乳酸菌食品級質粒及應用的研究進展

王 瑤，韋云路，李平蘭*（北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

乳酸菌食品級質粒及應用的研究進展

王 瑤，韋云路，李平蘭*
（北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

乳酸菌是食品發酵工業中重要的益生菌，利用分子生物學技術構建的菌種對食品產業發展及人類健康具有重要影響。本文主要通過介紹乳酸菌食品級系統的基本要求、食品級質粒的元件組成、食品級質粒構建策略及其應用的研究進展，展示了乳酸菌食品級分子操作系統的建立對乳酸菌的深層次開發利用所具有的重要意義。

乳酸菌；食品級系統；質粒

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是食品產業中應用最為廣泛的革蘭氏陽性菌，主要包括乳球菌屬（Lactococcus） 、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Strptococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）等19 個屬[1]。在食品領域可以應用于發酵性食品，例如奶制品、肉制品、果蔬與谷物類食品的發酵[2]，并且是微生物學中公認的具有益生功能的益生菌，因而被公認為是安全的（generally recognized as safe，GRAS）食品級微生物[3-4]。

目前，采用分子生物學技術提升菌種潛在的優良性能，構建新型工程菌種是比較受關注的研究方向。基因工程技術可以對宿主菌種進行基因編輯，發掘功能基因，調控代謝途徑，從而提升菌種潛在的益生功能，因此分子生物學對食品科學及人類的健康具有促進作用[5-6]；然而基因工程菌種的選育過程一般采用抗生素抗性基因作為選擇性標記，抗性標記易向環境中擴散，危害生物安全[7]，因此研究人員也一直研究獲取無毒副作用的食品級分子操作系統。

基于分子生物學及合成生物學相關技術的不斷突破，乳酸菌相關的各類分子調控元件也已經得到驗證，相繼研究出了新的克隆載體、表達載體及整合載體，食品級分子表達系統得到了不斷完善，因此本文主要對最新的食品級菌種與質粒的背景、分子操作技術及相關應用進行綜述。

1 食品級系統的要求

由于乳酸菌在食品工業中的應用特殊性，要求食品級分子生物學所涉及的元件必須具有安全的特性，滿足如下基本標準[8]：1）載體必須是食品級，載體的相關元件必須由同源宿主或密切相關的安全型微生物的DNA 組成，不含有非食品級的DNA片段；2）宿主菌必須為食品級，宿主菌為可鑒定及穩定的菌種，經過先進的分類方法鑒定過，以及運用適當的分子生物學技術確認過宿主菌的遺傳組成；3）選擇性標記必須為食品級，傳統的乳酸菌載體選擇性標記為紅霉素或氯霉素的抗性基因，但因抗性因子的轉移，將其投放到環境、人或動物體內會帶來嚴重的生物安全性后果，因此必須采用食品級選擇性標記代替抗生素標記；4）外源誘導物必須為食品級，外源誘導物主要用于誘導啟動子的啟動，從而使外源基因進行表達，如乳糖、蔗糖、嘧啶、乳酸菌肽等可食用物質都是外源誘導蛋白表達常用的誘導物。

2 食品級質粒

質粒是存在于微生物中染色體以外的、能夠獨立復制的遺傳因子。基因工程質粒是分子生物學研究的重要工具，主要包括復制區、選擇標記區及蛋白表達區，復制區是保證質粒生存復制的必備元件，選擇標記區是重組質粒與菌種篩選的重要標記，蛋白表達區是外源蛋白表達的區域[9]。

2.1 質粒復制原理

質粒的復制原理與其宿主菌的特點、穩定性及拷貝數具有密不可分的聯系。根據環形質粒復制中間體的結構，可以分為滾動環式復制（rolling circle replication，RCR）及θ型復制（theta-replication）兩種方式。滾環復制的引導鏈和延遲鏈在合成的啟動時間和空間上相互獨立。復制蛋白將一股在正鏈起點處切開一個小口，在置換合成期間，形成多個單股中間體，延遲鏈在負鏈起點合成的啟動之后，置換合成，最終轉化為雙股螺旋分子[10]；θ型復制在復制過程中產生雙鏈復制叉，可以單向復制又可以雙向復制，不僅保證了質粒結構的穩定，而且可以插入大片段DNA[11]，如Lb. reuteri的質粒pTC82[12]、Lb. plantarum的質粒pLP2000和pLP9000[13]以及Lb. delbrueckii的質粒pN42和pJBL2[14]等。

