高脂高糖與低劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠模型的建

立姚藍(lán)++張雨潔++王健++劉菁++李琳琳++王燁+++蘭怡++毛新民

[摘要] 目的 建立高脂高糖與低劑量鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的SD大鼠的早期糖尿病腎病（DN）模型，模擬早期DN的病理改變及腎功能改變。 方法 將SPF級正常雄性SD大鼠30只按照體重隨機(jī)分為正常組、模型組。正常組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組大鼠高脂飼料喂養(yǎng)8周后，腹腔注射STZ 35 mg/kg，形成糖尿病模型后，繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后，觀察兩組大鼠腎臟病理改變、生化及腎功能各項(xiàng)指標(biāo)的改變情況。 結(jié)果 模型組大鼠體重顯著低于正常組（P < 0.01），而隨機(jī)血糖值顯著高于正常組（P < 0.01），且達(dá)到糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)。模型組大鼠血清胰島素水平顯著低于正常組，相對腎重、24 h尿微量白蛋白、α1-微球蛋白、β2-巨球蛋白值顯著高于正常組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。模型組病理特征表現(xiàn)為腎小球基底膜增厚，系膜增寬，腎小球及腎小管糖原物質(zhì)、膠原纖維聚集等。 結(jié)論 此造模方法可模擬早期DN的基本特征。

[關(guān)鍵詞] 高脂高糖；鏈脲佐菌素；糖尿病腎病

[中圖分類號(hào)] R587.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）06（b）-0012-04

Establishment of high-fat and high-glucose and low dose of Streptozocin induced rat models of diabetic nephropathy

YAO Lan1 ZHANG Yujie2，3 WANG Jian3 LIU Jing3 LI Linlin3 WANG Ye3 LAN Yi4 MAO Xinmin5

1.Staff Room of Chinese Medicinal Resources， College of Traditional Chinese Medicine， Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China； 2.Department of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China； 3.Staff Room of Pharmacology， College of Basic Medicine， Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China； 4.The Second Department of Cadres， Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine， Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830000， China； 5.College of Traditional Chinese Medicine， Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China

[Abstract] Objective To establish the early diabetic nephropathy （DN） rat model induced by high-fat and high-glucose and low dose of Streptozocin （STZ）， so as to simulate the pathologic and renal function changes of early DN. Methods Thirty SPF level of normal male SD rats were divided into normal group and model group by weight. Normal group was fed with normal diet， model group was fed with high-fat and high-glucose diet for 8 weeks continuously， then 35 mg/kg of STZ was injected intraperitoneally to establish diabetic rats model， after that， high-fat and high-glucose diet was fed for 4 weeks continuously. Renal pathological changes， biochemical and renal function indexes of two groups were observed. Results The body weight of rats in the model group was significantly lower than that of normal group （P < 0.01）， while the random blood glucose level was higher than that of normal group （P < 0.01）， which had reached to standard of diabetes mellitus. The level of serum insulin in the model group was lower than that of normal group， the values of relative kidney weight， 24 h microalbuminuria， α1-microglobulin， β2-macroglobulin were higher than those of normal group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. The pathological characteristics of model group presented the thickening of glomerular basement membrane， mesangial broadening， accumulation of glycogen and collagen fiber in both glomerulus and kidney tubules. Conclusion This molding method can imitate the basic characteristics of early DN.

