snoRNA來源的pi—sno81對乳腺癌中FOXO3a表達的影響

陳欣欣+胡小戊+夏婷

[摘要] 目的 探討snoRNA來源的piRNA在乳腺癌中對FOXO3a基因的影響。 方法 將5個化學合成的pi-snoRNAs（pi-sno44/74/75/78/81）分別轉入MDA-MB-231乳腺癌細胞后收樣提取總RNA，檢測每個piRNA對FOXO3a mRNA水平的影響，找出對FOXO3a作用最明顯的piRNA，驗證其對FOXO3a蛋白水平的影響；收集2016年3月～2016年10月在我科行乳腺根治手術的乳腺癌患者術后新鮮腫瘤及瘤旁標本28對，檢測其中pi-sno81、sno81及FOXO3a的表達情況；應用典型相關分析對pi-sno81、sno81及FOXO3a在乳腺癌及癌旁乳腺組織中的表達情況進行相關性分析，了解pi-sno81與FOXO3a的相關性。結果 qRT-PCR檢測發現，FOXO3a基因表達被pi-sno44/74/75/81上調；其中pi-sno81上調FOXO3a最明顯，且pi-sno81明顯上調了FOXO3a蛋白水平；FOXO3a在乳腺癌中呈低表達；相關性分析發現，pi-sno81在乳腺癌及癌旁乳腺組織中的表達與FOXO3a在乳腺癌及癌旁乳腺組織中的表達成正相關（P<0.001，Corr=0.835）。結論 snoRNA來源的pi-sno81能上調乳腺癌細胞中FOXO3a基因的表達，并可能通過影響FOXO3a的表達影響乳腺癌細胞的生長。

[關鍵詞]snoRNA；pi-sno81；FOXO3a；乳腺癌

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）06（c）-0008-05

[Abstract]Objective To investigate the influence of snoRNA-derived piRNA on FOXO3a gene in breast cancer.Methods Five chemically synthesized pi-snoRNAs including pi-sno44，pi-sno74，pi-sno75，pi-sno78，and pi-sno81 were transfected into MDA-MB-231 breast cancer cells and the total RNA was extracted.EachpiRNA was detected in order to find its influence on FOXO3a mRNA levels as well as the most effective piRNA on FOXO3a，and then testified its influence on FOXO3a level.The fresh tumor and peritumoral specimen in 28 pairs in breast cancer patients undergone the radical surgery of the mammary gland in our department from March to October in 2016 were collected.Among them，expressions of pi-sno81，sno81，and FOXO3a were detected.Expressions of pi-sno81，sno81，and FOXO3a in breast cancer and adjacent mammary gland tissue were in correlation analysis aiming at understanding the correlation of pi-sno81and FOXO3a by canonical correlation analysis.Results qRT-PCR detected the expression of FOXO3a was up-regulated by pi-sno44，pi-sno74，pi-sno75，and pi-sno81，of which pi-sno81 was in most remarkable on up-regulating FOXO3a.Besides，pi-sno81 greatly up-regulated the protein level of FOXO3a，a low expression in breast cancer.Correlation analysis detected that expression of pi-sno81 in breast cancer and adjacent mammary gland tissue was in positive correlation with FOXO3a in expression of breast cancer and adjacent mammary gland tissue （P<0.001，Corr=0.835）.Conclusion The snoRNA-derived pi-sno81 can up-regulate the expression of FOXO3a gene in breast cancer cells，and may affect the growth of breast cancer cells by influencing FOXO3a expression.