2.2 食品級選擇性標記

基因工程質粒為了在其宿主菌體內存活復制，必須攜帶一個或者多個抗性基因防止質粒丟失，而抗生素抗性基因不僅不被允許在食品中使用，而且容易引起抗性轉移，危害生態環境，因此最有效的策略就是利用食品級的選擇性標記，此標記均來源于對人體及生態環境安全的食品級微生物，這些食品級選擇性標記與復制區、蛋白表達區進行整合，可構建出不同應用的食品級質粒，所應用的食品級選擇性標記見表1。

表1 食品級選擇性標記及相關菌種Table 1 Food-grade selective markers and corresponding bacteria

2.2.1 細菌素抗性或免疫性標記

細菌素中的乳鏈菌肽（Nisin）研究最深，目前已被50 個國家認可用作食品防腐劑，因此可以將乳鏈菌肽作為選擇性標記，Li Ruiqing等[15]將L. lactisTML 01菌種中新的乳鏈菌肽抗性基因nsr整合至pLEB590質粒，成功構建食品級質粒pLEB690，包括pSH71復制子、nsr基因和組成型啟動子P45；lafI基因是Lb. johnsonii VPI 11088產生Lactacin F免疫基因，將含有lafI基因的質粒pTRK434轉化到Lb. fermentumNCDO 1750后，于含有Lactacin F的培養基中進行選擇培養轉化子[16]。這些為細菌素作為食品級的選擇性標記提供了基礎。

菌體對細菌素具有免疫抗性，為了解決此問題，可以將一個以上的細菌素作為選擇性標記，或者將細菌素與其余選擇性標記聯合使用，然后于培養基中進行選擇性篩選，可以降低免疫抗性發生的頻率，Liu Chunqiang等[17]利用Nisin抗性與鎘抗性基因相結合，構建新型質粒pND968，于菌種L. lactis LM0230中存活40代依然保持穩定性。

2.2.2 糖類選擇性標記

糖是乳酸菌食品發酵工業中重要的碳源，因此可以將糖類作為選擇性標記，研究比較深入的是乳糖操縱子，MacCormick等[18]于L. lactis MG5276菌株中證明了乳糖可以作為選擇性標記；在此基礎之上，Platteeuw等[19]將乳糖操縱子（lacA）與選擇性標記（lacF）進行整合，構建了食品級質粒pNZ2122/pNZ2123與其相適應的宿主菌L. lactis NZ3000（lacF－）；此外，Takara等[20]于Lb. casei中構建了含有乳糖篩選標記的質粒pLEB600。

乳酸菌中少數株系同樣可以將木糖與蔗糖作為碳源，Posno等[21]將Lb. pentosusMD353的木糖選擇性標記（xyl）整合至pLP3573質粒，于Lb. casei ATCC 393與Lb. plantarum NCDO 1193中證明了木糖作為選擇性標記的可行性；Leenhouts等[22]將P. pentosaceus PPE1.0中的蔗糖選擇性標（scrA/scrB）整合至L. lactis LL108/LL302，證明了蔗糖作為選擇性標記的可行性。

2.2.3 營養缺陷型標記

營養缺陷型標記一般建立在tRNA抑制基因基礎上，因此容易引發多效效應，但是此種方法使用方便，并且其主要產物是RNA，而不是蛋白質，也不會有酶活性改變或抑菌作用。Ross等[23]將L. lactis的腺苷酸合成酶（thyA）基因整合至pGD500質粒進行回補，證明了thyA可以作為菌體的選擇性標記；并且，Zhu Duolong等[24]利用Cre/loxP技術構建了食品級的L. lactis NZ9000（thyA－）營養缺陷菌；Glenting等[25]將L. lactis MG1613中的蘇氨酸合成酶基因（hom、thrB）進行敲除，構建營養缺陷型菌種L. lactis MG1613（hom－、thyB－），同時將選擇性標記高絲氨酸脫氫酶與高絲氨酸激酶整合至質粒pJAG5進行回補，證明了此基因可以用于選擇性標記。