[Key words] High-fat and high-glucose； Streptozocin； Diabetic nephropathy

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥，是終末期腎病發(fā)生的主要原因[1-2]。2型糖尿病人群中有1/4的患者有明顯的腎臟功能損害[3-4]。DN發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，目前尚無針對性及特異性藥物治療[5]。建立能夠更好復(fù)制人類DN發(fā)病過程及病理特征的動(dòng)物模型，則是深入闡明DN發(fā)病機(jī)制及進(jìn)行新藥研發(fā)的前提基礎(chǔ)[6-7]。美國糖尿病并發(fā)癥協(xié)會(huì)（animal models of diabetic complications consortium，AM？鄄DCC）給出了理想的DN動(dòng)物模型標(biāo)準(zhǔn)，但沒有任何動(dòng)物模型能夠完全符合該標(biāo)準(zhǔn)[8]。本研究通過高脂高糖飼料長時(shí)間喂養(yǎng)Sprague Dawley（SD）大鼠，以低劑量鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)SD大鼠建立DN動(dòng)物模型，以期探索符合DN發(fā)病機(jī)制和病理特征的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級SD大鼠，8～10周齡，體重200～250 g。由新疆醫(yī)科大學(xué)（以下簡稱“我校”）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：65000700000045。

1.1.2 動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境

所有大鼠均飼養(yǎng)在我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF級飼養(yǎng)室中。

1.1.3 主要試劑

STZ（Sigma美國，批號(hào)S0130），血糖試紙（Roch德國，批號(hào)ECS000056），檸檬酸鈉（上海西唐生物科技有限公司，批號(hào)B1065），羧甲基纖維素鈉（CMCNa）（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)9004-32-4），二甲雙胍（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)20140212），尿微量白蛋白、α1-微球蛋白（α1-MG）、β2-巨球蛋白（β2-MG）放射免疫檢測試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所，批號(hào)20150112）等。

1.1.4 主要儀器

DT5-1B低速冷凍離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司），冷凍干燥機(jī)（上海析宇儀器有限公司），VT1200石蠟切片機(jī)（Leica德國），5424SZX7-1093光學(xué)顯微鏡（Olympus日本），BS-120全自動(dòng)生化儀（Mindary深圳），Varioskan Flash酶標(biāo)儀（Thermo美國），GC-2010放免儀（北京科普順科有限公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物飼養(yǎng)方法及喂養(yǎng)飼料

大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5只。自由進(jìn)水、進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)過程中，空白對照大鼠喂養(yǎng)普通飼料（我校動(dòng)物中心提供）；糖尿病大鼠喂養(yǎng)高脂高糖飼料（實(shí)驗(yàn)人員自行制作，并經(jīng)高壓滅菌處理后使用），飼料配方如下：蔗糖20%、豬油10%、膽固醇2.5%、膽酸鈉0.5%、基礎(chǔ)飼料67%。

1.2.2 DN動(dòng)物模型的建立

將8～10周齡、體重200～250 g的SD大鼠30只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為正常組、模型組，分別給予正常飼料、高脂飼料喂養(yǎng)8周后，對模型組大鼠腹腔注射溶解于檸檬酸鈉緩沖液中的STZ溶液35 mg/kg，7 d后，尾靜脈檢測大鼠隨機(jī)血糖，以隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L為糖尿病模型成模標(biāo)準(zhǔn)。在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)采用相同飼料喂養(yǎng)4周后，處理動(dòng)物，采集標(biāo)本。參照文獻(xiàn)[9]，2型DN大鼠需具備以下條件：隨機(jī)血糖≥13.8 mmol/L，并伴有胰島素抵抗；出現(xiàn)尿蛋白、腎功能異常及相應(yīng)腎組織病理學(xué)特征，視為模型建立成功。

1.2.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.2.3.1 大鼠一般狀態(tài) 觀察造模前、造模后、給藥干預(yù)后大鼠的表觀變化，主要包括毛色、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、飲水、進(jìn)食等變化。

1.2.3.2 大鼠腎臟指數(shù) 大鼠處理后，取出腎臟，生理鹽水清洗后電子天平稱重。計(jì)算大鼠的相對腎重（KW/BW），公式如下：KW/BW=腎臟重量（mg）/大鼠體重（kg）。

