菠蘿皮渣中乳酸菌的分離鑒定及其生長特性研究

香換玲，何艷梅，林峰，冉苒，陳志聰，王玲

（廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088）

菠蘿皮渣中乳酸菌的分離鑒定及其生長特性研究

香換玲，何艷梅，林峰，冉苒，陳志聰，*王玲

（廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088）

從3個不同種植基地來源的菠蘿皮中初步分離出10株疑似乳酸菌，經觸酶試驗、革蘭氏染色試驗、溶鈣圈試驗、糖發酵試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、運動性試驗等生理生化試驗鑒定，證實其中的2株菌B3和C3具備乳酸菌的基本特征，初步鑒定為乳酸菌；對其生長特性進行研究，2株菌的對數生長期均為6～14 h，在22～47℃溫度范圍內有良好的耐熱能性，在pH值2.5～6.5的環境中能良好生長，說明試驗分離到的這2株乳酸菌對外界環境有良好的適應能力。

菠蘿皮；乳酸菌；分離鑒定；生長特性

0 引言

菠蘿是我國南方栽培面積較大、產量較多的大宗水果之一，成熟時色澤鮮艷、營養豐富、味道清甜、氣味芳香，深受廣大消費者的喜愛[1]。菠蘿水分含量高、不耐貯藏，產地收貨季節一般都就地加工成菠蘿罐頭、果醬、蜜餞、果干等產品[2]。在菠蘿果實的加工過程中，會產生占全果質量50%～60%的皮渣副產物[3]。這些皮渣中含有大量的糖分、纖維素、半纖維素等碳水化合物及其他適宜微生物生長的營養成分[4]。

目前，國內利用果蔬加工副產物生產青貯飼料的研究比較熱門。將菠蘿皮渣粉碎后接種乳酸菌，可以生產適合家畜飼養的青貯飼料[5-6]，這種通過乳酸菌發酵生產的青貯飼料，具有改善飼料的發酵品質、增加營養價值、提高畜禽機體抵抗力、節省養殖戶飼養成本等特點。但是，所使用的發酵乳酸菌菌種大部分都是購買于一些大型的研究所，對青貯飼料的生產存在專一性不強、生產效率較低等問題。

各種農副產品加工下腳料都有自身的特性。有針對性地從菠蘿皮渣中分離乳酸菌，旨在為菠蘿皮渣生產青貯飼料提供更為高效專一的菌種，進而提高菠蘿皮渣青貯飼料的品質和利用效率。

1 材料與方法

1.1 材料

菠蘿，采自湛江雷州3家不同種植園。

1.2 試劑

鹽酸、碳酸鈣、葡萄糖、過氧化氫酶、吐溫80，均為AR級。

MRS固體培養基、MRS肉湯培養基、PY培養基、明膠基礎培養基、色氨酸培養基、蛋白胨水培養基、瓊脂粉、酵母提取物。

1.3 主要儀器

HPX-9162MB型恒溫培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠產品；顯微鏡，OLYPUS公司產品；PHSJ-4A型pH計，上海精密科學儀器有限公司產品。

1.4 試驗方法

1.4.1 乳酸菌的富集培養[7-15]

將成熟度為九成熟的菠蘿全果取下表皮并粉碎，取樣25 g置于裝有225 mL無菌水的錐形瓶中搖勻稀釋至10-1，再依次稀釋直至10-5，振蕩培養10 min后，分別吸取100 μL上清液轉入MRS培養基中，用無菌棒涂布均勻，置于37℃培養箱中培養48 h。待菌落長成后，選擇具有乳酸菌典型菌落特征的單個菌落進一步劃線分離3次，顯微鏡觀察為純菌落后移植在MRS斜面上，在37℃條件下培養48 h，于4℃冰箱中保存備用。

1.4.2 乳酸菌的鑒定

（1）過氧化氫酶試驗。在載玻片上滴1滴過氧化氫溶液，挑取1環疑似菌株溶于過氧化氫溶液中，觀察菌體是否產生氣泡。

（2）革蘭氏染色試驗。對疑似菌進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體的個體形狀和顏色。

（3）生理生化鑒定。①溶鈣圈試驗。乳酸菌生長時，乳酸的產生會將菌體周圍的鈣溶解掉，形成透明圈。在MRS固體培養基中加入2%的碳酸鈣制成平板，取1環疑似菌劃線接種于其上，在37℃條件下培養48 h，觀察培養基中鈣的溶解性。②糖發酵試驗。在預先放有1支小導管的PY培養基中接種1～2環疑似菌株，搖勻后于37℃條件下培養24 h，觀察培養基的顏色和小導管是否浮起。③明膠液化試驗。接種1環疑似菌株于明膠培養基中，于37℃條件下培養24 h，觀察培養基凝固情況。④吲哚試驗。接種1環疑似菌株于色氨酸培養基中，于37℃條件下恒溫培養48 h，加入2滴吲哚試劑，觀察培養基上層溶液顏色變化。⑤運動性試驗。在MRS肉湯培養基中加入0.4%瓊脂粉制備半固體培養基，在其中接種1環疑似菌株，在37℃生化恒溫箱中培養48 h，觀察菌體在半固體培養基的生長情況。