2.2.4 其他類型選擇性標記

細菌素、糖類以及營養缺陷型是常用的食品級標記，金屬離子、溫度以及噬菌體抗性也可以應用于食品級抗性標記。Liu Chunqiang等[26]將L.lactis M71中的鎘抗性基因（CdR）整合至L.lactis LMO230中，通過質粒pND302與pND625證明了鎘抗性基因可以應用于食品標記；Demerdash等[27]將S. thermophilus中內生質粒pSt04的熱休克蛋白（small heat shock protein，SHSP）基因整合至pHRM1質粒，證明溫度可以作為選擇性標記；質粒pNP40[28]與pAH90[29]于L. lactis中的應用充分證明了噬菌體抗性基因的食品級應用，并且Millen等[30]證明CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）/ Cas9技術可以提升L. lactis的噬菌體抗性基因選擇性。

2.3 食品級誘導物及表達系統

質粒中的蛋白質表達區主要用于基因的表達，啟動子是促使外源基因表達的核心區域，可以分為組成型啟動子與誘導型啟動子，組成型啟動子的調控不受外界條件的影響，所啟動基因的表達具有持續性；誘導型啟動子由于受外源誘導物調控，可以將菌體生長與外源基因表達區分[31]。為了滿足食品工業與生物技術的應用，不同類型的啟動子得到了不斷的完善，適合啟動子的選擇對外源基因的表達具有重要影響[32-33]。常用的食品級誘導物及表達系統見表2。

表2 食品級誘導物及表達系統Table 2 Food-grade inducers and corresponding expression systems

2.3.1 細菌素誘導的雙組分表達系統

細菌素可以作為雙組分表達系統的誘導物。研究比較深入的是NICE與pSIP表達系統[34-35]，其誘導物分別為乳酸鏈球菌素（Nisin）與米酒乳桿菌素（sakacin P/A）[34,36]，pSIP表達系統已經在L.lactis中成功表達了β-葡萄糖醛酸酶、氨肽酶、淀粉酶及β-半乳糖苷酶[35-37]，Sanati等[38]將pSIP表達系統的選擇性標記整合為丙氨酸消旋酶抗性，于Lb. plantarum WCFS1與Lb. reuteri L103中表達了β-半乳糖苷酶。

NICE表達系統是乳酸菌中應用最為廣泛的食品級表達系統，具有調控嚴謹性、表達高效性及產量高產性的優勢[39]，在此基礎上得到了不斷的優化改進，Wu Chiming等[40]將nis A（P nisiA）啟動子與nis R/K調節因子整合至質粒pSTE32，不需外源添加誘導物，于Lb. reuteri中成功表達淀粉酶；Pavan等[41]將nis R/K調節因子整合至Lb. plantarum NCIMB8826基因組中，制備出破傷風毒素的疫苗。

NICE與pSIP表達系統是研究比較清楚的雙組分表達系統，可以與糖[42]、pH值[43]及有機酸[44]誘導的表達系統相結合，從而提高啟動子的嚴謹性。

2.3.2 糖誘導的表達系統

糖進入菌體主要依賴PTS（phosphoenolpyruvatedependent sugar phosphotransferase systems）、ABC（ATP-binding cassette transporters）與GPH（galactoside pentose hexuronide）轉運系統[45-47]，不僅可以調節糖的攝入控制啟動子誘導的外源基因的表達，并且部分與糖轉運和代謝相關的基因都為糖調節的操縱子，可以在轉錄水平對基因表達水平進行調控[48]。Ma Shijie等[49]將乳糖誘導的啟動子（Plac）與Lb. brevis中的S層分泌信號肽整合，于Lb. casei中利用乳糖誘導表達豬α-干擾素；Miyoshi等[50]將木糖啟動子（PxylT）與信號肽Usp45整合，于L. lactis中利用木糖誘導表達金黃色葡萄球菌核酸酶（nuc）；Duong等[31]構建了果聚糖（Pfos）、乳糖（Plac）及海藻糖（Ptre）的啟動子，利用β-葡萄糖苷酸酶（GusA3）作為報告基因，于L. lactis中對啟動子強弱進行了分析。

