杏仁核在C57BL/6小鼠慢性疼痛發(fā)生過(guò)程中的作用研究

張夢(mèng)，孫復(fù)林

作者單位： 200436上海，上海市靜安區(qū)精神衛(wèi)生中心

慢性疼痛是由傷害性刺激引起的損傷已痊愈而疼痛依然存在的一種狀態(tài)，國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)將其稱為“超過(guò)正常的組織愈合時(shí)間的疼痛”[1]。它常常伴隨不愉快的情緒體驗(yàn)和軀體反應(yīng)，因此它既是一種生理反應(yīng)，又是一種主觀的自覺(jué)癥狀[2]。有研究顯示，杏仁核不僅對(duì)疼痛的感知維度有影響，更對(duì)疼痛的情緒維度起重要作用[3-5]。本研究擬采用動(dòng)物模型探討杏仁核在慢性疼痛中的作用及潛在機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

張夢(mèng)，孫復(fù)林.杏仁核在C57BL/6小鼠慢性疼痛發(fā)生過(guò)程中的作用研究

圖4 TROP2免疫組化結(jié)果（蘇木素，×400）

圖5 小鼠腦組織冠狀切片在解剖鏡下提示杏仁核注射喹啉酸后形成空洞

圖6 毀損杏仁核對(duì)CCI模型小鼠機(jī)械痛閾的影響

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 22只近交系 C57BL/6小鼠，成年雄性，平均體質(zhì)量（16.9±1.0）g，清潔級(jí)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠飼養(yǎng)于12/12 h晝夜交替的動(dòng)物房，溫度和濕度保持恒定，并提供充足水和食物。

1.2 試劑及配制 2，3-吡啶二羧酸，購(gòu)于美國(guó)Sigma-aldrich公司。以1ml 0.9%氯化鈉注射液溶解，550 l NaOH調(diào)節(jié)至pH約7.0，再加入0.9%氯化鈉注射液定容，得到喹啉酸溶液（QA）。配得試劑均放置于－20℃冰箱冷凍。

1.3 儀器和設(shè)備 小鼠立體定位注射儀（STOELTING，美國(guó)）、微量注射泵（Model 100 series,KDScientific Inc）、電磨（美國(guó)Dremel）、Von Frey纖維細(xì)絲（STOELTING，美國(guó)）、7360型甩尾儀（STOELTING，美國(guó)）。

1.4 方法 采用Von Frey纖維細(xì)絲法測(cè)定小鼠機(jī)械痛閾，采用小鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷（CCI）建立慢性疼痛模型。在CCI術(shù)后7 d測(cè)定機(jī)械縮足閾值，選取較基礎(chǔ)機(jī)械痛閾值下降30%的小鼠為慢性疼痛模型小鼠。術(shù)后第10天采用喹啉酸毀損小鼠杏仁核：實(shí)驗(yàn)組小鼠（ =11）杏仁核定位注射0.1mol/L喹啉酸0.5 l，次日進(jìn)行灌注、取腦，然后進(jìn)行連續(xù)冰凍切片和染色，確認(rèn)喹啉酸已破壞小鼠杏仁核組織結(jié)構(gòu)（封三彩圖5）；對(duì)照組（ =11）僅在相同部位注射0.9%氯化鈉注射液。每只小鼠在CCI術(shù)前先采用熱板法測(cè)定熱痛閾作為基礎(chǔ)熱痛閾值，分別記錄喹啉酸毀損CCI模型小鼠杏仁核后的熱痛閾、機(jī)械痛閾。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 毀損杏仁核對(duì) CCI模型小鼠機(jī)械痛閾的影響 小鼠CCI術(shù)后第7d機(jī)械痛閾較基礎(chǔ)值下降70.5%，慢性疼痛小鼠模型建立有效，本實(shí)驗(yàn)成功建立CCI實(shí)驗(yàn)小鼠模型9只，在CCI術(shù)后第10 d行杏仁核毀損術(shù)。兩組在CCI后第4 d和第7 d機(jī)械縮足閾值較注射前均升高（t=9.762、9.779，均P＜0.05）；兩組在CCI后第4 d和第7 d機(jī)械縮足閾值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.327、9.582，均P＜0.05）。見(jiàn)封三彩圖6。

