酶法制備硫酸軟骨素寡糖及其抗氧化活性

張 靜,張京良,朱常亮,姜言暉,沈照鵬,江曉路,3,4,*

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003;2.中國海洋大學醫藥學院,山東青島 266003;3.青島海洋生物醫藥研究院,山東青島 266071;4.青島明月海藻集團有限公司海藻活性物質國家重點實驗室,山東青島 266400)

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酶法制備硫酸軟骨素寡糖及其抗氧化活性

張 靜1,張京良2,3,朱常亮2,姜言暉1,沈照鵬2,3,江曉路1,3,4,*

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003;2.中國海洋大學醫藥學院,山東青島 266003;3.青島海洋生物醫藥研究院,山東青島 266071;4.青島明月海藻集團有限公司海藻活性物質國家重點實驗室,山東青島 266400)

采用硫酸軟骨素酶對硫酸軟骨素進行酶法降解,制備硫酸軟骨素寡糖。通過紅外分析降解前后的硫酸軟骨素以及利用質譜技術對該酶解產物進行分析,并檢測酶解前后硫酸軟骨素的DPPH自由基的清除能力、羥自由基清除能力和還原能力。結果顯示,酶法降解硫酸軟骨素對其基本結構影響不大,質譜分析結果表明,該酶解產物是二糖和四糖。抗氧化活性實驗表明,硫酸軟骨素寡糖對DPPH自由基、羥自由基的清除能力及其還原能力均高于硫酸軟骨素。推測其可能是由于硫酸軟骨素降解成硫酸軟骨素寡糖后,分子量的減小、不飽和雙鍵的形成以及還原糖的含量增加使得其活性增加。

酶法,硫酸軟骨素,寡糖,抗氧化活性

硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)是一種酸性粘多糖,是以D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖胺通過β-1,3糖苷鍵相結合的雙糖為基本單位[1],聚合而成的一類大分子多糖,其廣泛分布于動物組織的細胞外基質和細胞表面[2],如動物喉骨、鼻骨、軟骨,肌膜和血管壁等。因此,工業生產中的CS主要是從動物的軟骨里面提取和純化[3],比如豬[4],牛[5],鯊魚[6],魷魚[7],鱘魚[8]等。CS具有多種生物活性和藥用價值[9],如:抗凝血、降血脂、抗動脈粥樣硬化、治療關節炎、抗腫瘤等。

CS的相對分子質量大小對其發揮生物活性有著重要的影響。由于大分子的多糖體積較大,較難透過細胞膜從而不能很好的在機體內發揮其多種藥理功能,而低分子量的CS具有溶解性好、粘度小、易吸收和生物利用度高等特點[10],因此,近年來低分子量CS的制備及其用途已逐步成為熱點。目前,CS低聚糖的制備方法主要有酸解法[11]、過氧化氫氧化降解法[10]和酶解法[11]。酶法降解相對于其它的降解方法,具有反應條件溫和、無污染、工藝簡單,適合于CS低聚糖的工業化生產,具有較大的優勢。但是不同來源的酶對硫酸軟骨素降解的機理可能不同,導致最后產生的CS寡糖的結構和功能可能也會有所不同,張蓮[11]等人通過動物來源的透明質酸酶對硫酸軟骨素進行降解,得到的CS低聚糖為飽和寡糖。而本文采用的是細菌來源的硫酸軟骨素酶降解CS,制備得到的CS低聚糖為不飽和寡糖,同時利用紅外光譜、電噴霧電離質譜(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)分析該酶解產物,并對所得的CS寡糖與CS做了體外抗氧化活性的比較,為CS寡糖的進一步研究及其應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

市售的CS 購于青島貝爾特生物科技有限公司;硫酸軟骨素酶(11.96 U/mL) 分子質量約76 kDa,由本實驗室保存的產酶菌株Acinetobactersp.C26發酵制得;DPPH、FeSO4、無水乙醇、水楊酸、雙氧水、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、KBr等試劑均為分析純。

冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;GL-20G-II型離心機 上海安亭科學儀器廠;電熱恒溫水浴鍋 上海新苗醫療器械制造有限公司;UV-6000PC型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;Nexus470紅外光譜儀 Nicolet公司;高效液相-三重四級桿質譜聯用儀 Agilent公司。

1.2 CS寡糖的酶解工藝

1.2.1 不同加酶量對硫酸軟骨素寡糖降解的影響 配制2%的硫酸軟骨素溶液100 mL,分別加入5、10、20、30 U的硫酸軟骨素酶液,在37 ℃酶解反應6 h,將反應后的溶液稀釋成一定的倍數在OD232處檢測吸光值的大小。