2.3.3 其余誘導物誘導的表達系統

對于誘導型啟動子而言，溫度、pH值（酸）及金屬離子也可以作為外源誘導因子。D’Souza等[51]將含有溫敏型啟動子P1與P2的質粒，轉移至40 ℃培養解除抑制因子Rro12抑制，目的蛋白表達產量提高了500 倍；P170與Pgad啟動子可分別由乳酸與谷氨酸誘導，并且利用此啟動子構建的工程菌，將目的蛋白的生產應用到工業級別的分批發酵[33,52]；金屬離子可以通過ABC轉運系統進入菌體內部，調節菌體內部離子平衡[53]，Llull等[54]構建的pVE6008誘導系統，通過EDTA去除二價離子，解除zitR抑制因子的抑制作用，增強了PZn啟動子的效應，提高了蛋白質的表達產量。

3 食品級質粒構建及轉化

質粒的不同區域具有不同的功能，只有將各個功能區域相互組裝才能發揮其生理功能，并且轉化到相對應的宿主菌中，才能開展進一步的科學研究。傳統的DNA限制性內切酶酶切及連接酶連接技術是經典的組裝方法，近幾年，高效的組裝系統已被廣泛應用于質粒組裝，如Gibson組裝及同源重組組裝系統[55-56]，然而轉化方法依然是傳統的化學轉化或電轉化方法。

3.1 質粒構建

對于小片段DNA分子可以應用傳統的酶切連接組裝體系，Takala等[11]利用細菌素nis I作為選擇標記，組裝了新的食品級質粒，由此提供了比較標準的質粒構建體系，將質粒pVS2的復制子pSH71與質粒pLEB415的抗性標記nisⅠ、啟動子P45同時用ClaⅠ與SmaⅠ酶切，并利用T4連接酶進行組裝，轉化E. coli TG1與L. lactis MG1614，于乳酸鏈球菌素（nisin）抗性培養基篩選轉化子，構建食品級質粒pLEB590；乳酸菌的轉化效率比較低，尤其對于大片段的組裝，目前Gibson組裝體系廣泛應用于質粒構建，其體系具有核酸外切酶、DNA連接酶及DNA聚合酶混合酶體系，于體外50 ℃恒溫條件，利用堿基互補實現高效率組裝[57-59]，Jee等[55]利用此組裝體系，將Cas9基因（4 107 bp）整合至質粒中，于L. reuteri與L. lactis NZ9000構建了CRISPR/Cas9的打靶質粒pVPL3004等。

3.2 質粒轉化

轉化是外源基因進入菌體內部的重要途徑，高效的轉化效率為菌體轉化的庫容量提供了充分條件，因此是陽性轉化子獲得的重要影響條件。相對于化學轉化，電轉化過程繁瑣，耗時較長，但具有轉化效率高及適應宿主菌譜廣的優勢。革蘭氏陽性菌細胞壁的肽聚糖網層比較厚，對其細胞壁進行適當的弱化有助于電轉化效率的提高，常用的弱化劑主要有：甘氨酸、氨芐青霉素、溶菌酶、醋酸鋰及二硫蘇糖醇等。在制備乳酸菌感受態時，不僅需要適應的弱化劑含量，同時還要有適宜滲透壓維持劑-蔗糖。然后利用電脈沖對感受態細胞的細胞膜造成疏水性孔洞，隨著電壓增大，疏水性孔洞轉變為親水性，從而介導外部的DNA進入胞內，最后感受態細胞于高滲培養基中恢復細胞膜，并于抗性標記培養基中篩選轉化子[60]。總之，電轉化方法需要在適當破壞細胞壁的基礎上并維持細胞的高存活率。

