鐵蛋白-原花青素的相互作用及原花青素穩(wěn)定性

周中凱，徐晶晶，劉玉茜，楊 瑞,*（.教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津 300457）

鐵蛋白-原花青素的相互作用及原花青素穩(wěn)定性

周中凱1,2，徐晶晶1，劉玉茜1，楊 瑞1,2,*
（1.教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津 300457）

原花青素是一種來源廣泛的黃酮類生物活性物質(zhì)，但因其在潮濕、陽光或高溫條件下的不穩(wěn)定性，影響其在食品、醫(yī)藥和保健品行業(yè)的應(yīng)用。以分離純化的脫鐵紅小豆鐵蛋白（apoferritin，AFt）和葡萄籽原花青素（proanthocyanidins，PCs）為原料，制備鐵蛋白-原花青素復(fù)合物（AFt-PCs），利用熒光光譜、圓二色譜、透射電子顯微鏡等方法研究PCs與AFt的相互作用，同時比較復(fù)合物中PCs和游離PCs在不同光照和不同溫度處理條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCs與AFt相互作用能夠?qū)е翧Ft內(nèi)源熒光猝滅，通過模型擬合獲得結(jié)合比例為PCs與Aft質(zhì)量比0.07∶1，結(jié)合常數(shù)K為（2.03±0.08）×104L/mol。PCs對AFt的二級結(jié)構(gòu)影響并不顯著，但透射電子顯微鏡結(jié)果表明，AFt受PCs誘導(dǎo)呈現(xiàn)出一定的聚集態(tài)。同時，AFt-PCs復(fù)合物中的PCs在光照和熱處理條件下的穩(wěn)定性都比游離PCs有顯著提高。該研究為探索食品中多組分相互作用以及提高PCs穩(wěn)定性提供了一種新的途徑。

原花青素；鐵蛋白；穩(wěn)定性

原花青素由黃烷-3-醇或黃烷-3,4-二醇聚合而成，可從多種植物如葡萄、蘋果、山楂、花旗松等提取獲得，是一種來源廣泛的黃酮類生物活性物質(zhì)[1]，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最好的天然抗氧化物質(zhì)之一[2]，其清除自由基能力是VE的50 倍、VC的20 倍。因為原花青素具備較好的抗氧化、清除自由基和增強免疫功能等能力，常用于調(diào)節(jié)血脂、改善微循環(huán)、抗腫瘤和調(diào)節(jié)血糖等方面[3-4]。隨著我國老齡化、三高、患腫瘤以及糖尿病的人口逐年增多，原花青素可以有效地促進這類人群的健康。近幾年，因其廣泛的來源性、高效的生物利用率以及低生物毒性，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和保健品[5]。但是，原花青素易被氧化，在潮濕、陽光或高溫條件下的不穩(wěn)定性導(dǎo)致其在食品應(yīng)用及醫(yī)藥行業(yè)上的生物利用率較低[6]，提高其穩(wěn)定性是解決其投入應(yīng)用的關(guān)鍵問題。

利用食品天然組分，如多糖、蛋白等，復(fù)配食源活性小分子構(gòu)建復(fù)合物是解決多酚類物質(zhì)穩(wěn)定性的良好途徑[7]。蛋白質(zhì)作為兩性大分子物質(zhì)，其廣泛存在與動物、植物、微生物體內(nèi)，其表面大量的氨基酸分布、電荷性質(zhì)和復(fù)雜的空間構(gòu)象，為構(gòu)建蛋白-多酚復(fù)合物提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。鐵蛋白（ferritin）是一類廣泛存在于生命體內(nèi)的鐵貯存蛋白[8]，由24 個亞基組成中空球狀分子，內(nèi)外直徑分別為8 nm和12 nm，每個鐵蛋白空腔內(nèi)最多可以貯存4 500 個鐵原子[9]。研究表明鐵蛋白本身是一個無毒且生物可利用的天然補鐵制劑[10]，其能夠調(diào)控鐵離子的出入使鐵蛋白具有儲存鐵的功能，同時具有重要的解毒作用，其在食品、藥品、保健品應(yīng)用方面具有廣泛的應(yīng)用前景。并且鐵蛋白水溶性良好，其脫鐵產(chǎn)物形成一個規(guī)則的12 nm結(jié)構(gòu)，其表面分布的12 個二重軸通道、8 個三重軸通道和6 個四重軸通道也為其他分子進出鐵蛋白提供了通道（圖1）。

