產順式-4-羥脯氨酸枯草芽孢桿菌工程菌的構建及發酵優化

張博文,陳可泉,曹偉佳,王 昕

(南京工業大學生物與制藥工程學院,江蘇南京 211816)

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產順式-4-羥脯氨酸枯草芽孢桿菌工程菌的構建及發酵優化

張博文,陳可泉,曹偉佳,王 昕*

(南京工業大學生物與制藥工程學院,江蘇南京 211816)

順式-4-羥脯氨酸(CHOP)是一種重要的手性結構物質,可廣泛用于藥物以及香料制造。本研究為開發CHOP的生物合成方法,將來源于中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)的L-脯氨酸-4-羥化酶在枯草芽孢桿菌WB800N中實現了成功表達,構建獲得了能夠以L-脯氨酸為底物合成CHOP的工程菌株,進而對該菌株的發酵條件以及發酵組分進行了優化研究。結果表明:工程菌株的最適發酵溫度為25 ℃,最適誘導劑濃度為1 mmol/L,最適發酵pH為5;在發酵體系中加入5 mmol/L硫酸亞鐵和2.5 g/L L-脯氨酸時最有利于合成CHOP。在最優發酵體系下發酵60 h后,順式-4-羥脯氨酸的產量可以達到120.2 mg/L。本文成功的構建了羥脯氨酸生產菌株枯草桿菌WB800 pHT-P4H,而研究結果為枯草桿菌工程菌發酵生產順式-4-羥鋪氨酸提供了基礎。

L-脯氨酸順式-4-羥化酶,枯草桿菌WB800N,發酵,順式-4-羥脯氨酸

L-羥脯氨酸(L-hydroxyproline)不屬于20種常見的氨基酸,作為膠原蛋白的主要組成成分,羥脯氨酸廣泛應用于醫藥、化工、動物飼料和美容業等方面[1]。在醫藥方面,羥脯氨酸作為原料可用于合成消炎藥、碳青霉烯類抗生素等藥物。在化工方面,羥脯氨酸可作為手性原料合成多種聚合物[2]。順式-4-羥脯氨酸(CHOP)是羥脯氨酸四種立體異構體中的一種,該物質作為一種重要的手性結構物質,可以用于藥物以及香料制造,具有很高的藥用價值,用于治療各種癌癥[3]。另外,羥脯氨酸具有獨特的風味,苦中帶著甜味,能改善果汁飲料風味,而且還具有皮膚修復功能[2],常作為飲料添加劑。

圖1 順式-4-羥脯氨酸生物合成的路線圖Fig.1 Scheme of the biochemical reaction involved in cis-4-hydroproline production

目前,順式-4-羥脯氨酸的生產主要以酸水解膠原蛋白得到反式-4-羥脯氨酸為原料,通過化學法差向異構合成[4-5]。但該方法存在工藝繁瑣、污染嚴重、生產成本高,產量較低和分離純化困難等缺點[6]。近幾年,隨著生物技術的迅猛發展,人類改造微生物作為細胞工廠進行生物制造的能力顯著提高[7],生物合成以其操作簡便、反應條件溫和、副產物少、無環境污染、成本低等多種優點受到人們的廣泛關注[8]。因此開發順式-4-羥脯氨酸的生物合成法具有重要意義。