1.2.2 不同反應時間對硫酸軟骨素寡糖降解的影響 配制2%的硫酸軟骨素溶液100 mL,按照最佳的加酶量添加,分別在37 ℃酶解反應1、2、4、6、8 h,將反應后的溶液稀釋成一定的倍數在OD232處檢測吸光值的大小。

1.3 CS寡糖的制備

配制2%的硫酸軟骨素溶液500 mL,按照最佳的加酶量和反應時間在37 ℃水浴中進行酶解,反應結束后加熱煮沸10 min,滅酶活,離心取上清,凍干,即得CS寡糖。

1.4 CS降解前后理化性質的測定

還原糖:DNS法[12];硫酸根:氯化鋇-比濁法[13]。

1.5 紅外光譜分析

分別稱取充分干燥的CS寡糖和CS各1 mg與烘干至恒重的KBr 100 mg混合研磨壓片,上機掃描分析,掃描范圍在400～4000 cm-1。

1.6 酶解產物的ESI-MS分析

取少量的CS酶解產物,加水溶解后,取5 μL樣品進行高分辨率負離子模式質譜分析。毛細管電壓:-3500 V;質量掃描范圍:m/z 100～2000。

1.7 CS寡糖與CS抗氧化能力的測定

1.7.1 DPPH自由基的清除能力 方法參照文獻[14],分別將CS寡糖與CS配制成不同濃度的溶液,各取2 mL加入DPPH·溶液2 mL(0.2 mmol/L,甲醇配制),混勻后室溫避光靜置30 min,在517 nm處測定吸光值。每個樣品重復三次,求平均值。從而計算不同濃度的CS寡糖和CS對DPPH自由基的清除作用。

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:A0表示2 mL DPPH·溶液+2 mL甲醇溶液的吸光值;Ai表示樣品吸光值;Aj表示樣品的本底吸收值。

1.7.2 羥自由基的清除能力 方法參照文獻[15],分別將CS寡糖與CS配制成不同濃度的溶液,各取1 mL樣品溶液加1 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液,隨后加1 mL 8 mmol/L的H2O2溶液啟動反應,37 ℃水浴30 min,在510 nm處測定吸光值Ai。以蒸餾水代替H2O2的體系測定樣品的本底吸收值Aj。每個樣品重復三次,求平均值。從而計算不同濃度的CS寡糖和CS對羥自由基的清除作用。

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:A0表示蒸餾水代替樣品溶液測得的對照;Ai表示樣品吸光值;Aj表示樣品本底吸收值。

1.7.3 還原力的測定 參照文獻[16]的方法,取不同濃度的CS寡糖和CS溶液1 mL,向其加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH6.6),鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]溶液(1%)2.5 mL,混合均勻,50 ℃水浴20 min。加入10%的三氯乙酸溶液終止反應。混合物離心10 min,取上清2.5 mL,加入去離子水2.5 mL和0.5 mL的0.1%的FeCl3。在700 nm下測吸光值。每個樣品重復三次,求平均值。

1.8 數據統計分析

所得數據采用Excel處理軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 CS寡糖的酶解工藝

2.1.1 不同加酶量對CS寡糖降解的影響 由于CS被硫酸軟骨素酶降解后會產生不飽和二糖,該二糖在232 nm處有紫外吸收,故通過檢測反應溶液中的紫外吸收值的大小可以判斷反應的進行程度。由圖1可知,當加酶量從5 U增加到20 U時,紫外吸收值逐漸增大,說明CS正處于有效的降解過程中,但當加酶量增加到30 U時,紫外吸收值不再增大,可能的原因是在該反應階段內,加酶量已經達到飽和;故考慮到實際的生產應用,加酶量為20 U為最佳。

圖 1 加酶量對CS寡糖降解的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on hydrolysis of CS oligosaccharides

2.1.2 不同反應時間對硫酸軟骨素寡糖降解的影響 由圖2可知,酶解反應在1～4 h內,酶解液的吸光值明顯增加,說明其降解效率較高,當超過4 h時,吸光值不再上升,趨于平緩。推測其可能的原因在于隨著反應時間的延長,硫酸軟骨素酶活的穩定性逐漸降低,考慮到實際生產效率,確定4 h為最佳酶解時間。