圖1 AFt結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Structure of AFt

目前利用鐵蛋白直接與食源小分子物質(zhì)相互作用，并改善小分子物質(zhì)特性的研究較少，是值得深入研究的課題。本實驗利用脫鐵紅小豆鐵蛋白（apoferritin，AFt）為原料，利用熒光光譜、圓二色譜、透射電子顯微鏡等方法研究AFt與葡萄籽原花青素（proanthocyanidins，PCs）相互作用，分析該相互作用對鐵蛋白結(jié)構(gòu)及原花青素的穩(wěn)定性和抗氧化性質(zhì)產(chǎn)生的影響。該研究對進一步認識食品多組分相互作用，探究多酚類化合物穩(wěn)態(tài)化方法提供了新的嘗試。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅小豆 天津濱海新區(qū)樂購超市；Sephacry-S300聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠 美國GE公司。

原花青素（純度＞95%） 天津尖峰天然產(chǎn)物有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、蛋白質(zhì)Marker（分子質(zhì)量14.4～97.4 kD） 北京索來寶生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma Aldrich公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16A高速冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司；層析實驗冷柜、微量移液器、超濾裝置、超濾膜、LE438酸度計 美國Mettler Toledo公司；VE180電泳槽 天能公司；S-5500透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司；Cary Eclipse熒光分光光度計 美國安捷倫公司；PiStar-180圓二色光譜儀 美國Olis公司。

1.3 方法

1.3.1 AFt的制備與純化

1.3.1.1 AFt的制備

將500 g紅小豆放入4 ℃蒸餾水中浸泡過夜，去皮，加入3 倍體積的提取液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5，1%聚乙烯吡咯烷酮），用內(nèi)切式勻漿機勻漿2 min，100 目濾網(wǎng)過濾。收集濾液10 000×g離心15 min，取上清液。向上清液中加入終質(zhì)量分數(shù)為5%的硫酸銨晶體后靜置過夜，4 ℃、12 000×g離心30 min。隨后加入終質(zhì)量分數(shù)為10%的硫酸銨，靜置過夜，4 ℃ 12000×g離心30 min，收集沉淀。將沉淀中加入1.5 倍體積上清液沖洗沉淀中的淀粉和核糖體，并12 000×g離心5 min，棄上清液，重復(fù)2 次直至只有褐色沉淀。將沉淀溶于5 倍體積蒸餾水中，12 000×g離心5 min，收集上清液。用蒸餾水溶解沉淀并重復(fù)2 次，12 000×g離心5 min，收集且合并上清液。將上清液放在平衡緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5）中透析過夜[11]。

將粗蛋白進行凝膠柱過濾純化。樣品上樣前均需過0.22 μm濾膜待用。將50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.5，0.15 mol/L NaCl）緩沖液平衡Sephacryl S-300聚丙烯酰胺-葡聚糖凝膠柱，待凝膠柱平衡后上樣，流速設(shè)置為0.5 mL/min，并以5 mL/管的速率分部收集樣品，并檢測鐵蛋白純度和濃度[12]。最后對蛋白脫鐵處理，制備AFt溶液[13]。

1.3.1.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳

參照Laemmli[14]方法，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）來檢驗分離純化后的AFt純度和分子質(zhì)量。

1.3.2 AFt-PCs復(fù)合物的制備

準確配制10 mg/mL PCs母液和1.0 μmol/L AFt溶液。將不同體積的PCs加入到含有1 mL AFt溶液的離心管中制成不同質(zhì)量比（0.01∶1、0.02∶1、0.03∶1、0.04∶1、0.05∶1、0.06∶1、0.07∶1、0.08∶1、0.09∶1、0.10∶1）的復(fù)合物，混勻10 min后，于4 ℃條件下靜置2 h后待用。