2009年,Kino課題組首次在百脈根中慢生根瘤菌以及苜蓿中華根瘤菌發現了L-脯氨酸順式-4-羥化酶(P4H)[9],該酶以L-脯氨酸、α-酮戊二酸為底物生成丁二酸和順式-4-羥脯氨酸[7](圖1)。研究發現P4H具有較高的立體選擇性[10],可有效生成順式-4-羥脯氨酸,不需要化學差向異構[6]。P4H 屬于α-酮戊二酸依賴型的雙加氧酶家族,酶催化反應需要非血紅素亞鐵離子以及O2的參與[8]。現有研究中主要以大腸桿菌為宿主細胞,通過構建表達P4H的工程大腸桿菌,進而通過全細胞催化方法或發酵法合成順式-4-羥脯氨酸[8]。如Francesco等人在大腸桿菌E.coliBL21(DE3)(pLysS)過表達P4H羥化酶基因,發酵生產了89.33 mg/L順式-4-羥脯氨酸[11]。趙利維等人構建過表達P4H的工程大腸桿菌,全細胞轉化60 h后,L-脯氨酸的轉化率達到83.33%[12]。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)同樣是當今工業酶的主要生產菌種之一,由于其營養需求簡單、產酶量高、種類多、安全性好等優點,在現代工農業生產領域廣泛應用[13]。本研究選源于中華根瘤菌的L-脯氨酸順式-4-羥化酶P4H作為生產酶,優化基因序列后將該基因首次在枯草芽孢桿菌中表達,得到工程菌株。進而通過優化發酵培養基和發酵條件,確定了發酵培養基的最佳培養基組成和濃度以及發酵條件,為以后的工業化生產提供了初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株及質粒 本實驗使用發酵菌株為枯草芽孢桿菌WB800N，本實驗室提供;大腸桿菌TransT1 全式金生物技術有限公司,用于質粒構建和克隆;克隆表達載體為pHT-01 本實驗室提供;限制性內切酶EcoR I、BamH I、HindIII、XbaI以及DNA Marker、T4連接酶 Takara公司;DNA膠回收試劑盒和質粒銷量抽提試劑盒 北京全式金生物技術公司；順式-4-羥脯氨酸標準品 色譜級，Sigma;L-脯氨酸 食品級，鄭州天順食品添加劑有限公司;其它常用試劑 分析純，國藥集團化學試劑有限公司;三氟丁酸及七氟乙酸 色譜級，阿拉丁試劑上海有限公司;酵母粉和蛋白胨 OXOID公司;氯霉素 上海生工生物工程有限公司。

M9液體培養基 葡萄糖10 g/L,NH4Cl 10 g/L,NaCl 0.5 g/L,Na2HPO4·12H2O 17.1 g/L,KH2PO43 g/L,MgSO40.12 g/L,CaCl21.1×10-2g/L,(NH4)6Mo7O243.71×10-3g/L,H3BO32.47×10-2g/L,CoCl2·6H2O 7.14×10-3g/L,CuSO4·5H2O 2.51×10-3g/L,MnCl2·4H2O 1.60×10-2g/L,ZnSO4·7H2O 2.8×10-3g/L；LB液體培養基 蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,氯化鈉5 g/L,12l ℃高壓蒸汽滅菌15 min;使用前加入合適濃度的抗生素；LB固體培養基 蛋白胨10 g/L,酵母浸粉5 g/L,氯化鈉5 g/L,瓊脂糖25 g/L,121 ℃,15 min高壓蒸汽保溫滅菌;使用前加入合適濃度的抗生素。

SW-CJ-1FD生物凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;BS124S電子天平 Sartourius公司;Eporator電轉化儀 Eppendorf;HVE-85高壓蒸汽鍋 HIRAYAMA公司;H2050R-1離心機 湘儀離心機有限公司;THZ-D臺式恒溫振蕩器 太倉市實驗設備廠;721B1210792凝膠成像儀 BIO-RAD;GO-1510全波長酶標儀 Thermo;ALLtech Series1500 ELSD2000液相 Alltech。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株構建 根據已公布的苜蓿中華根瘤菌中的P4H 基因序列(NCBI Gene ID:14808181)以枯草芽孢桿菌為宿主進行密碼子優化,并由Genscript(金唯智)公司進行基因合成。將合成的基因(見下文)兩端加入BamH I和Xba I酶切位點,酶切連接至載體pHT-01中,轉化連接后的連接液進入全式金公司大腸桿菌Trans-T1中,并在含有氯霉素(Cm)的LB固體培養基上進行篩選,取單菌落進行菌落PCR驗證后,驗證并得到質粒pHT-P4H,隨后將pHT-01-P4H電轉化進WB800N菌種中[14],并在含有氯霉素(Cm)的LB固體培養基上進行篩選,菌落測序驗證正確后,得到工程菌株WB800N-P4H。同時將空質粒pHT-01轉入菌株WB800N中,得到的菌株作為對照菌株。

