河北省平菇主栽品種分子身份證的構建*

李 慧，王朝江，高春燕

（河北省農林科學院遺傳生理研究所，河北 石家莊 050051）

〈生理生化〉

河北省平菇主栽品種分子身份證的構建*

李 慧，王朝江，高春燕**

（河北省農林科學院遺傳生理研究所，河北 石家莊 050051）

以河北省主栽的17個平菇品種為材料，對構建平菇種質分子身份證的方法進行探討研究。首先應用CO1對平菇物種進行鑒定，然后利用SSR Locator軟件從Pleurotus ostreatus PC15 v2．0全基因組序列上查找SSRs位點并設計引物，采用篩選后的SSR引物對供試菌株進行擴增，然后根據引物對不同菌株擴增產生的帶型進行編碼、組合，構建SSR分子身份證。結果顯示，17個平菇品種包括4株糙皮側耳（P.ostreatus）、8株白黃側耳（P. cornucopiae）和5株肺形側耳（P.pulmonarius）。從48對SSR引物中篩選出9對引物，在17個平菇品種間共檢測到53種帶型，將不同帶型賦值編碼后組合成17個平菇品種的特異分子身份證。該研究表明CO1結合SSR標記技術可有效地用于平菇種質分子身份證的構建。

平菇；分子身份證；CO1；SSR

平菇（Oyster mushroom）是一種栽培歷史悠久，栽培范圍廣泛的食用菌[1-2]。平菇子實體肉質鮮美，營養豐富且具有一定的保健功效[3]。據中國食用菌協會統計，2015年我國平菇產量約占食用菌總產量的17%，位居第3位。

平菇原專指糙皮側耳（Pleurotus ostreatus），現常將側耳屬幾個可以栽培的近緣種泛稱為平菇[4]。平菇近緣種的鑒定方法，傳統上是依靠形態學[5]或結合拮抗試驗和同工酶分析等多項分類方法[6]。隨著現代分子生物學技術的迅速發展，多種快捷、穩定、準確的DNA分子標記技術應用到真菌鑒定中來。ITS（internal transcribed spacer） 序列分析是側耳屬鑒定的常用方法[7-8]，但是由于沒有界定種的明確界限并且ITS序列存在近緣種種內差異比種間大的問題[9]，以及數據庫序列信息的不準確性[10-11]，造成了該方法的不準確。黃晨陽[12]根據側耳屬不同物種的CO1（細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ基因）開發出特異引物可以對平菇的糙皮側耳（P.ostreatus）、白黃側耳（P. cornucopiae）以及肺形側耳（P.pulmonarius）進行準確鑒別。平菇栽培品種繁多，據報道有些省份栽培用平菇品種多達十幾至幾十個，這些品種存在嚴重的同物異名、同名異物現象[7，13]。如何準確有效地進行品種鑒別，對于平菇品種繁育、引種育種具有重要意義，也是品種知識產權保護的需要。

近年來，分子生物學手段因具有不受環境影響且變異豐富等優點，被廣泛應用到食用菌菌株鑒別中來[14-15]。尤其是分子身份證概念的提出，不僅給品種本身賦予了一個識別品種的標準，而且數字化的DNA指紋，使品種鑒別更加直觀簡潔[16]。SSR（simple sequence repeats）分子標記常用于分子身份證的構建，具有多態性高、穩定性和重復性好、易于檢測而又識別率高等優點[17]。王慧玲等[18]利用國際通用的9對SSR引物構建了13個中國葡萄優新品種的分子身份證；陳昌文等[16]從16對SSR引物中篩選出8對核心引物構建了176份桃種質的可辯分子身份證；張肖雅等[19]利用5對SSR引物將11株靈芝菌種完全區分開，并構建其分子身份證。王新新等[20]根據8對SSR引物產生的不同擴增譜型，構建了29份雙孢蘑菇菌株的分子身份證。平菇品種繁多，種質較為混亂，然而關于平菇SSR分子身份證的研究未見報道。本研究選取河北省常栽的17個平菇品種，在對平菇近緣種進行CO1物種鑒定的基礎上，通過SSR分子標記技術，構建平菇品種的分子身份證，為當地平菇品種鑒定提供理論依據，也對平菇種質分子身份證的構建提供一定的方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為河北省主栽平菇品種，來源于科研單位或菌種公司。經多年的栽培試驗測試，17個平菇品種均表現為穩定而特異的表型性狀，并且拮抗試驗顯示17個菌株兩兩之間均有拮抗。供試菌株的品種名稱和來源見表1。