2.2 毀損杏仁核對(duì) CCI模型小鼠熱痛閾的影響 兩組在CCI術(shù)后第8、16 d縮足閾值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.232、1.584，均 P＞ 0.05）；兩組CCI術(shù)后熱板試驗(yàn)縮足閾值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.457，P＞0.05）。見(jiàn)封三彩圖7。

3 討論

慢性疼痛在臨床上極為常見(jiàn)，因其持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，遷延不愈，可導(dǎo)致機(jī)體功能失調(diào)，免疫力下降和誘發(fā)各種并發(fā)癥，現(xiàn)已成為一個(gè)重要的公共健康主題。研究發(fā)現(xiàn)，慢性疼痛患者生活質(zhì)量與疼痛程度有關(guān)，疼痛的程度越重、頻率越高，則患者的生活質(zhì)量越差[6]。本研究所采用的慢性疼痛模型是由 Bennett等[7]于1988年首次復(fù)制出的CCI模型，是國(guó)際上應(yīng)用較多的疼痛模型。有學(xué)者通過(guò)建立CCI大鼠模型，揭示在疼痛發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的變化，為尋找神經(jīng)病理性疼痛的新治療靶點(diǎn)提供新的思路[8]。

中樞機(jī)制在調(diào)控各種類(lèi)型疼痛中起著重要作用，其中杏仁核參與了痛覺(jué)的編碼和調(diào)制過(guò)程，有研究報(bào)道某些難以忍受的癌性疼痛可通過(guò)切除杏仁核而終止[9]，由此推測(cè)損毀杏仁核也可緩解慢性疼痛小鼠的疼痛癥狀。有學(xué)者通過(guò)對(duì)大鼠先行進(jìn)行雙側(cè)基底外側(cè)核毀損，繼而進(jìn)行脊神經(jīng)結(jié)扎，發(fā)現(xiàn)杏仁核毀損可提升大鼠的機(jī)械縮足閾值，并持續(xù)至脊神經(jīng)結(jié)扎后14 d；而對(duì)已建立慢性疼痛的大鼠進(jìn)行雙側(cè)基底外側(cè)核毀損，并不影響其機(jī)械痛閾[10]，提示基底外側(cè)核在疼痛的慢性化過(guò)程中起作用。

目前普遍認(rèn)為杏仁核主要參與疼痛的負(fù)性情緒反應(yīng)以及逃避等動(dòng)機(jī)的形成，而與對(duì)疼痛刺激本身的感覺(jué)無(wú)關(guān)[11]。毀損杏仁核雖然不影響基礎(chǔ)痛閾，但可以減弱對(duì)于疼痛刺激的情緒反應(yīng)[12]，如減弱足底注射福爾馬林及腹腔注射乙酸所誘導(dǎo)的條件性位置回避，而不改變兩者所引起的抬腳、舔足或扭體等行為[13]。本研究通過(guò)對(duì)慢性疼痛模型小鼠進(jìn)行雙側(cè)中央杏仁核毀損，繼而測(cè)定機(jī)械縮足閾值。本實(shí)驗(yàn)采用全程連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察并統(tǒng)計(jì)小鼠機(jī)械縮足閾值、熱痛閾值，對(duì)機(jī)械痛閾作用影響的高峰期在杏仁核毀損后第4 d出現(xiàn)，并維持至術(shù)后7 d，顯示杏仁核毀損可提高慢性疼痛模型小鼠機(jī)械縮足閾值。在熱痛閾檢測(cè)方面，本研究結(jié)果提示毀損杏仁核對(duì)慢性疼痛模型小鼠熱痛閾值的影響并不明顯，其潛在的機(jī)理目前尚未明確，更深層次機(jī)制研究將在未來(lái)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探究。