脯氨酸羥化酶的基因序列:

GGATCC為BamH I的酶切位點，TCTAGA為XbaI的酶切位點。

1.2.2 菌株培養 種子培養:將10 μL的工程菌WB800N-P4H甘油凍存菌接種于含有5 mL的LB液體培養基的50 mL搖管中,加入終濃度為25 mg/L的Cm抗生素。置于37 ℃搖床中,200 r/min過夜培養;

發酵培養:將1 mL上述種子液接種于含有50 mL M9液體培養基的500 mL搖瓶中,加入36.7 μL的34 g/L Cm抗生素使其濃度為25 mg/L,37 ℃,200 r/min條件下進行培養,當OD600值達到0.3～0.6時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),使其終濃度為1 mmol/L,于30 ℃發酵36 h。

1.2.3 發酵培養條件優化

1.2.3.1 發酵溫度的影響 初始發酵溫度37 ℃,細胞OD600生長到0.3～0.5時加入IPTG,使其終濃度達到1 mmol/L,將細胞分別在20、25、28、30、34 ℃下培養36 h。

1.2.3.2 IPTG的影響 細胞OD600生長到0.3～0.5時加入IPTG,使其終濃度分別為0.50、0.75、1.00、2.00 mmol/L,之后在25 ℃條件下培養36 h。

1.2.3.3 pH的優化 通過調節磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀的配比配制不同pH(4、5、6、7、8)的緩沖液,磷酸鹽終濃度為100 mmol/L,細胞量生長到0.3～0.5 g/L時加入終濃度為1 mmol/L IPTG,25 ℃條件下培養36 h。

1.2.4 發酵組分優化

1.2.4.1 鐵離子類型的影響 細胞OD600生長到0.3～0.5時加入IPTG,使其終濃度達到1 mmol/L,之后分別加入硫酸亞鐵(FeSO4)、三氯化鐵(FeCl3)使得加入鐵離子終濃度為5 mmol/L,25 ℃條件下培養36 h。

1.2.4.2 鐵離子濃度的優化 細胞OD600生長到0.3～0.5時加入IPTG,使其終濃度達到1 mmol/L,同時分別加入不同濃度的硫酸亞鐵使加入鐵離子終濃度分別為1.25、2.5、5、7.5、10 mmol/L,25 ℃條件下培養36 h。

1.2.4.3 底物濃度對順式-4-羥脯氨酸產量的影響 細胞OD600生長到0.3～0.5時加入IPTG使其終濃度達到1 mmol/L,同時向培養基中加入不同濃度的脯氨酸使其終濃度分別為1、2.5、5、10、20 g/L,并加入終濃度為5 mmol/L的硫酸亞鐵,25 ℃條件下培養36 h。

1.2.5 最優底物濃度及最優發酵條件下順式-4-羥脯氨酸的生產 在M9培養基中接種1 mL種子液,在pH為5 的條件下培養,當細胞OD600值達到0.3～0.5 時,加入2.5 g/L脯氨酸,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG,并加入終濃度為5 mmol/L的硫酸亞鐵,在25 ℃條件下進行發酵。

1.2.6 分析方法 順式-4-羥脯氨酸和L-脯氨酸的測定采用液相色譜法(ALTECH ELSD 2000)進行。色譜柱為C18分析柱(5 μm,250 mm×4.6 mm,GRACE),流動相為0.7%的三氟乙酸和0.0653%七氟丁酸,流速 1 mL/min,進樣體積10 μL,柱溫28.5 ℃,所使用的蒸發光測器檢測漂移管溫度為115 ℃,氣體流速為3.2 L/min。

制作標準曲線:取15～500 mg/L的標準羥脯氨酸樣品,然后分別進樣10 μL。通過液相測定相應峰高峰面積,制作出的標曲線性相關系數達到0.998以上,該方法重復率較高,穩定性好。