1.3.3 熒光光譜分析

在10 支2 mL的比色管中，分別加入PCs溶液使其與AFt質(zhì)量比分別為0.01∶1、0.02∶1、0.03∶1、0.04∶1、0.05∶1、0.06∶1、0.07∶1、0.08∶1、0.09∶1、0.10∶1，隨后將上述混合液在25 ℃進行熒光光譜掃描，獲取不同質(zhì)量濃度條件下的熒光發(fā)射譜圖。熒光光譜儀設(shè)定條件如下：激發(fā)波長280 nm，激發(fā)狹縫5 nm，發(fā)射狹縫10 nm，掃描發(fā)射光譜的波長范圍290～500 nm。每個樣品進行3 次平行實驗，數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值。同時，根據(jù)公式（1）互作模型[15-16]計算PCs與AFt的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合力強度。

式中：n是結(jié)合位點數(shù)；K是結(jié)合常數(shù)；[P]0和[PCs15]0分別是AFt的濃度/（μmol/L）、PCs的濃度/（μmol/L）；I0和I∞分別是AFt和PCs誘導(dǎo)的蛋白熒光強度不再發(fā)生顯著變化時的相對熒光強度。

1.3.4 圓二色譜分析

分別取相同濃度的1.0 μmol/L AFt和AFt-PCs（質(zhì)量比1∶0.07）溶液進行圓二色譜分析，反應(yīng)條件為25 ℃，采集波長為190～260 nm，每個實驗重復(fù)3 次。石英比色皿光徑長度為1 mm，掃描速率為50 nm/min。橢圓率以θ值表示，單位為（deg·cm2）/dmol，并使用網(wǎng)絡(luò)程序K2D（http∶// www.bork.embl.de/～andrade/k2d/）計算蛋白二級結(jié)構(gòu)組成。

1.3.5 透射電子顯微鏡觀測

透射電子顯微鏡制樣按照Douglas等[17]所述方法。將碳膜包被的銅網(wǎng)放置在干凈的封口膜上，用吸管將制備好的樣品滴加在銅網(wǎng)上，靜置10 min。隨后用濾紙吸掉銅網(wǎng)上的樣品，待樣品干燥后，在銅網(wǎng)上滴加2%的醋酸鈾染液5 μL，并靜置染色5 min。用濾紙吸掉多余的染液，待樣品晾干后進行透射電子顯微鏡觀測。

1.3.6 動態(tài)散射光實驗

參照Li Chaorui等[18]報道的方法，利用動態(tài)光散射儀記錄AFt分子布朗運動的自相關(guān)函數(shù)計算平移擴散系數(shù)，并通過Stokes-Einstein方程算出AFt分子及其復(fù)合物的流體力學(xué)半徑RH及尺寸分布。

1.3.7 穩(wěn)定性測定

1.3.7.1 PCs含量的測定

參考保健品原料中PCs含量的檢測方法[19]。6 mL樣品置于具塞試管中，再加入0.2 mL硫酸鐵銨溶液和1 mL試樣溶液，混勻，置沸水浴回流，加熱40 min后，立即置冰水中冷卻，在加入完畢15 min后，于546 nm波長處測吸光度。

1.3.7.2 熱處理條件下的穩(wěn)定性

量取10 mL AFt-PCs復(fù)合物溶液（PCs與AFt質(zhì)量比0.07∶1）放置于4 ℃度冰箱，37 ℃的水浴鍋內(nèi)孵育120 min，游離的PCs溶液作為對照組。平均每4 h采集一次樣品（0.4 mL），對其進行PCs含量測定。以不同時間下殘留的PCs百分數(shù)作為穩(wěn)定性判定標準。每個樣品進行3 次平行實驗，數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值。

1.3.7.3 光照條件下的穩(wěn)定性

量取10 mL AFt-PCs復(fù)合物溶液（PCs與AFt質(zhì)量比0.07∶1）放置于距離紫外燈（20 W，波長為254 nm）30 cm處或室內(nèi)自然光下進行照射處理120 min，游離的PCs溶液作為對照組。平均每4 h采集一次樣品（0.4 mL），對其進行PCs含量測定。以不同時間下殘留的PCs百分數(shù)作為穩(wěn)定性判定標準。每個樣品進行3 次平行實驗，數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值。