4 食品級質粒的應用

乳酸菌是人體內具有重要生理功能的菌群，調節著人體腸道菌群的健康，與人體健康有著直接關系。乳酸菌作為食品級的菌體制劑，應用食品級的質粒構建新型的細胞工廠，從而產生具有生理功能的酶、多肽及中間代謝物等表達產物，可以應用于食品、醫藥、保健及工業等領域，有巨大的應用前景和潛在的商業價值，對食品、醫藥和工業等領域的發展具有一定的促進作用。

4.1 在基因編輯的應用

食品級質粒在基因編輯中具有質粒結構及篩選的不穩定性，因此不同的食品級基因編輯系統不斷進行了優化。Auvray等[61]將噬菌體的整合酶及特異性識別位點attP位點應用于Lb. delbrueckii，建立了特異性位點重組技術，Martin等[62]利用β-重組酶提高了attP特異性位點重組的重組效率；Serror等[63]建立的pG＋host整合系統是目前應用最為廣泛的編輯系統，其主要利用轉座重組將目的基因整合至基因組；Song Li等[64]利用尿嘧啶磷酸核糖基轉移酶作為反向篩選標記，于L. lactis與Lb. casei也建立了食品級基因編輯系統；最近CRISPR/Cas9系統已經被廣泛應用于生物體的基因編輯，Oh等[55]已經于Lb. reuteri中建立了CRISPR/Cas9系統，利用質粒pVPL3017誘導RecT蛋白的表達，從而提升了外源DNA進入菌體的效率，由sgRNA（signal guided RNA，sgRNA）的引導，質粒pVPL3004誘導的Cas9蛋白實現了對特異性基因的編輯，其編輯效率可達90%～100%。

4.2 在蛋白質表達的應用

質粒對蛋白質的高效表達具有促進作用，因此研究人員可以直接將含有特異性質粒的菌種進行發酵生產，此種方法是最簡單高效的方法，雖然食品級質粒的表達效率比較低，并且一些工業級需求并不需要食品級制備，直接用E.coli或S.cerevisiae的表達系統，將目的蛋白純化即可[65]，但是一些研究仍然報道了食品級質粒的重要性。Liu Guorong等[66]利用食品級質粒于L. lactis NZ9000中高效表達Enteriocin P細菌素，抑制了食品中有害微生物的生長，并對細菌素性質進行了分析；Gu Wenliang等[67]將馬檳榔甜蛋白于L. lactis NZ3900與E. coli中表達，發現L. lactis NZ3900的酶活性明顯高于E. coli；Nguyen等[68]應用食品級質粒將Lb. reuteri的β-半乳糖苷酶表達于Lb. plantarum，為食品級工業應用奠定了基礎。

4.3 在代謝工程的應用

乳酸菌是食品發酵工業中常用的菌種，利用代謝工程技術對其代謝途徑進行優化，制備目的產物產量高、特異性強的菌種已備受關注。通過對L. lactis代謝途徑優化，已經高產出VB、葉酸及胞外多糖[69]，然而所用的分子元件并不滿足食品級要求，因此不能應用于食品工業。Gosalbes等[70]利用食品級分子操作系統將L. lactis的乙酰羥酸合成酶基因ilvB/N整合至Lb. casei乳糖操縱子位置，提升了丁二酮的產量；Staudigl等[71]將Lb. reuteri的L-阿拉伯糖異構酶及L-木糖異構酶基因轉化至Lb.plantarum中，可以通過代謝過程檢測食品工業中糖的轉化反應，從而控制發酵過程；透明質酸可以應用于醫藥、化妝品及疫苗制備，Sheng Juzheng等[72]利用NICE系統將S. zooepidemicus透明質酸合成酶基因轉化至L. lactis，成功構建其代謝合成途徑，生產出食品級的透明質酸。