表1 供試菌株名稱和來源Tab．1 Name and source of tested strains

1.2 菌絲培養和DNA提取

將活化好的平菇菌種塊轉接至鋪有玻璃紙的PDA平板上，25℃暗光培養5 d，刮取新鮮菌絲體100 mg左右，加入液氮研磨，按照植物基因組DNA提取試劑盒（購于天根生化科技有限公司） 說明，提取基因組DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測提取的DNA濃度和純度。將DNA濃度稀釋至20 ng·μL-1～30 ng·μL-1，于-20℃下保存備用。

1.3 CO1擴增和分析

參考黃晨陽[12]方法，對17個菌株進行CO1基因擴增，根據擴增條帶的大小進行物種鑒定，片段大小約為1 700 bp的為P.ostreatus，約為2 300 bp的為P.cornucopiae，約為3 600 bp的為P.pulmonarius。

1.4 SSR引物設計

從JGI數據庫中搜索并下載Pleurotus ostreatus PC15 v2．0全基因組序列 （http://genome．jgi．doe．gov/ PleosPC15_2/PleosPC15_2．download．html）。利用SSR Locator軟件對其全基因組序列進行單至六核苷酸重復SSR序列的查找[21]，并隨機選取4條位于不同scaffold上的SSR序列進行引物設計。共設計48條SSR引物用于PCR擴增。SSR引物由生工生物工程股份有限公司合成。

1.5 SSR引物篩選

選取4個平菇菌株的基因組DNA為模板進行SSR引物初篩。SSR-PCR反應體系：總體積20 μL，包括10×PCR buffer 2 μL，25 mmol·L-1MgCl22 μL，

10 mmol·L-1dNTP 0．4 μL，5 U·μL-1Taq DNA酶0．2 μL，Forward Primer（10 μmol·L-1） 1．5 μL，Reverse Primer(10 μmol·L-1)1．5 μL，Template DNA 2 μL，ddH2O 10．4 μL。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃～57℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環；72℃后延伸7 min。擴增產物用6%濃度的聚丙烯酰胺凝膠進行分離，銀染技術檢測。

1.6 SSR分析和分子身份證構建

根據4個菌株擴增結果篩選出擴增條帶清晰、穩定、多態性豐富且區分度高的SSR引物。分別對17個供試菌株進行擴增試驗。

根據供試菌株的擴增圖譜，參考每個引物擴增目的片段的分子量大小，將強帶或可分辨/重復性好的弱帶記為有效的等位基因譜帶，重復性不好的弱帶不考慮，由小到大依次統計等位基因譜帶，分析每對引物對17個菌株擴增產生的帶型，并對不同帶型進行賦值編碼，標記為1～9。為了保證每位編碼只有1位數字，第10種帶型標記為0，將菌株帶型轉成零一矩陣，采用NTSYS-2．10e軟件計算同一物種菌株間相似度。根據菌株間相似度分析結果，如果存在相似度為100%的菌株，則需設計新的SSR引物進行擴增，直至17個菌株的相似度小于100%，即將17個菌株全部區分開。根據帶型編碼構建17個平菇品種的SSR分子標記身份證。

2 結果與分析

2.1 CO1擴增結果及分析

CO1擴增結果見圖1。

圖1 供試菌株的CO1擴增結果Fig．1 PCR results of tested strains amplified by CO1 primers

17個菌株均能擴增得到單一條帶，根據條帶大小，供試菌株分為3組。第2號、第9號、第12號和第16號菌株為P.ostreatus，共4株；第3號、第4號、第6號、第8號、第10號、第11號、第14號和第15號菌株為P.cornucopiae，共8株；第1號、第5號、第7號、第13號、第17號菌株為P. pulmonarius，共5株。

2.2 SSR引物篩選及擴增多態性分析

根據4個菌株對48對SSR引物的篩選結果，經過多次擴增試驗驗證，最終選取9對擴增條帶清晰、穩定、多態性豐富且區分度高的SSR分子標記，見表2。這九對SSR分子標記所對應的SSR位點分別分布在Pleurotus ostreatus PC15 v2．0全基因組12條scaffold的第3條～第8條上。9對SSR標記在17個平菇菌株中共檢測到52個等位基因。不同SSR標記檢測到等位基因數目范圍為3個～8個，平均檢測效率為5．8個/標記，擴增的等位基因譜帶片段大小見表3。各位點的多態信息含量（PIC=1-∑Pi2，Pi為第i個等位基因的頻率）范圍為0．410～0．828，平均值為0．704，說明供試菌株具有較高的雜合度，可能是由于長期人工選擇具有雜種優勢品種的結果。其中引物P25的多態信息含量最高為0．828，說明該引物最能反映不同品種之間的差異。