1.3.8 DPPH法測定抗氧化活性

參考Lu Yinrong等[20]報道的方法，稍作修改。用Tris-HCl溶液將AFt-PCs（PCs與AFt質(zhì)量比0.07∶1）和PCs溶液分別稀釋成0.02、0.04、0.06 mg/mL三個不同質(zhì)量濃度。取0.1 mL樣品，混合10 mL質(zhì)量濃度為0.03 g/L的DPPH溶液中，靜置10 min，在最大吸收波長517 nm波長處測其吸光度（A1），以不加樣品的DPPH為空白對照（A0）。最后根據(jù)公式（2）計算DPPH自由基的清除率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SSPS 11.5軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。樣品抗氧化能力分析均做3 次平行實驗，測量結(jié)果以±s表示，實驗數(shù)據(jù)采用ANOVA進行鄧肯氏（Duncan）差異分析，以P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFt的制備

將純化后的AFt通過SDS-PAGE確定其亞基分子質(zhì)量，結(jié)果如圖2所示。SDS-PAGE圖表明AFt由分子質(zhì)量約為28.0 kD的單一亞基組成，與文獻[21]報道一致。因此，純化后的AFt符合實驗要求。

圖2 AFt純化后電泳圖Fig. 2 SDS-PAGE analysis of purified AFt

2.2 PCs對AFt結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響

熒光光譜法是研究小分子-蛋白質(zhì)大分子相互作用的重要手段，通過測定相互作用過程中蛋白分子中熒光生色團熒光強度的變化，并輔以熒光猝滅模型，進而推測蛋白質(zhì)與小分子的結(jié)合狀況或者蛋白分子結(jié)構(gòu)變化等信息。本實驗利用熒光光譜分析了不同質(zhì)量濃度PCs添加后引起的AFt熒光強度的變化，結(jié)果如圖3所示。AFt中的色氨酸和酪氨酸均有熒光產(chǎn)生，其中色氨酸的發(fā)射波長在330 nm左右，酪氨酸的發(fā)射波長304 nm左右。當290 nm激發(fā)時，AFt發(fā)射光波長的最大發(fā)射峰在330nm附近，表現(xiàn)為色氨酸的特征發(fā)射曲線[22]。隨著PCs添加比例的提高，AFt分子的內(nèi)源熒光光譜強度在330 nm波長處發(fā)生了明顯降低（圖3A），表明PCs的添加使AFt側(cè)鏈上的色氨酸微環(huán)境發(fā)生改變，二者產(chǎn)生了顯著的相互作用。

圖3 在AFt溶液中加入不同質(zhì)量濃度PCs的熒光光譜圖（A）和熒光光譜擬合曲線（B）Fig. 3 Fluorescence intensity of AFt treated with different concentrations of PCs (A) and fitting curve of fluorescence intensity (B)

另外，通過分析AFt猝滅曲線發(fā)現(xiàn)，其熒光強度數(shù)值符合已報道的熒光猝滅模型[15-16]，通過公示（1）方程擬合，計算得到結(jié)合位點數(shù)n=0.07，結(jié)合常數(shù)K＝（2.03±0.08）×104L/mol。該結(jié)果表明，約有0.07∶1質(zhì)量比的PCs結(jié)合于AFt上，后續(xù)實驗均以該比例（PCs與AFt質(zhì)量比0.07∶1）條件獲取AFt-PCs復(fù)合物進行研究。另外，結(jié)合常數(shù)K＝（2.03±0.08）×104L/mol表明PCs與AFt的作用力主要為氫鍵和范德華力，以弱鍵作用為主[16]。由于這種相互作用的存在可能導(dǎo)致AFt的分子構(gòu)象或結(jié)構(gòu)發(fā)生一定改變，因此本實驗進一步利用圓二色譜和透射電子顯微鏡進行其相互作用研究。

2.3 PCs對AFt二級結(jié)構(gòu)的影響

圖4 AFt和AFt-PCs圓二色光譜圖（A）和二級結(jié)構(gòu)相對含量（B）Fig. 4 CD spectra of AFt and AFt-PCs (A) and estimated secondary structural fractions of AFt and AFt-PCs (B)