4.4 在人體健康的應用

乳酸菌是腸道菌群中的益生菌，能夠促使機體產生特異性或非特異性的免疫應答，因此可以開發對機體安全且產生持續免疫力的口服型質粒[73]；并且具備酸耐受性及黏膜黏附性的優勢，可以作為疫苗的傳遞載體[74]。Hoang等[75]制備了含有單鏈抗體3D8的重組菌L. paracasei （scFv 3D8），為腸道菌群抵抗病毒因子的侵擾提供了可能；Shi Shaohua等[76]將構建的質粒NC8-pSIP409-HA于L. plantarum表達禽流感病毒H9N2的血細胞凝集素（hemagglutinin，HA）蛋白，成功誘發機體的免疫應答，并為H9N2病毒口服疫苗的制備奠定基礎；Guo Shanguang等[77]將梭狀芽胞桿菌感染毒素TcdA與TcdB整合至L. lactis，制備的疫苗對動物治療具有顯著作用，從而為口服疫苗的制備提供了技術保障；Alvarez等[78]將Myxococcus xanthus的肽鏈內切酶（prolyl endopeptidases，PEP）整合至L. casei，通對機體腸道菌群的調節，患者的腹腔疾病得到治療。

5 結 語

乳酸菌作為益生菌，應用前景廣泛，對人體有益的益生菌菌株在不斷地研究，因此新菌種的遺傳背景及相關功能基因并不清楚，通過特異性重組質粒可以對其功能基因進行研究，并進一步解析其調控機理，對乳酸菌的基礎型及應用型研究具有推動作用。

目前，已經有許多的食品級質粒構建成功，并應用于食品與醫療，但是其應用仍然比較受限，許多工業用菌株帶有Nisin抗性，因此含有Nisin標記的菌種或質粒不能應用Nisin選擇體系；金屬離子雖可以應用于篩選標記，可是金屬離子對機體具有一定毒性；對于其誘導系統而言，糖誘導系統的嚴謹性有所限制，pH值與溫度控制誘導系統不利于工業的大規模應用，因此在制備實驗室及產業化所需的質粒與宿主菌時，需要綜合考慮復制系統、選擇標記與誘導系統。

食品級質粒的研究及應用，對推動乳酸菌的分子生物學研究起到關鍵作用。由于乳酸菌是腸道菌群的益生菌，腸道菌群對調節人體各個器官的健康具有重要作用，許多研究人員重點關注益生菌在腸道菌群中的重要性，但是益生菌對腸道菌群的調控機理，及菌體自身的益生機理還未深入解析，利用食品級質粒可以對菌體的調控及益生機理進行解析，從而增強其益生功能，可以作為食品級質粒未來應用的一個方向。因此食品級質粒對乳酸菌工程菌株的利用與研發發揮著重要作用。

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A Review of Research on Lactic Acid Bacteria Food-Grade Vectors and Their Applications

WANG Yao, WEI Yunlu, LI Pinglan*
(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Lactic acid bacteria (LAB) are important probiotic microorganisms used in food fermentation industry. Molecular biological manipulation of these microorganisms has great potential for the development of food industry and human health. Based on the characteristics of lactic acid bacteria and the development of molecular biology, this review aims at the basic principles of a food-grade vector system for LAB, the components of a food-grade plasmid, the strategies to construct and transform a food-grade plasmid, and recent applications of food-grade plasmids. This review highlights that food-grade molecular biology could have a major positive impact on further development and application of LAB.

lactic acid bacteria; food-grade system; plasmid

10.7506/spkx1002-6630-201713044

TS201.3

A

1002-6630（2017）13-0269-08

王瑤, 韋云路, 李平蘭. 乳酸菌食品級質粒及應用的研究進展[J]. 食品科學, 2017, 38(13): 269-276. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201713044. http://www.spkx.net.cn

WANG Yao, WEI Yunlu, LI Pinglan. A review of research on lactic acid bacteria food-grade vectors and their applications[J]. Food Science, 2017, 38(13): 269-276. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201713044. http://www.spkx.net.cn

2016-06-14

國家自然科學基金面上項目（31271827；31671831）

王瑤（1989—），男，博士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：wangyao897@126.com

*通信作者：李平蘭（1964—），女，教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：lipinglan@cau.edu.cn