1.4.3 乳酸菌生長特性研究

（1）乳酸菌的生長曲線。將疑似菌株接種于MRS肉湯培養基中，在37℃條件下培養，每隔2 h取樣，于波長600 nm處測OD值，觀察培養時間與菌株生長的關系，繪制生長曲線。

（2）乳酸菌產酸能力測試。按照上述1.4.3（1）中的培養方法，在37℃的培養條件下，每隔2 h取樣測定細菌培養液的pH值，觀察疑似菌株的產酸能力。

（3）乳酸菌耐受性試驗。乳酸菌耐受性試驗包括耐熱性、耐酸性試驗等。①乳酸菌耐熱性試驗。將疑似菌接種于MRS肉湯培養基中，分別置于17，22，27，32，37，42℃溫度下培養48 h，每株菌每個溫度下重復試驗3次，設置1個對照，觀察菌株的生長情況。②乳酸菌耐酸性試驗。用HCl溶液調節MRS肉湯培養基的酸度，使其pH值分別為2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，接種疑似菌株到各酸度梯度的MRS肉湯培養基中，每個株菌在同一酸度條件下重復試驗3次，設置1個對照，于37℃條件下培養48 h，觀察菌株生長情況。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離

按1.4.1中的方法進行操作，將各稀釋度的樣品稀釋液均勻涂布在MRS固體培養基表面，于37℃恒溫箱中培養48 h。菌落長成后，根據乳酸菌的菌落特征及顯微鏡下的個體形態特征，初步分離到10株疑似乳酸菌。

乳酸菌分離結果見表1。

表1 乳酸菌分離結果

由表1可以看出，菌落顏色大多以白色、乳白色、表面白色、底部淡黃色為主，外形以圓形為主，表面光滑、濕潤，質地均勻，容易挑取；顯微鏡下觀察其個體形態有細長桿狀或成鏈、兩端鈍圓、球狀或卵球狀，不具運動性，無芽孢。

2.2 乳酸菌的鑒定

2.2.1 過氧化氫酶試驗

過氧化氫酶試驗是乳酸菌的一個重要鑒定試驗。乳酸菌一般不會分泌過氧化氫酶，不能將過氧化氫溶液分解代謝生成水和氧氣。根據1.4.2（1）中描述的試驗方法及步驟，對挑選出的10株疑似乳酸菌進行過氧化氫酶試驗。

疑似乳酸菌的過氧化氫酶試驗結果見表2。

表2 疑似乳酸菌的過氧化氫酶試驗結果

由表2可以看出，10株疑似乳酸菌與過氧化氫溶液接觸后，A1，A2，B1，B2，B4，C1，C2，D1均呈陽性反應，不符合乳酸菌的生理特性；B3和C3呈現陰性反應，符合乳酸菌的生理特性。因此，可以初步判斷A1，A2，B1，B2，B4，C1，C2，D1均不是乳酸菌，B3和C3留待后續繼續鑒定。

2.2.2 革蘭氏染色試驗

對B3和C32株疑似菌進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體的染色情況和菌體細胞的個體形態，結果B3和C32株菌均為紫色，形態為球狀或桿狀，成對或成鏈排列，具備乳酸菌的基本特征。

2.2.3 生理生化鑒定

根據1.4.2（3）生理生化鑒定描述的試驗步驟，對B3和C32株疑似乳酸菌菌株分別進行溶鈣圈試驗、糖發酵試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、運動性試驗等。

疑似乳酸菌的生理生化試驗結果見表3。

表3 疑似乳酸菌的生理生化試驗結果

由表3中可以看出，B3和C3菌株均具備乳酸菌該有的生理生化特性，結合以上試驗，基本可以確定為乳酸菌。

2.3 乳酸菌的生長特性

2.3.1 乳酸菌的生長曲線

按照1.4.3（1）中的方法，按5%的接種量將疑似菌株B3和C3分別接種于MRS肉湯培養基中，在37℃條件下培養，每隔2 h取樣，于波長600 nm處測OD值，觀察培養時間與菌株生長的關系，繪制生長曲線。