表2 9對SSR分子標記序列及擴增多樣性信息Tab．2 Sequence and genetic diversity of 9 SSR primers for oyster mushroom

進一步根據9對引物對17個菌株擴增的分子指紋圖譜，將帶型轉成零一矩陣，計算同一物種內菌株間的相似度。4株P.ostreatus菌株間的遺傳相似性系數為0．44～0．89，8株P.cornucopiae菌株間的遺傳相似性系數為0．48～0．85，5株P.pulmonarius菌株間的遺傳相似性系數為0．33～0．93，說明這九對SSR引物可以將17個平菇品種完全區分開。

表3 每對引物擴增產生的等位基因片段大小Tab．3 Size range of alleles amplified by SSR primer

圖2 引物P4對17個供試菌株擴增產生的標準帶型圖及賦值Fig．2 Electrophoresis band pattern standards amplified by primer P4 for 17 tested strains

2.3 編碼和分子身份證構建

9對引物在17個菌株中共產生53種帶型，其中在P.ostreatus組中檢測到18種、P.cornucopiae組27種、P.pulmonarius組27種，不同物種的菌株間可以產生相同的帶型。9個引物分別擴增的帶型數為4種～10種。引物P25擴增的帶型數最多為10種。圖2為引物P4對17個菌株擴增產生的全部帶型和賦值情況，共有6種帶型。每對引物產生的不同標準帶型和賦值情況見表3、表4。

表4 每對SSR引物擴增產生的標準帶型和賦值情況Tab．4 Band pattern and encoded standard amplified by each SSR primer

對17個供試菌株的分子身份證進行編碼，每個菌株的分子身份證分別由9個字符串組成，從左到右依次代表引物P3、P4、P12、P14、P22、P23、P25、P26、P34產生的第幾種帶型，結果見表5。

從表5可以看出，17個平菇品種分別具有特異的分子身份證編碼。

3 討論

3.1 SSR分子身份證的編碼方法

對于SSR分子身份證的構建方法，不同的研究者有不同的編碼原則。于瀟等[22]構建的野生黑木耳菌株的分子ID是由1、0字符串組合而成，代表某對引物某個基因位點有無擴增條帶，1代表有擴增條帶，0代表無擴增條帶，該分子ID是依賴于資源特征分析軟件（ID Analysis 1.0）分析構建而成，簡單快捷，但具有一定的使用局限性。杜晶晶等[23]構建的葡萄種質分子身份證與陳昌文等[16]的方法類似，即分子身份證字符串的每位上的字符對應同一引物擴增的較小等位基因編碼值，但對于雜合帶型的菌株，如果較小譜帶相同，那么就需要通過增加引物來區分種質，這樣會增加所需引物數量和分子身份證位數。

本研究選取9對SSR引物對17個菌株擴增結果顯示，大部分菌株都是雜合帶型，即包括兩個以上的等位基因，這可能是由于平菇栽培過程中容易產生孢子而發生自然雜交[24]，再經不斷的人工選擇的結果。所以，本研究構建的平菇品種分子身份證是由不同帶型的編碼組合而成，每個標準帶型包括所有的有效等位基因，這與王新新等[20]對雙孢蘑菇分子身份證的構建方法類似。即分子身份證每一位數字代表一個引物產生的第幾種帶型，對于引物P25擴增的7個等基因片段共組成10種帶型，為了保證每一位點只有1位數字，第10種帶型賦值為0，以達到書寫簡潔的目的。本研究認為SSR分子身份證的編碼是一種人為制定的標準，以簡潔直觀且不影響區分效率為目的即可。

3.2 SSR分子標記在平菇研究中的應用

SSR分子標記多用于平菇種質資源遺傳多樣性分析及菌株鑒定等研究[14，25]。對于SSR標記的開發主要有3種策略，包括基因文庫篩選法，例如Barroso等[26]通過建立基因組文庫，從雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）中分離出四核苷酸（TATG）4，并擴增出預期的產物；富集文庫篩選法，例如Ma等[14]采用生物素-磁珠富集法首次開發出糙皮側耳（P.ostreatus）微衛星序列引物，成功區分37個側耳屬栽培菌株；數據庫篩選法，例如劉春滟等[27]利用香菇（Lentinus edodes） 的EST數據庫設計了40對SSR引物，22對具有多態性，多態率為55%。隨著糙皮側耳菌株全基因組序列的測序成功公布[28-29]，基于糙皮側耳全基因組的SSR信息分析越來越深入[30]，也為糙皮側耳（P.ostreatus）SSR位點的獲取提供了便捷有效的途徑。本研究利用P.ostreatus PC15 v2.0全基因組序列成功設計9對SSR引物用于17個平菇菌株的區分，但為了更全面地反映種質間的基因信息，需要開發更多的SSR位點，覆蓋更多的基因組序列。本研究選取的9對SSR分子標記，只分布在糙皮側耳基因組12條scaffold中的其中6條，雖然達到了區分全部菌株的目的，但對于更多新菌株尤其是親緣關系近的菌株，還需要不斷開發新的SSR標記進行區分。