圖 2 酶解時間對CS寡糖降解的影響Fig.2 Effect of time on hydrolysis of CS oligosaccharides

2.2 CS降解前后基本理化性質分析

從表1可以看出,經酶法降解CS后得到CS寡糖,其還原糖的含量從7.37%升高至24.96%,而硫酸根的質量分數變化不大,說明酶法降解不會造成CS中硫酸根的脫除。通過對CS和CS寡糖的溶解性能做了對比,結果表明CS寡糖的溶解性能得到了很大的提高,在水中稍微攪拌即可很快溶解,而CS則需更長的時間去攪拌溶解。這種溶解性能的提高能夠給CS寡糖的進一步開發應用提供良好的基礎。

表1 CS降解前后基本理化性質分析比較(%)Table 1 Comparison of basic physicochemical properties of CS before and after degradation(%)

2.3 酶法降解對CS紅外光譜的影響

由圖3可知,經酶解得到的CS寡糖與未降解的CS的紅外光譜吸收曲線基本一致,說明酶解未對CS的基本結構造成較大的影響。其中3700～3100 cm-1之間的吸收峰是由羥基伸縮振動引起的,二者在此波長期間均有較強的吸收峰;在2930 cm-1處的吸收峰是由C-H伸縮振動引起的;1646 cm-1是羰基中的C=O伸縮振動引起的強吸收峰;1416.99 cm-1和1397.84 cm-1處的吸收峰是羧基中的C-O的伸縮振動峰;1259 cm-1和856 cm-1的強吸收峰分別是硫酸基中的S=O的伸縮振動峰和C-O-S的軸向配位的伸縮振動峰;1056 cm-1和1037 cm-1處的吸收峰是C=O=C的主要吸收峰;在926 cm-1處的吸收峰是D-葡萄吡喃糖的環伸縮振動峰。

圖3 CS和CS寡糖的紅外光譜比較Fig.3 Comparison of infrared spectra of CS and CS oligosaccharides注:a.CS;b.CS寡糖。

2.4 酶解產物的ESI-MS分析

將酶解產物進行質譜分析,結果如圖4所示,根據分子量可推測該酶解產物是二糖和四糖。硫酸軟骨素二糖是由一分子的D-葡萄糖醛酸GlcA和一分子的N-乙酰氨基半乳糖GalNAc組成,其中m/z為342和458的是二糖,其結構分別為[M-SO3-2H2O-H]-和[M-H]-,其中M為dGlcAGalNAc1S1;分子量為939的是四糖,即兩個硫酸軟骨素二糖組成,失去兩個質子且含加鈉峰,其結構為[2M+Na-2H]-。從而說明該酶能夠有效降解CS,并且產生的CS寡糖專一性好,這將為后續CS寡糖的分離純化提供了原料及其理論基礎。

圖4 酶解產物的ESI-MS譜圖Fig.4 ESI-MS spectrum of enzymatic product

2.5 抗氧化能力的測定

2.5.1 DPPH自由基的清除能力 從圖5可以看出,CS寡糖和CS對DPPH自由基均有一定的清除能力,且呈現一定的劑量關系,隨著濃度的增加清除能力逐漸增大。且從中可以發現,CS寡糖對DPPH自由基的清除能力強于硫酸軟骨素。當濃度為20 mg/mL時,CS寡糖對DPPH自由基的清除能力達到90%,而此時CS對DPPH自由基的清除能力還未達到30%。王俊[10]等人研究發現,CS分子量越低,其清除DPPH自由基的能力越來越強;而本文通過酶法降解CS產生CS寡糖,其分子量減小,DPPH自由基清除能力也增強,故可能也說明CS分子量的大小對DPPH自由基清除能力有一定的關系。

圖5 CS和CS寡糖對DPPH自由基的清除能力Fig.5 DPPH scavenging activity of CS and CS oligosaccharides

一般而言,硫酸基含量的多少對其表現出的生物活性大小有一定關系[17],但由之前對酶解CS產物的硫酸基含量測定得知,降解前后硫酸基的含量并未降低;Alkrad[18]等人報道透明質酸糖胺聚糖在降解的過程中形成雙鍵對自由基毒性的減小有很重要的作用,所以我們推測通過酶法降解CS得到的CS寡糖中含有更多的不飽和雙鍵對DPPH自由基的清除能力也起到一定的作用。

2.5.2 羥自由基的清除能力 羥自由基是氧自由基中最活躍的,會引誘鄰近的生物分子遭到嚴重的氧化損傷[14]。如圖6所示,不同濃度的CS寡糖與CS對羥自由基的清除能力均呈明顯的線性關系。清除率隨著樣品溶液濃度的增加而增大,說明不同分子量的CS對羥自由基都有一定的清除能力。當濃度為20 mg/mL時,CS寡糖對羥自由基的清除能力可達56%,而CS清除率僅為40%。