乳酸菌的生長曲線見圖1。

圖1 乳酸菌的生長曲線

從圖1可以看出，乳酸菌B3在0～8 h的生長遲緩期內菌體數量增加比較小，曲線緩慢上升；在之后的8～14 h，菌體生成量明顯增多，為該菌生長的對數期；14 h后，菌體生成量變化不大，乳酸菌的生長進入了穩定期。乳酸菌C3生長的遲緩期在0～6 h，6～14 h為其生長的對數期，14～20 h為其穩定期。因此，B3和C32菌株均能在MRS肉湯培養基中良好生長，但C3比B3能較早進入對數期，且對數期持續時間較長。

2.3.2 乳酸菌的產酸曲線

根據1.4.3（2）乳酸菌的產酸能力測定方法，測定不同培養時間下B3和C3在培養基中酸度的變化情況。

乳酸菌的產酸曲線見圖2。

圖2 乳酸菌的產酸曲線

由圖2可以看出，乳酸菌B3和C3在前5 h的酸度變化均不明顯，培養液處于相對穩定的狀態；在5～14 h，pH值明顯下降，乳酸菌大量繁殖，培養液中總酸含量增高；14 h后，2株菌的pH值均變化不大，均保持在一個相對穩定的水平；在20 h時，B3和C3的pH值都穩定在3.5左右。由此可見，2株菌都具備較強的產酸能力。

2.3.3 乳酸菌的耐熱性

按1.4.3（3）①中描述的方法，將乳酸菌B3和C3接種到MRS肉湯培養基后，放置在17，22，27，32，37，42℃共6個溫度梯度下培養48 h，取出觀察細菌培養液的渾濁度和試管底部沉淀物，判斷其生長情況。

乳酸菌在不同溫度下的培養情況結果見表4。

表4 乳酸菌在不同溫度下的培養情況結果

由表4可以看出，乳酸菌B3和C3的生長能力受溫度的影響比較明顯。在17℃的低溫條件下，乳酸菌B3和C3不生長；從22℃開始，隨著溫度的逐漸上升，細菌的生長逐漸變得活躍，菌液濃度不斷增大；到42℃時，2株試驗菌表現出了最強的生長能力；但在47℃時，菌體的生長量又降低了。說明乳酸菌B3和C3在一定的溫度范圍內有良好的耐熱性。2.3.4乳酸菌的耐酸性

按1.4.3（3）②中描述的方法，將乳酸菌B3和C3分別按8%的接種量接種到pH值2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5的MRS肉湯培養基中，在37℃條件下培養48 h，觀察菌液濃度和試管底部的沉淀物，判斷細菌的生長情況。

乳酸菌在不同pH值中的培養情況見表5。

表5 乳酸菌在不同pH值中的培養情況

由表5可以看出，乳酸菌B3和C3能在pH值2.5～6.5的環境中生長，說明試驗所篩選2株乳酸菌的酸度耐受范圍比較廣，對外界酸度環境有良好的適應能力。

3 結論

（1）從不同種植基地來源的菠蘿果皮中初步分離出10株疑似乳酸菌，經觸酶試驗、革蘭氏染色試驗、溶鈣圈試驗、糖發酵試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、運動性試驗等生理生化試驗鑒定，證實其中的2株菌B3和C3具備乳酸菌的基本特征，判斷為乳酸菌。

（2）乳酸菌B3和C3在MRS肉湯培養基中于37℃條件下能良好生長，其對數生長期均為6～14 h；2株乳酸菌在22～47℃溫度范圍內有良好的耐熱能性；在pH值2.5～6.5的環境中能良好生長，對外界環境有良好的適應能力。

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Study of Isolation，Identification and Growth Characteristics of Lactic Acid Bacteria from Pineapple Peel

XIANG Huanling，HE Yanmei，LIN Feng，RAN Ran，CHEN Zhicong，*WANG Ling
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088，China）

Ten strains of suspected lactic acid bacteria which are initially isolated from pineapple peel that came from three different pineapple planting base.The experiments include catalase test，gram staining，calcium dissolving test，sugar fermentation test，gelatin liquefaction test，indole test，motile test.It is confirmed that the two strains of bacteria（B3and C3）have the basic characteristics of lactic acid bacteria and is judged as lactic acid bacteria though the identification of biochemistry experiments.The research of grow characterization of this two strains of bacteria showed that the logarithmic period is 6～14 h，having good heat tolerance between temperature range from 22～47℃and growing well within pH 2.5～6.5 range.In short，two strains of lactic acid bacteria which are isolated from this experiment have highly adaptability to environment.

pineapple peel；lactic acid bacteria；isolation and identification；grow characterization

TQ914.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.06.013

1671-9646（2017）06a-0041-04

2017-05-03

廣東海洋大學2016年地方高校國家級大學生創新訓練項目資助（CXXL2016008）。

香換玲（1995—），女，本科，研究方向為食品質量與安全。

*通訊作者：王玲（1965—），女，碩士，副教授，研究方向為食品加工技術及食品微生物學方面的教學與研究。