圓二色光譜是應(yīng)用最為廣泛的測定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的方法，是研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種快速、簡單、較準確的方法。實驗進一步對0.07∶1（m/m）比例條件下的AFt-PCs復(fù)合物結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果如圖4A所示。AFt在208 nm和222 nm遠紫外區(qū)的圓二色譜有兩個負峰，與之前報道的一致[23]。同時，AFt-PCs復(fù)合物在208 nm和222 nm波長處吸收強度相對于AFt有輕微上升，但是沒有發(fā)生峰偏移。表明AFt中的α-螺旋相對含量有輕微增加，但蛋白的二級結(jié)構(gòu)并沒有明顯變化[24]。圖4B表示了AFt中不同二級結(jié)構(gòu)的相對含量，α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲相對含量依次為（38.2±0.4）%、（28.2±0.2）%、（34.3±0.3）%，而經(jīng)過PCs處理的復(fù)合物的α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲相對含量依次為（38.9±0.2）%、（28.3±0.4）%、（33.5±0.3）%，并沒有顯著性差異，因此PCs并不會明顯影響或改變AFt的二級結(jié)構(gòu)。

2.4 AFt-PCs的TEM形態(tài)及尺寸變化

圖5 AFt、AFt-PCs透射電子顯微鏡圖（A）和AFt、AFt-PCs的動態(tài)散射光強度分布曲線（B）Fig. 5 TEM of AFt and AFt-PCs (A) and relative scattered light intensity distribution curves for 0.56 mg/mL AFt and AFt-PCs (B)

復(fù)合物的電子顯微鏡形態(tài)如圖5A所示，AFt呈現(xiàn)出規(guī)則的球形，其尺寸為12 nm左右，與文獻[25]報道一致。不同的是，AFt-PCs復(fù)合物（PCs與AFt質(zhì)量比0.07∶1）呈現(xiàn)出明顯的聚集現(xiàn)象（圖5A2），表明AFt在一定量PCs處理后其形態(tài)發(fā)生了變化，推測該作用是由于PCs附著于AFt表面引起的。該現(xiàn)象可能是由于多酚類通過靜電、疏水、氫鍵等作用力與蛋白表面相結(jié)合導(dǎo)致的，而且這種結(jié)合往往會引起蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象上的變化[26]。

動態(tài)光散射技術(shù)可以測量溶液中顆粒物質(zhì)（如大分子蛋白質(zhì)）的粒徑大小，其粒徑的大小變化可以直接反映蛋白分子的相互作用和尺寸變化。如圖5B所示，在未加入PCs時，AFt體系中蛋白水合半徑（RH）為7.3 nm，與文獻[27]報道結(jié)果一致。當加入PCs的比例為0.07∶1（m/m）時，復(fù)合物的尺寸顯著增加，并且出現(xiàn)了大量的RH=23.6 nm的聚集體。該結(jié)果與透射電子顯微鏡觀察結(jié)果一致，說明氫鍵和范德華力引起的PCs和AFt的相互作用，具有明顯的誘導(dǎo)AFt聚合現(xiàn)象，與文獻[23]報道結(jié)果一致，該作用主要表現(xiàn)為AFt分子間的聚合作用，對AFt的二級結(jié)構(gòu)并沒有顯著影響。

2.5 復(fù)合物中PCs與游離PCs的穩(wěn)定性

圖6 AFt-PCs復(fù)合物與PCs隨時間變化曲線Fig. 6 Stability kinetics of PCs and AFt-PCs under sunlight and UV light