3.3 平菇種質分子身份證構建過程中的物種鑒定

在我國，不同地區稱謂的平菇所指的生物學物種不完全相同，但是總體上說，俗稱為平菇的側耳屬物種包括糙皮側耳（P.ostreatus）、白黃側耳（P. cornucopiae）、佛羅里達側耳（P.florida） 和肺形側耳（P.pulmonarius）4個種[31]。在對平菇種質進行菌種鑒別或分子身份證構建之前應首先對平菇物種進行準確鑒定。對于平菇近緣種的鑒定，至今沒有一個準確的方法，本研究采用的CO1標記方法簡便快速，雖然能夠克服ITS測序方法中的數據庫信息不準確、種內變異大于種間變異等不足，但是CO1引物是黃晨陽[12]僅對側耳屬9個種、20個菌株的CO1序列進行測序而設計的通用引物，由于試驗材料有限，所以不能斷定CO1基因種內保守，再者側耳屬CO1基因中頻繁出現內含子，密碼子的擺動效用可能使設計的通用引物失效或擴增出假基因而影響結果[32]。所以CO1鑒定平菇近緣種的方法適應性還有待于進一步驗證。

[1]Falck R.Uber die Waldkultur des Austernpilzes(Agaricus ostreatus)[J].Laubholzstubben.Z.Forst-u.Jagdween,1917,49 (1917):159-165.

[2]Larraya LM,Perez G,Ritter E,et al.Genetic linkage map of the edible basidiomycete Pleurotus ostreatus[J].Applied& Environmental Microbiology,2000,66 (12):5290-5300.

[3]黃毅.食用菌栽培學[M].北京：高等教育出版社，2008.

[4]呂作舟.食用菌栽培學[M].北京：高等教育出版社，2006.

[5]卯曉嵐.中國大型真菌[M].鄭州：河南科學技術出版社，2000.

[6]鄭素月，張金霞，王賀祥，等.我國栽培平菇近緣種的多相分類[J].中國食用菌，2003，22（3）：3-6.

[7]申進文，趙旭，李燕，等.河南省栽培平菇品種的種質資源評價[J].河南農業大學學報，2011，45（3）：297-301.

[8]鄭和斌，馬志剛，呂作舟，等.基于ITS序列分析對我國主要栽培的側耳品種的鑒定及評價[J].菌物學報，2006，25（3）：398-407.

[9]黃晨陽，陳強，張金霞，等.側耳屬主要種類ITS序列分析[J].菌物學報，2010，29（3）：365-372.

[10]Nilsson RH,Ryberg M,Kristiansson E,et al.Taxonomic reliability of DNA sequences in public sequence databases:a fungal perspective[J].PLoS One,2006,1(1):59.

[11]Brock PM,D?ring H,Bidartondo MI.How to know unknown fungi:the role of a herbarium[J].New Phytologist,2009,181 (3):719-724

[12]黃晨陽.ITS和CO1在側耳屬物種鑒定中應用[D].北京：中國農業大學，2011.

[13]鄭素月，張慶橋.生化標記在河北省栽培平菇種質資源鑒別中的應用[J].北方園藝，2011（14）：162-164.

[14]Ma KH,Lee GA,Lee SY,et al.Development and characterization of new microsatellite markers for the oyster mushroom (Pleurotus ostreatus)[J].Journal of Microbiology Biotechnology,2009,19(9):851-857.

[15]葉翔，黃晨陽，陳強，等.中國主栽香菇品種SSR指紋圖譜的構建[J].植物遺傳資源學報，2012，13（6）：1067 -1072.

[16]陳昌文，曹珂，王力榮，等.中國桃主要品種資源及其野生近緣種的分子身份證構建[J].中國農業科學，2011，44（10）：2081-2093.

[17]Morgante M,Olivivieri A.PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics[J].The Plant Journal,1993,3 (1): 175-182.

[18]王慧玲，閆愛玲，孫磊，等.13個中國葡萄優新品種的分子身份證構建[J].生物技術通報，2016，32（4）：137 -142.