圖6 CS和CS寡糖對羥自由基的清除能力Fig.6 Hydroxy free radical scavenging activity of CS and CS oligosaccharides

王俊等[10]人利用過氧化氫氧化降解和鹽酸降解CS得到兩個不同分子量的CS寡糖,同樣表明其分子量較低的CS寡糖清除羥自由基的能力高于分子量較高的CS寡糖。丁鵬等[15]研究了黑莓果膠寡糖的抗氧化活性,當濃度同樣為20 mg/mL時,其·OH的清除率僅為40%左右,低于CS寡糖在此濃度下的清除率,與未降解的CS清除率相當。目前有報道認為多糖清除羥自由基的方式可能不是直接對羥自由基進行清除,而是通過螯合產生·OH反應中所需的金屬離子,如Fe2+,Cu+,促使它們在Fenton體系中不活躍,從而抑制羥自由基的生成[19]。

2.5.3 還原力的測定 物質的還原力測定是根據抗氧化劑自身的還原作用,給出電子而清除自由基的,還原力越強,表明其抗氧化性越強[16]。不同濃度的CS寡糖和CS溶液在700 nm處的吸光值如圖7所示。在5～25 mg/mL的濃度范圍內,CS寡糖和CS其吸光值的大小與濃度均呈現一定的線性關系。從中可以看出,當濃度為15 mg/mL時,CS寡糖的吸光值為0.587,而此時CS的吸光值僅為0.092,表明CS寡糖的還原力明顯的強于CS的還原力。

圖7 CS和CS寡糖的還原能力Fig.7 Reducing power of CS and CS oligosaccharides

Abad[20]等人認為還原力可能與還原糖的存在多少有一定的關系;由本文中酶解得到的CS寡糖中還原糖的含量為24.96%,而CS的還原糖含量為7.37%可知,CS寡糖的還原糖含量明顯大于CS中的還原糖含量,所以可能也證實了Abad這一觀點。

3 結論

經酶法降解CS制備CS寡糖,其降解產物中硫酸基的含量并未出現明顯降低,且通過紅外光譜分析表明酶法降解CS對所得的產物的基本結構未造成較大影響;說明該酶解工藝良好、不會造成產品的破壞,適合于CS寡糖的工業化生產。ESI-MS分析表明該酶解產物的主要成分是二糖和四糖。對降解前后的CS做了體外抗氧化活性的對比,分析結果表明CS寡糖的體外抗氧化活性高于CS。這可能是由于在酶解的過程中產生了不飽和二糖,里面含有不飽和雙鍵,以及還原糖含量的增加、分子量的減小對DPPH自由基、羥自由基的清除能力和還原力的提高起到了一定的作用。因此,通過酶法制備得到的CS寡糖在保健食品、藥品和化妝品等領域將具有較好的應用前景。

[1]Maccari F,Ferrarini F,Volpi N. Structural characterization of chondroitin sulfate from sturgeon bone[J]. Carbohydrate research,2010,345(11):1575-1580.

[2]凌沛學,何兆雄. 硫酸軟骨素[M]. 北京:中國輕工業出版社,2012:14-17.

[3]Maccari F,Galeotti F,Volpi N. Isolation and structural characterization of chondroitin sulfate from bony fishes[J]. Carbohydrate polymers,2015,129:143-147.

[4]Volpi N. Analytical aspects of pharmaceutical grade chondroitin sulfates[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences,2007,96(12):3168-3180.

[5]Volpi N. Quality of different chondroitin sulfate preparations in relation to their therapeutic activity[J]. The Journal of Pharmacy and Pharmacology,2009,61(10):1271-1280.

[6]Sim J-S,Im AR,Cho SM,et al. Evaluation of chondroitin sulfate in shark cartilage powder as a dietary supplement:Raw materials and finished products[J]. Food Chemistry,2007,101(2):532-539.

[7]Kinoshita A,Yamada S,Haslam SM,et al. Isolation and structural determination of novel sulfated hexasaccharides from squid cartilage chondroitin sulfate E that exhibits neuroregulatory activities[J]. Biochemistry-Us,2001,40(42):12654-12665.

[8]Zhao T,Zhou Y,Mao G,et al. Extraction,purification and characterisation of chondroitin sulfate in Chinese sturgeon cartilage[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2013,93(7):1633-1640.

[9]Huskisson E C. Glucosamine and chondroitin for osteoarthritis[J]. Journal of International Medical Research,2008,36(6):1161-1179.

