pH of the bacteriocin to the pathogen was from 3.0 to 10.0. The inhibitory activity was stable with the time of ultraviolet irradiation 0.25～1 h. These results may provide an important reference for separation and application of bacteriocin produced byLactobacillusacidophilus.

Lactobacillusacidophilus;bacteriocin;localization;antimicrobial activity;stability

2016-12-27

冉軍艦(1981-)，男，博士，副教授，主要從事食品生物技術的研究，E-mail：ranjunjian@126.com。

*通訊作者:趙瑞香(1966-)，女，博士，教授，主要從事食品營養因子的研究，E-mail：zhaoruixiang103@126.com。

國家自然科學基金青年基金(31401673)；河南科技學院高層次人才科研項目(2015016)；河南科技學院科技創新基金(2015006)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)13-0112-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.021