[19]張肖雅，許修宏，劉華晶.11個靈芝菌株的分子ID構建[J].微生物學通報，2013，40（2）：249-255.

[20]王新新，李丹，宋冰，等.雙孢蘑菇種質SSR分子身份證的構建[J].食用菌學報，2016，23（2）：6-11.

[21]da Maia LC,Palmieri DA,de Souza VQ,et al.SSR locator: tool for simple sequence repeat discovery integrated with primer design and PCR simulation[J].International Journal of Plant Genomics,2008,2008:412696.

[22]于瀟，許修宏，劉華晶.黑龍江部分野生黑木耳菌株的分子ID構建[J].中國農學通報，2012，28（13）：171-175.

[23]杜晶晶，劉國銀，魏軍亞，等.基于SSR標記構建葡萄種質資源分子身份證[J].植物研究，2013，33（2）：232 -237.

[24]李紅，肖千明，劉娜，等.食用菌菌種退化原因分析及復壯方法的探討[J].遼寧農業科學，2010（4）：53-55.

[25]李慧，陳強，黃晨陽，等.基于SSR標記構建平菇栽培品種核心樣本方法的探討[J].園藝學報，2012，39（10）：2023-2032.

[26]Barroso G,Sonnenberg AS,Van Griensven LJ,et al.Molecular cloning of a widely distributed microsatellite core sequence from the cultivated mushroom Agaricus bisporus[J]. Fungal Genetics and Biology,2000,31(2):115-123.

[27]劉春滟，李南羿，張玉瓊.香菇EST-SSR標記的開發及應用[J].食用菌學報，2010，17（2）：1-6.

[28]Grigoriev IV,Nordberg H,Shabalov I,et al.The genome portal of the department of energy joint genome institute[J]. Nucleic Acids Research,2012,40(Database issue):26-32.

[29]Riley R,Salamov AA,Brown DW,et al.Extensive sampling of basidiomycete genomes demonstrates inadequacy of the white-rot/brown-rot paradigm for wood decay fungi[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2014,111 (27):9923-9928.

[30]Qu J,Huang C,Zhang J.Genome-wide functional analysis of SSR for an edible mushroom Pleurotus ostreatus[J].Gene, 2014,575(2):524-530.

[31]張金霞，黃晨陽，鄭素月.平菇新品種-秀珍菇的特征特性[J].中國食用菌，2005，24（4）：25-26.

[32]Song H,Buhay JE,Whiting MF,et al.Many species in one: DNA barcoding overstimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes are coamplified[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2008,105(36):13486-13491.

Molecular ID Establishment of 17 Oyster Mushroom Cultivated in Hebei Province

LI Hui,WANG Chao-jiang,GAO Chun-yan
(Institute of Genetics and Physiology of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Shijiazhuang 050051,China)

The method of establishing the oyster mushroom germplasm molecular ID was studied by using 17 strains of oyster mushroom cultivated in Hebei province．Cytochrome oxidase subunit 1 gene (CO1)was used to identify the species of 17 oyster mushroom strains．Using SSR Locator software to screen SSRs(simple sequence repeats)in complete genome sequence of P.ostreatus PC15 v2．0 and to design primers for the selected SSR locus,suitable primers were selected to amplify genomic DNA．The assemblage of standard electrophoresis band patterns that amplified by each maker were coded and combined for the establishment of oyster mushroom germplasm molecular ID．The results showed that 17 oyster mushroom strains were identified as 4 strains of P.ostreatus,8 strains of P.cornucopiae,5 strains of P.pulmonarius．After screening of 48 primers,53 electrophoresis band patterns were detected using 9 selected SSR makers．Coding the standard electrophoresis band patterns,the distinctive molecule ID for 17 strains of oyster mushroom were established．The 17 strains were completely distinguished by 4 SSR primers．The results suggested CO1 combied with SSR maker techniques can be used for establishing molecular ID of oyster mushroom germplasm．

oyster mushroom;molecular ID;CO1;SSR

S646.9

A

1003-8310（2017）04-0035-07

10．13629/j．cnki．53-1054．2017．04．009

河北省農林科學院科技創新基本科研業務費項目（A2015110103）；國家現代農業產業技術體系建設專項資金（CARS-24）。

李慧（1986-），女，碩士，助理研究員，主要從事食用菌栽培育種。E-mail:lihuiviphappy＠163．com

**通信作者：高春燕（1964-），女，本科，副研究員，主要從事食用菌栽培研究。E-mail:ycsgcy＠163．com

2017-05-15