1.2.3.3 大鼠血清樣本與尿樣檢測 血樣中，血糖采用全自動(dòng)生化儀檢測。尿樣中，微量白蛋白、α1-MG、β2-MG采用放免法進(jìn)行檢測。

1.2.3.4 腎臟病理學(xué)檢測 將浸泡在4%中性多聚甲醛中固定的大鼠左腎組織經(jīng)乙醇梯度洗脫、石蠟包埋、切片后，用于病理染色。

1.2.3.5 蘇木精-伊紅（HE）染色 蘇木精水溶液染色后的石蠟切片經(jīng)自來水沖洗返藍(lán)后，0.5%的伊紅溶液染色，梯度脫水、透明，風(fēng)干，樹膠封片。結(jié)果可見：細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色。結(jié)果分析方法：將染色后的切片置于顯微鏡下，400×放大觀察，拍照。在每張切片中隨機(jī)選擇30個(gè)腎小球，對每個(gè)腎小球的系膜增寬、基底膜增厚程度進(jìn)行等級評分。

1.2.3.6 高碘酸-雪夫（PAS）染色法 Schiff液染色10 min，冷水沖洗10 min，蘇木精對細(xì)胞核染色3～5 min，梯度洗脫、透明，風(fēng)干，樹膠封片。結(jié)果可見：腎組織糖原為PAS染色反應(yīng)陽性物質(zhì)，在腎小球、腎小管及腎間質(zhì)中呈現(xiàn)紫紅色或紅色顆粒狀，細(xì)胞核藍(lán)色，其他組織部分呈淡粉色。結(jié)果分析方法：在每張切片中隨機(jī)選擇30個(gè)腎小球，對每個(gè)腎小球中糖原面積進(jìn)行等級評分。

1.2.3.7 Masson染色方法 石蠟切片在苦味酸乙醇溶液中分色1 min。沖洗復(fù)染后，置于磷鉬酸中染色5 min，加入醋酸苯胺藍(lán)溶液中染色10 min，梯度脫水、透明，風(fēng)干，樹膠封片。結(jié)果可見：膠原纖維陽性染色呈藍(lán)色，肌纖維、纖維素、紅細(xì)胞呈紅色，細(xì)胞核呈黑藍(lán)色。結(jié)果分析方法：在每張切片中隨機(jī)選擇30個(gè)腎小球，對每個(gè)腎小球中膠原纖維染色面積進(jìn)行等級評分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠狀態(tài)變化情況

STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠在成模后繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周的過程中，模型組大鼠出現(xiàn)顯著的多飲、多食、多尿、消瘦、精神萎靡、毛發(fā)枯竭的表現(xiàn)，說明模型組大鼠已出現(xiàn)明顯的糖尿病癥狀。同時(shí)持續(xù)性高血糖導(dǎo)致3只大鼠死亡，成模率為80%。

2.2 大鼠血糖及體重變化

成模后4周內(nèi)，模型組大鼠體重值顯著低于正常組（P < 0.01），血糖值顯著高于正常組（P < 0.01），且隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L，達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn)。見表1～2。

2.3 兩組大鼠腎功能指標(biāo)比較

模型組大鼠血清胰島素水平顯著低于正常組，相對腎重、24 h尿微量白蛋白、α1-MG、β2-MG值顯著高于正常組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表3。

2.4 成模后大鼠腎臟病理變化情況

HE染色結(jié)果可見，正常組大鼠腎小球及腎小管未見明顯異常。模型組部分腎小球出現(xiàn)明顯系膜增寬、基底膜增厚，腎小管出現(xiàn)空泡樣病變、淋巴細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)水腫等現(xiàn)象（圖1，封三）。PAS染色可見，正常組腎小球及腎小管未見異常變化，未見明顯紫紅色糖原沉積。模型組部分腎小球系膜內(nèi)，紫紅色糖原沉積物明顯，部分腎小管一定程度擴(kuò)張，細(xì)胞內(nèi)可見糖原染色物（圖2，封三）。Masson染色結(jié)果可見，正常組腎小球、腎小管、腎間質(zhì)膠原纖維染色正常。模型組可見腎小球基底膜一定程度增厚，膠原纖維染色明顯，部分腎小管基底膜增厚，出現(xiàn)一定程度擴(kuò)張及空泡樣病變，腎間質(zhì)膠原纖維沉積明顯（圖3，封三）。HE染色結(jié)果顯示，模型組腎小球系膜增寬、基底膜增厚程度評分顯著高于正常組（P < 0.01）；PAS染色結(jié)果顯示，模型組腎小球中糖原面積評分顯著高于正常組（P < 0.01）；Masson染色結(jié)果顯示，模型組膠原纖維染色面積評分顯著高于正常組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）（圖4）。