樣品測定:樣品羥脯氨酸,當樣品含量高時,可用蒸餾水稀釋至標曲氨基酸標曲范圍內。當樣品濃度高于15 mg/L且低于500 mg/L時樣品濃度檢測線性較好。不同的蒸發光檢測器靈敏度不同,對于檢測值也有一定的影響。

1.3 數據統計分析

每個實驗都至少進行三次平行實驗。運用Excel 2007對實驗數據進行統計分析,比較實驗數據中的標準誤差,采用Excel 2007做圖。

2 結果與討論

2.1 產順式-4-羥脯氨酸枯草芽孢桿菌工程菌的構建和驗證

為構建獲得生產順式-4-羥脯氨酸的工程枯草芽孢桿菌,本研究將來源于中華根瘤菌的編碼L-脯氨酸順式-4-羥化酶基因的序列進行密碼子優化,酶切連接到枯草芽孢桿菌胞內表達質粒pHT01中得到質粒pHT01-P4H(圖2A),轉化枯草芽孢桿菌WB800N獲得工程菌株WB800N-P4H。經菌落PCR驗證后發現質粒已成功轉入枯草芽孢桿菌中(圖2B)。為了驗證該菌株中的重組羥化酶是否具有活性,對工程菌株進行發酵培養,如圖2C所示,對照菌株沒有產物生成,而工程菌株WB800N-P4H可以生產19.28 mg/L的CHOP,表明了L-脯氨酸順式-4-羥化酶能夠在枯草芽孢桿菌中獲得表達,所構建的工程菌株可用于后續CHOP的生產。

圖2 產順式-4-羥脯氨酸枯草芽孢桿菌 工程菌的構建和驗證Fig.2 The construction and identification of engineered Bacillus subtilis producing CHOP注:(A)質粒pHT01-P4H的圖譜; (B)WB800N-P4H菌落PCR驗證圖譜; (C)重組枯草芽孢桿菌WB800N-P4H的活性檢測。

圖3 發酵條件對工程菌株WB800N-P4H生產CHOP的影響Fig.3 The effect of fermentation conditions on the CHOP production by the recombinant strain WB800N-P4H注:(A)溫度對工程菌株生產CHOP的影響; (B)誘導劑IPTG添加對工程菌株生產CHOP的影響; (C)發酵pH對工程菌株生產CHOP的影響。

2.2 順式-4-羥脯氨酸的發酵條件的優化

發酵的培養條件作為發酵過程的重要因素之一,影響著菌株的生長代謝,從而調節微生物的生長和代謝產物的合成[15]。因此優化工程菌株的發酵條件,選擇最優的培養環境,對于提高工程菌株WB800N-P4H的順式-4-羥脯氨酸產量具有重要作用。

2.2.1 溫度對工程菌株WB800N-P4H合成順式-4-羥脯氨酸的影響 各種微生物都有其最適宜的生長溫度,發酵本身就是微生物生長代謝及物質轉化的過程,因此溫度控制是發酵過程的關鍵[16]。本文研究了不同培養溫度對菌體生產順式-4-羥脯氨酸的影響[17]。如圖3A所示,當溫度為25 ℃時,CHOP的產量達到了最大值，隨著溫度的進一步提高,CHOP的產量有所下降。溫度不僅影響重組基因的表達和蛋白質的折疊[11],也影響菌株本身的代謝途徑。因此從圖中可以看出，當工程菌株在25 ℃條件下進行發酵培養時,最有利于CHOP的生成。

2.2.2 IPTG濃度對工程菌株生產順式-4-羥脯氨酸的影響 誘導劑IPTG的濃度對目標基因的表達水平具有顯著的影響作用[18]。為了研究IPTG濃度對發酵合成順式-4-羥脯氨酸的影響。如圖3B所示,隨著IPTG濃度有所增加,CHOP的生成量有所增加。IPTG濃度達到1 mmol/L時,CHOP的產量達到最高值,隨著IPTG濃度的繼續提高,CHOP的產量有所下降。這可能是由于IPTG濃度過高時,將會作為毒性物質,影響細胞的繁殖和生長[19]。上述結果表明,工程菌株發酵生產CHOP的最適IPTG濃度為1 mmol/L。