[Key words]SnoRNA；Pi-sno81；FOXO3a；Breast cancer

piRNA（Piwi-interacting RNA）是一類長度在26～31 nt的內源性小分子RNA，既往對piRNA的研究主要集中在生殖細胞內[1]，但最近逐漸開始了對體細胞內piRNA的研究，目前已經有研究證實了海兔的神經細胞內有大量piRNA表達[2]，也有研究證實了腫瘤細胞中也存在piRNA，筆者在既往的研究證實了乳腺癌的臨床樣本中存在GAS5編碼的核仁小分子RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）來源的5個piRNAs[3]，且這些piRNAs在乳腺癌細胞低表達，也因其來源于snoRNA，將其命名為pi-snoRNA，這些pi-snoRNA對乳腺癌的生長具有抑制作用。

FOX蛋白家族是2000年才被正式統一命名的新的轉錄因子家族，因其每個成員都含有一個高度保守的DNA結構域（即FOX結構域）而得名。目前已知哺乳動物中FOXO家族有4個成員，包括FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6，其中FOXO3a研究最多，與細胞轉化、腫瘤的發生、發展及其血管生成等有重要關系[4-5]。

既往研究發現pi-snoRNAs在乳腺癌中呈低表達，可能參與了抑制腫瘤生長的過程[3]，將化學合成pi-sno44/74/75/78/81轉入乳腺癌MCF-7細胞中，48 h后收樣，提取總RNA，送mRNA芯片檢測，發現FOXO家族的FOXO4被上調了，那么做為同屬FOXO家族的FOXO3a，一個腫瘤抑制因子，是否也受到這些piRNAs的調控而參與了piRNA抑制腫瘤的過程？本文開展了以下方面的研究。

1材料與方法

1.1臨床樣本收集

收集廣州醫科大學附屬第二醫院乳腺外科2016年3月～2016年10月接受乳腺癌根治（包括改良根治及保乳根治）乳腺癌患者術后標本28例，同一個體同時取乳腺癌組織及癌旁組織樣本，年齡為25～72 歲，平均（41.8±1.57）歲。納入標準：①女性患者；②接受乳腺癌改良根治術或者保乳手術；③無伴發其他腫瘤；④術前未接受過放化療。排除標準：①穿刺的乳腺癌組織；②乳腺癌組織或癌旁組織量太少不能進行重復試驗者。在采集樣本時已征得患者同意和簽署知情同意書，本項目已經通過廣州醫科大學倫理委員會批準。

具體操作方法：將手術切除的乳腺癌組織，在肉眼觀察典型切取1 cm×0.5 cm大小的組織塊，并將組織塊切成2 mm厚度后分裝于事先做好標記的凍存管中并放入液氮中保存，留1管行病理檢查證實為癌組織。在腫瘤旁開2～3 cm處切取1 cm×0.5 cm大小的組織塊，并將組織塊切成4 mm厚度后分裝于事先做好標記的凍存管中，留出組織做冰凍病理切片證實組織內沒有癌細胞浸潤，其余放入液氮中保存。

1.2 試劑和引物來源

試劑 RT-PCR及Real-Time PCR引物由Life公司合成，轉染、RT-PCR、Western Blot及Real-Time PCR試劑盒從TAKARA公司購買，FOXO3a抗體從proteintech公司購買，piRNA由上海吉瑪公司合成。

1.3實驗方法

1.3.1 FOXO4的mRNA和FOXO3a蛋白水平檢測 將MDA-MB-231細胞鋪12孔板待轉染，轉染小分子RNA的轉染試劑為RNAimax，將piRNAs于RNAimax試劑分別與opti-MEM混合，然后將兩者混勻，室溫放置15 min，加到細胞中，48 h后收樣提取總RNA行qRT-PCR檢測FOXO4的mRNA水平變化，同時收集細胞裂解后提取蛋白行Western blot檢測FOXO3a蛋白水平變化，所有操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.3.2 臨床樣本的處理 將約100 g組織片在液氮中研碎后融入1 ml的Trizol中裂解后按照常規操作流程提取總RNA行qRT-PCR檢測pi-sno81、FOXO3a、sno81、GAS5以及腫瘤壞死因子相關的誘導凋亡配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）在臨床樣本中的mRNA水平。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計，先對兩組樣本表達量的差值進行正態性檢驗（P=0.00），不符合正態分布，采用配對資料的秩和檢驗；piRNA與基因在臨床樣本表達之間的相關性分析采用R統計軟件進行處理，同時對FOXO3a及piRNA在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達共4組數據進行統計，請統計專業人員用R 軟件編寫程序進行計算，統計學方法為典型相關分析（canonical correlation analysis，CCA），以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 檢測pi-sno44/74/75/78/81對FOXO3a表達的影響