[10]王俊,曾凡新,程微,等. 不同降解方式對硫酸軟骨素寡糖抗氧化活性的影響[J].湖北農業科學,2015,55(22):5707-5710.

[11]張蓮,王金鵬,孔子青,等. 硫酸軟骨素的降解及其降解產物抗氧化活性的測定[J].食品工業科技,2011,32(12):180-183.

[12]趙凱,許鵬舉,谷廣燁. 3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量的研究[J]. 食品科學,2008,29(8):534-536.

[13]邱芳萍,張玲,于健. 硫酸鋇比濁法對鹿茸多糖中硫酸基含量的測定[J].長春工業大學學報:自然科學版,2005,26(4):268-270.

[14]Yujiao Sun,Bingying Yang,Yanmin Wu,et al. Structural characterization and antioxidant activities of j-carrageenan oligosaccharides degraded by different methods[J]. Food Chemistry,2015,178:311-318.

[15]丁鵬,沈照鵬,張京良,等. 酶法制備黑莓果膠寡糖及其抗氧化活性研究[J].食品工業科技,2016,37(11):76-79.

[16]Xiaoying Xiong,Ming Li,Jing Xie,et al. Preparation and antioxidant activity of xanthan oligosaccharides derivatives with similar substituting degrees[J]. Food Chemistry,2014,164:7-11.

[17]Deepa S S,Kalayanamitra K,Ito Y,et al. Novel Sulfated Octa- and Decasaccharides from Squid Cartilage Chondroitin Sulfate E:Sequencing and Application for Determination of the Epitope Structure of the Monoclonal Antibody MO-225[J]. Biochemistry,2007,46(9):2453-2465.

[18]Alkrad J A,Mrestani Y,Stroehl D,et al. Characterization of enzymatically digested hyaluronic acid using NMR,Raman,IR,and UV-vis spectroscopies[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2003,31:545-550.

[19]Huamao Yuan,Weiwei Zhang,Xuegang Li,et al. Preparation andinvitroantioxidant activity of K-carrageenan oligosaccharides and their oversulfated,acetylated,and phosphorylated derivatives[J]. Carbohydrate Research,2005,340(4):685-692.

[20]Abad L V,Relleve L S,Racadio C D T,et al. Antioxidant activity potential of gamma irradiated carrageenan[J]. Applied Radiation and Isotopes,2013,79:73-79.

Chondroitin sulfate oligosaccharides preparedby chondroitinase and its antioxidant activities

ZHANG Jing1,ZHANG Jing-liang2,3,ZHU Chang-liang2,JIANG Yan-hui1,SHEN Zhao-peng2,3,JIANG Xiao-lu1,3,4,*

(1.College of Food Science and Engineering of Ocean University of China,Qingdao 266003,China;2.School of Medicine and Pharmacy of Ocean University of China,Qingdao 266003,China;3.Marine Biomedical Research Institute of Qingdao,Qingdao 266071,China;4.State Key Laboratory of Bioactive Seaweed Substances,Qingdao Brightmoon Seaweed Group Co Ltd,Qingdao 266400,China)

Chondroitin sulfate oligosaccharides were prepared by chondroitinase degradation. Infrared analysis of chondroitin sulfate before and after degradation and the enzymatic product was analyzed by electrospray ionization mass spectrometry,and the DPPH radicals,hydroxyl radical scavenging activity and reducing power of chondroitin sulfate and the chondroitin sulfate oligosaccharides were evaluated. Infrared spectra showed that enzymatic degradation of chondroitin sulfate had no effect on its basic structure,the results of mass analysis showed that the enzymatic product was chondroitin sulfate disaccharide and tetrasccharide. The antioxidant activities experiments showed that the DPPH radicals,hydroxyl radical scavenging activity and reducing power of chondroitin sulfate oligosaccharide were higher than chondroitin sulfate. It is speculated that the result may be because of the decrease of the molecular weight and the formation of unsaturated double bond in the chondroitin sulfate oligosaccharide,also reducing sugar content increased its activity.

enzymatic method;chondroitin sulfate;oligosaccharides;antioxidant activities

2016-12-02

張靜(1991-)，男，碩士，研究方向：應用微生物工程，E-mail：zjys1991@163.com。

*通訊作者:江曉路(1959-)，女，本科，教授，研究方向：應用微生物工程，E-mail:jiangxl@ouc.edu.cn。

山東省科技攻關;基于海藻工具酶分子動力學的褐藻膠精深加工關鍵技術(2015GSF115002)。

TS241

A

1002-0306(2017)13-0048-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.009