2.2.3 pH對工程菌株生產順式-4-羥脯氨酸的影響 為了研究發酵pH對順式-4-羥脯氨酸合成的影響,將培養基的pH分別調節在4～8。如圖3C所示,隨著發酵液中pH的增加到5時,CHOP產量達到最大值,隨著發酵液pH的進一步提高,CHOP的產量開始下降,在pH為8時,在發酵液中無法檢測到CHOP的生成。這些結果表明工程菌株發酵生產CHOP的最適pH為5,在偏堿性的條件下工程菌株的CHOP生產能力受到顯著抑制。

2.3 順式-4-羥脯氨酸發酵培養基組分的優化

在工業化生產中,發酵培養基組分很大程度上影響著目標產品的產量。培養基組分的優化有利于降低大規模工業化生產的成本[20]。本研究通過優化CHOP發酵生產過程中的培養基組分,探索影響CHOP發酵生產的關鍵因素等,以提高發酵水平,為CHOP的工業化生產奠定基礎。

2.3.1 鐵離子對菌體合成順式-4-羥脯氨酸的影響 研究表明,L-脯氨酸順式-4-羥化酶屬于α-酮戊二酸雙加氧酶家族,二價鐵離子能夠促進該酶所催化的羥化反應效率[21]。為了研究不同鐵離子對工程菌株發酵生產CHOP的影響,在發酵培養基中加入不同種類的5 mmol/L的鐵離子。如圖4所示,加入硫酸亞鐵時,順式-4-羥脯氨酸產量最高,是對照的1.25倍。加入三氯化鐵時,順式-4-羥脯氨酸和對照相比并沒有提高,說明在工程菌株發酵過程中加入硫酸亞鐵能促進CHOP生產。

圖4 不同鐵離子添加對工程菌發酵生產CHOP的影響Fig.4 The effect of different iron ions on CHOP production

2.3.2 二價鐵離子濃度對菌體合成順式-4-羥脯氨酸的影響 不同的二價鐵離子濃度對目標產物的生產有著不同的影響[22]。因此,通過在培養基中添加不同濃度的二價鐵離子來研究鐵離子濃度對CHOP生產的影響。結果如圖5所示,隨著Fe2+濃度的增加,CHOP的產量也不斷地增加,當添加5 mmol/L的鐵離子,CHOP的產量達到了最大值。繼續增加Fe2+濃度,隨著Fe2+濃度的提高,CHOP的產量隨著Fe2+的增加而減少。

圖5 二價鐵離子濃度對工程菌發酵生產CHOP的影響Fig.5 The effect of Fe2+ concentration on the CHOP production

2.3.3 底物濃度對工程菌株生產順式-4-羥脯氨酸的影響 發酵初始時不同的底物濃度對于CHOP的生產有著不同的影響[22]。為了研究底物濃度對工程菌株發酵生產CHOP的影響,在不同的底物濃度下將工程菌株發酵36 h,檢測CHOP的生成。結果如圖6所示,隨著底物濃度的增加,CHOP的產量也有所提高。當添加2.5 g/L的脯氨酸時,CHOP的產量達到最高為103.3 mg/L。當繼續增加底物濃度時,羥脯氨酸產量有所下降。這可能是由于過高的底物濃度抑制了CHOP的生產,該反應存在底物抑制現象[23]。所以底物濃度為2.5 g/L,最有利于羥脯氨酸的生成,并且后期可以通過分批補料的方式提高CHOP的生成。