將人工合成的pi-sno44/74/75/78/81分別轉入MBA-MD-231細胞中，用qRT-PCR檢測FOXO3a的表達變化，發現pi-sno81上調FOXO3a的作用最明顯（圖1A）；用Western blot檢測FOXO3a蛋白水平的表達，同樣發現pi-sno81明顯上調FOXO3a蛋白水平表達（圖1B）。

2.2 FOXO3a在乳腺癌組織中低表達

收集28對接受乳腺癌改良根治或者保乳根治術患者的乳腺癌及癌旁組織，用qRT-PCR檢測FOXO3a在乳腺癌及癌旁組織的表達情況，發現FOXO3a在乳腺癌組織中的相對表達明顯低于癌旁組織（圖2）。FOXO3a在正常組織中的相對表達量的中位數為1.93（1.68～2.96），乳腺癌組織中的相對表達量的中位數為0.67（0.63～1.00），兩組樣本的表達差異有統計學意義（P<0.01）。

2.3 pi-sno81、sno81、GAS5與FOXO3a在乳腺癌及正常乳腺組織中表達的相關性分析

收集28例患者乳腺癌及癌旁乳腺組織，提取總RNA，qRT-PCR檢測pi-sno81、sno81、FOXO3a及GAS5的表達情況，利用R統計軟件編寫程序，將pi-sno81在乳腺癌及正常組織中相對表達值（兩組值）與FOXO3a的相應表達值用（兩組）進行相關性分析，統計學方法為典型相關分析統計學方法，得出pi-sno81表達與FOXO3a的表達成正相關（P<0.05），并且有較強的相關性（Corr=0.835，0.713）。除此之外，產生pi-sno81的sno81、GAS5在組織中的表達與FOXO3a也成正相關（Corr=0.713，0.75，P<0.05），圖3A～C為統計軟件分析得出上述的相關為線性相關。

2.4 FOXO3a與TRAIL在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達成正相關

研究表明并且FOXO3a是促凋亡基因TRAIL的轉錄激活因子，本研究對FOXO3a與TRAIL在乳腺癌及癌旁乳腺組織中的表達進行相關性分析，用R軟件編寫程序，用正則相關方法分析，得出兩者在臨床樣本中的差異表達成正相關（Corr=0.703，P<0.01）（圖4）。

3 討論

snoRNA是一類廣泛分布于真核生物細胞核仁的小分子非編碼RNA，研究表明snoRNA在腫瘤的發生發展中起到了十分重要的作用[6-7]。Chang等[8]發現，h5sn2在正常腦組織的表達明顯高于腦膜瘤組織中，提示缺失這種snoRNA有可能導致腦腫瘤的發生。Dong等[9]發現，U50在前列腺癌細胞中的表達水平非常低，而提高它的表達水平可以抑制前列腺癌細胞的克隆形成；進一步研究發現，帶有U50基因中2個堿基（TT）缺失純合子的個體容易患前列腺癌；該缺失突變的雜合子還與乳腺癌的發生密切相關。與U50同樣來源的SNORD44不僅低表達于乳腺癌和頭頸鱗狀細胞癌組織中，而且其表達水平還與患者預后成負相關[10]。SNORD42在非小細胞性肺癌表達水平與患者預后明顯負相關；提高癌細胞內SNORA42水平將明顯增強細胞的增殖能力和克隆形成；下調NSCLC細胞株中SNORA42的表達將誘導細胞凋亡、降低克隆形成能力和減少動物體內移植瘤的形成[11]。SNORD114-1、SNORD123、U70C（SNORA70C也被發現影響著腫瘤的發生[12-13]。我們在既往的研究中證明了pi-sno81是由含boxC/D的sno81切割而成的，本研究發現了sno81來源的pi-sno81可能通過上調腫瘤抑制因子FOXO3a抑制乳腺癌的生長，預示snoRNA除了能直接參與腫瘤的調節過程，還可能通過其來源的piRNA來發揮抑制腫瘤的功能，為研究snoRNA在腫瘤發生發展過程中的分子機制提供了新思路。由于sno81是由GAS5編碼的，而sno81切割產生了pi-sno81，我們對臨床樣本的分析發現，pi-sno81、sno81、GAS5與FOXO3a在臨床樣本中的表達成正相關，都在乳腺癌低表達，進一步說明pi-sno81與sno81在抑制乳腺癌方面發揮相同的作用，與之前的結果相互印證。