3 討論

目前使用的DN動(dòng)物模型主要有三種類型：自發(fā)型、誘發(fā)型、轉(zhuǎn)基因型DN動(dòng)物模型[10]。自發(fā)型DN模型指動(dòng)物未經(jīng)任何有意識(shí)的人工處置，在自然情況下發(fā)生基因突變，疾病的異常表現(xiàn)，通過育種保留下來的DN模型動(dòng)物。此類模型較為接近人類DN發(fā)病過程，但由于飼養(yǎng)和育種成本較高，成模周期較長，一定程度上制約了該模型的廣泛使用；轉(zhuǎn)基因型DN動(dòng)物模型是將外源基因整合在動(dòng)物基因組內(nèi)，并通過育種遺傳給后代的一類動(dòng)物。此類模型由轉(zhuǎn)入的外源基因引起，產(chǎn)生疾病的原因清楚，模型動(dòng)物的癥狀單一[11]。但其技術(shù)水平要求較高，操作比較復(fù)雜，費(fèi)用較高，所以使其應(yīng)用受到一定限制；誘發(fā)型2型DN動(dòng)物模型主要模擬人類2型DN發(fā)生發(fā)展的過程，其原理為采用高脂、高糖飼料喂養(yǎng)大鼠1個(gè)月左右使大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗，腹腔或尾靜脈注射STZ破壞大鼠胰島細(xì)胞，使動(dòng)物部分喪失分泌胰島素功能而模擬2型糖尿病的發(fā)生，繼續(xù)喂養(yǎng)4～8周，可出現(xiàn)DN早期特征，但時(shí)間較長[12]。為進(jìn)一步縮短造模時(shí)間，可采用高脂飼料+單腎結(jié)扎（或單腎切除）+低劑量腹腔注射（或靜脈注射）STZ誘導(dǎo)DN大鼠模型，造模共需6周時(shí)間，可出現(xiàn)2型糖尿病所致的典型腎臟病變特征。但由于造模過程中需要進(jìn)行腎臟結(jié)扎或腎臟切除手術(shù)，因此模型成活率較低[13-14]。近年來研究表明，糖脂代謝紊亂與DN發(fā)病密切相關(guān)[15]。基于此原理，本研究采用長時(shí)間高脂高糖飼料喂養(yǎng)大鼠8周，低劑量STZ（35 mg/kg）誘導(dǎo)形成糖尿病模型后，繼續(xù)喂養(yǎng)高脂高糖飼料直至形成DN。結(jié)果表明，在形成糖尿病模型后的第4周，大鼠血糖水平顯著升高，同時(shí)胰島素水平顯著低于正常組，說明大鼠已經(jīng)由胰島素抵抗階段進(jìn)入胰島素代償性分泌障礙階段。早期腎功能損傷標(biāo)志性指標(biāo)α1-MG、β2-MG及24 h尿微量白蛋白水平顯著高于正常組[16-20]。本研究采用與楊亦彬等[21]相似的造模方法，4周后大鼠蛋白水平與其相似。不同于前者的是，4周觀察期，大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)高脂高糖飼料，因此腎臟病理改變較前者更為復(fù)雜，已經(jīng)出現(xiàn)早期DN腎功異常及腎臟病理特征，可用于DN早期動(dòng)物模型的研究。

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（收稿日期：2017-03-05 本文編輯：張瑜杰）