圖6 底物濃度對工程菌發酵生產CHOP的影響Fig.6 Effect of substrate concentration on CHOP production

2.4 最優培養基組分和最優發酵條件下的發酵結果

根據上述研究,我們確定了工程菌株WB800N-P4H發酵生產CHOP的最優反應條件以及培養基組分濃度。因此我們將菌株WB800-P4H在最優條件下進行發酵,每隔12 h取樣觀察CHOP的產量。結果如圖7所示,同未優化的發酵條件相比,CHOP的產量明顯提高。同時在最優發酵條件下,隨著發酵時間的增加,CHOP的產量也不斷地增加,當發酵時間為60 h時,CHOP的產量達到了最大值。當發酵60 h后CHOP的產量并沒有提高反而有所下降,這表明枯草芽孢桿菌WB800N中可能存在CHOP的降解途徑,使得發酵后期菌體開始降解產物CHOP。所以枯草發酵合成羥脯氨酸最適時間為60 h,羥脯氨酸產量達120.2 mg/L,相比對照提高了約6.3倍。在后續的研究工作中,如果能夠解析細胞中的CHOP降解途徑,并進一步對該途徑進行敲除,則有利于提高脯氨酸生成CHOP的轉化率。

圖7 在優化條件下工程菌WB800N-P4H 發酵生產CHOP的特性Fig.7 The CHOP production by the recombinant strain WB800N-P4H in the optimized fermentation conditions

3 結論

生物法生產順式-4-羥脯氨酸不僅大大降低了生產成本,也對于生產順式-4-羥脯氨酸具有重要意義。本研究從苜蓿中華根瘤菌中獲取L-脯氨酸順式-4-羥化酶基因,首次成功在枯草桿菌WB800N中表達,并發酵合成順式-4-羥脯氨酸。本實驗通過單因素優化實驗,得到生產順式-4-羥脯氨酸的最佳發酵條件:其中Fe2+的添加對于羥脯氨酸生產有促進作用,Fe2+濃度為5 mmol/L,發酵溫度為25 ℃,發酵pH為5,IPTG濃度為1 mmol/L,脯氨酸底物濃度為2.5 g/L。經過優化后,發酵60 h時，CHOP的產量達到120.2 mg/L。然而枯草桿菌發酵生產羥脯氨酸還有待提高,可能和枯草桿菌本身的代謝途徑及枯草桿菌對于脯氨酸及羥脯氨酸的轉運也有一定的關系。在后續研究中計劃嘗試改變枯草桿菌的代謝途徑以進一步提高底物脯氨酸轉化率,為CHOP的工業化生產奠定基礎。

[1]張自強,趙東旭,楊新林. 羥脯氨酸的研究與開發[J]. 氨基酸和生物資源,2006,28(1):55-58.

[2]劉合棟,袁春偉,張震宇.高產反式-4-羥脯氨酸重組大腸桿菌的構建以及發酵條件優化[EB/OL].[2013-01-23]

[3]Hara R,Kino K. Characterization of novel 2-oxoglutarate dependent dioxygenases converting L-proline to cis-4-hydroxy-L-proline[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications,2009,379:882-886.

[4]Theodosiou E,Frick O,Bühler B,et al. Metabolic network capacity of Escherichia coli,10for Krebs cycle-dependent proline hydroxylation[J]. Microbial Cell Factories,2014,14(1):1-12.

[5]Klein C,Hüttel W. A Simple Procedure for Selective Hydroxylation of L-Proline and L-Pipecolic Acid with Recombinantly Expressed Proline Hydroxylases[J]. Advanced Synthesis & Catalysis,2011,353(8):1375-1383.

[6]王付才,張震宇,孫付保,等. 1株產順式-4-羥基-L-脯氨酸基因工程菌的構建及發酵初步優化[J]. 食品與發酵工業,2016,42(2):7-12.

[7]李寅,曹竹安. 微生物代謝工程:繪制細胞工廠的藍圖[J].化工學報,2004,55(10):1573-1580.

[8]劉偉偉. 高產乳鏈菌肽菌種選育及發酵培養基優化[D]. 天津:天津大學,2010.

[9]姚雪娜. 產順式-3-羥脯氨酸重組大腸桿菌的構建及發酵優化[D]. 無錫:江南大學,2015.

[10]Smith J A,Savage G P,Hutt O E. Studies on the Synthesis of cis-4-Hydroxy-L-proline[J]. Australian Journal of Chemistry,2011,64(11):1509-1514.

[11]Falcioni F,Blank L M,Frick O,et al. Proline availability regulates proline-4-hydroxylase synthesis and substrate uptake in proline-hydroxylating recombinant Escherichia coli.[J]. Applied & Environmental Microbiology,2013,79(9):3091-3100.