piRNA的發現是生命科學領域的一個革命性的進展。piRNA在生殖細胞中沉默轉座子元件和基因組自私性遺傳元件以確保基因組的穩定性和完整性；piR-651在胃癌、肺癌、乳腺癌等樣本中高表達，可能影響了這些腫瘤的發展[14]；piR30840可以明顯下調IL-4表達，進而抑制Th2T淋巴細胞的成熟[15]；pi-sno75可以通過激活促凋亡因子TRAIL的表達從而抑制乳腺癌的生長[3]。本研究發現了pi-sno75同源的pi-sno81可以明顯上調FOXO3a的表達，而FOXO3a已經被證實能夠促進細胞凋亡，說明pi-sno81可能通過激活FOXO3a的表達起到抑制乳腺癌生長的作用，同時進一步說明了piRNA在體細胞中尤其是腫瘤細胞中發揮了重要的作用。

大量的研究發現FOXO3a因子表達及活性改變與腫瘤的形成和進展密切相關[5]。目前已有的研究表明FOXO3a失活與乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌有關，且FOXO3a的低表達與上述這些腫瘤的預后相關。在乳腺癌中，敲除FOXO3a基因促進了腫瘤細胞的生長[16]。Sunters等[17]研究發現，在紫杉醇敏感的乳腺癌MCF7細胞株，當紫杉醇處理后，FOXO3a及其靶基因Bim和p27Kip1水平顯著升高，誘導凋亡，通過小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）抑制FOXO3a后，FOXO3a、Bim和p27Kip1降低，從而降低了藥物誘導的凋亡。Zou等[18]發現在乳腺癌細胞株MCF7中，FOXO3a通過降低一些ER調節基因的表達，從而抑制乳腺癌細胞的增殖。動物實驗發現FOXO3a的高表達能抑制E2誘導性乳腺癌的發生，然而相反，敲除FOXO3a基因卻促進腫瘤的生長。另外，HER2與通過與表皮生長因子受體家族其他成員聚合，可活化PI3K/Akt信號途徑，使FOXO3a磷酸化而抑制其轉錄活性。本研究發現在ER陰性的乳腺癌細胞中，FOXO3a受到了snoRNA來源的piRNA（pi-sno81）的調控，且FOXO3a在乳腺癌臨床樣本中低表達，這一表達與pi-sno81在乳腺癌組織中的表達相關，說明pi-sno81可能通過增強FOXO3a的作用來抑制乳腺癌的生長。

FOXO3a是上調TRAIL的轉錄激活因子[19]，這與本研究中FOXO3a與TRAIL在臨床樣本中的表達成正相關一致，既往的研究證明pi-sno75能上調TRAIL的表達，本研究中發現同樣是snoRNA切割而成的pi-sno81能夠上調FOXO3a，兩個piRNAs的作用可能存在一定的協同性。

綜上所述，pi-sno81能夠上調乳腺癌細胞中FOXO3a的表達，這與既往的研究結果一致，為piRNA在體細胞中作用的分子機制提供了新思路，也可能成為FOXO3a誘導的凋亡通路的新的調節靶點。

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（收稿日期：2017-01-06 本文編輯：許俊琴）