[12]趙利維,燕瑾,韓蕊,等. 產順式-4-L-羥脯氨酸工程菌的構建及轉化條件的優化[J]. 微生物學通報,2016(9):1887-1894.

[13]張芙華. 重組枯草芽孢桿菌生產角質酶發酵條件優化[D]. 無錫:江南大學,2008.

[14]王晶. 枯草芽孢桿菌表達檢測載體的構建與生物素合成酶(BioB)的表達檢測[D]. 楊凌：西北農林科技大學,2008.

[15]周海巖. L-苯丙氨酸生產菌株的構建、代謝調控和發酵條件優化[D]. 無錫:江南大學,2011.

[16]劉中利. 白酒釀造發酵中基于智能策略的溫度優化控制[J]. 重慶理工大學學報:自然科學版,2014(7):92-96.

[17]李恬. 蔗糖為底物雙酶法合成直鏈糊精的研究[D]. 無錫:江南大學,2013.

[18]宋建民. 乳酸片球菌素的表達純化與高密度發酵研究[D]. 上海：華東理工大學,2011.

[19]王水興,李燕萍,許楊,等. 基因工程菌E.coli BL21/pET-DsbA-MalQ發酵產麥芽糖轉糖基酶的研究[J]. 食品科學,2007,28(8):285-289.

[20]曹丹玥. 微生物谷氨酰胺轉胺酶發酵培養基的優化[D]. 上海：華東師范大學,2006.

[21]張迎君,曾順德,眭順照,等. 柑桔皮發酵生產檸檬酸[C]. 中國海峽兩岸菌物學學術研討會，2004:96-99.

[22]袁林,左瑞雨,王朋朋,等. 乳酸菌富鐵的研究[J]. 中國獸醫學報,2011,31(2):241-244.

[23]趙紅英,張健,劉宏娟,等. 1,3-丙二醇發酵過程中底物抑制及其對策的研究[J]. 現代化工,2002,22(7):34-38.

Construction and optimization of fermentation ofBacillussubtiliscis-4-hydroxyproline engineering bacteria

ZHANG Bo-wen,CHEN Ke-quan,CAO Wei-jia,WANG Xin*

(Biotechnology and Pharmaceutical Engineering of Nanjing Tech University,Nanjing 211816,China)

Cis-4-hydroxyproline(CHOP)is an important chiral structure material,which can be widely used in pharmaceuticals and perfume manufacturing. In this study,in order to develop the new way to produce the cis-4-hydroxyproline by biological method,L-proline-4-hydroxylase gene derived fromSinorhizobiummelilotiwas first successfully expressed inBacillussubtilisWB800N,which converts L-proline to cis-4-hydroxyproline. The fermentation conditions and fermentation components of the strain were optimized. The results showed that adding 5 mmol/L sulfuric acid ferrous inBacillussubtilisfermentation were favourable for the formation of cis-4-hydroxyproline. The optimum fermentation temperature of cis-4-hydroxyproline was 25 ℃. The optimum concentration of inducing agent and pH were 1 mmol/L and 5,respectively. After induction,the optimum substrate L-proline concentration was 2.5 g/L. After 60 h ofBacillussubtilisferment cis-4-hydroxyproline,cis-4-hydroxyproline concentration of 120.2 mg/L was achieved. This study construct a strain ofBacillussubtilisWB800N pHT-P4H to produce CHOP,and microbial fermentation byBacillussubtilisWB800N is a potential approach for cis-4-hydroxy-L-proline production by fermentation.

L-proline-4-hydroxylase;BacillussubtilisWB800N;fermentation;cis-4-hydroxyproline

2016-12-08

張博文(1992-),男,碩士在讀,研究方向:系統代謝工程及酶催化,E-mail:1113071788@qq.com。

*通訊作者:王昕(1988),女,博士,中級,研究方向：系統代謝工程及酶催化,E-mail:xinwang1988@njtech.edu.cn。

國家自然科學基金(21576134)。

TS

A

1002-0306(2017)13-0101-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.019