實驗對AFt-PCs復(fù)合物中PCs穩(wěn)定性進行了評價。分別測定了復(fù)合物AFt-PCs（PCs與AFt質(zhì)量比0.07∶1）中PCs和對照組游離PCs在4、25 ℃和50 ℃條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6A、B和C所示。在4 ℃條件下，隨著時間的延長，游離的PCs和AFt-PCs中PCs相對含量變化無顯著差異（P＞0.05）。在25 ℃條件下，120 h內(nèi)游離的PCs相對含量下降了40.5%，而AFt-PCs中PCs相對含量下降了21.2%，表明AFt明顯抑制了PCs的降解。在50 ℃作用條件下，120 h內(nèi)游離的PCs相對含量下降了72.3%，而AFt-PCs中PCs相對含量下降了39.3%，說明隨著溫度的升高游離的PCs降解率進一步增大，但AFt-PCs中PCs降解率明顯降低（P＜0.05）。Shpigelman等[28]發(fā)現(xiàn)β-乳球蛋白經(jīng)過熱處理后，結(jié)構(gòu)會進一步展開，使得內(nèi)部的疏水區(qū)域更多的暴露出來，從而使表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）與該疏水區(qū)域相結(jié)合，形成的疏水作用力和氫鍵引起了蛋白質(zhì)聚集態(tài)的產(chǎn)生，而且蛋白質(zhì)基團間的靜電作用使這些聚集態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從而對EGCG進行了保護。在本實驗中，AFt-PCs中PCs熱穩(wěn)定性相比游離PCs顯著提高，該原因可能是因為高溫處理使AFt的疏水區(qū)域更多地暴露出來，PCs與蛋白質(zhì)疏水基團的集合使得結(jié)合的PCs更穩(wěn)定。

實驗測定了AFt-PCs（PCs與AFt質(zhì)量比0.07∶1）中PCs和PCs在一定紫外光和自然光照射下的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6D、E所示。在自然光照射條件下，120 h內(nèi)游離的PCs相對含量下降了42.6%，而AFt-PCs中PCs相對含量下降了22.1%，AFt對PCs產(chǎn)生了明顯的保護作用。在紫外光照射條件下，120 h內(nèi)游離的PCs相對含量下降了52.6%，而AFt-PCs中PCs相對含量下降了29.4%。該結(jié)果表明在光照射條件下，AFt-PCs中PCs比游離的PCs相對更為穩(wěn)定，而且相對于自然光照射條件下，在紫外光照射條件下游離的PCs損失率比AFt-PCs中PCs損失率有顯著提高（P＜0.05）。Liang Li等[29]研究發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白、α-乳球蛋白和β-乳球蛋白與葉酸形成的復(fù)合物能夠降低葉酸在紫外照射下的降解率。其原因是蛋白與葉酸形成的復(fù)合物在同樣的條件展開從而導(dǎo)致蛋白的降解率提高，最終間接抑制了葉酸的光解。在該實驗中，AFt對PCs有顯著的保護作用，光照處理導(dǎo)致鐵蛋白結(jié)構(gòu)展開可能引起了AFt本身的降解，使得PCs的降解速率降低。

2.6 復(fù)合物和游離PCs抗氧化性比較

圖7 PCs和AFt-PCs清除DPPH自由基的能力Fig. 7 Antioxidant activities of PCs and AFt-PCs as evaluated byDPPH radical scavenging method at different concentrations

采用DPPH法分別測定了不同質(zhì)量濃度的AFt-PCs（PCs與AFt質(zhì)量比0.07∶1）復(fù)合物中PCs和游離PCs的抗氧化性，結(jié)果如圖7所示。0.02～0.06 mg/mL范圍內(nèi)AFt-PCs中PCs的抗氧化性都低于PCs，而且差異性顯著（P＜0.05）。說明AFt-PCs的形成降低了PCs的抗氧化性。許多研究表明—OH基團可以增強或減弱抗氧化劑對自由基的反應(yīng)活性，氫鍵是增強還是減弱抗氧化劑清除自由基的能力取決于從反應(yīng)物到中間過渡態(tài)時氫鍵帶來的穩(wěn)定性是增強還是減弱[30]。因此復(fù)合物中PCs抗氧化活性降低的原因可能是PCs是通過氫鍵與AFt相互作用，而且在過渡態(tài)的時候氫鍵帶來的穩(wěn)定性是減弱的，所以導(dǎo)致AFt-PCs中PCs的抗氧化性降低。另外，蛋白質(zhì)的空間阻隔效應(yīng)能引起部分PCs被蛋白質(zhì)遮蔽或包埋，該原因也可能導(dǎo)致原花青素的抗氧化活性降低。

3 結(jié) 論

本實驗以分離純化后的AFt和PCs為原料，制成復(fù)合物，通過熒光光譜、透射電子顯微鏡、圓二色譜等方法研究了PCs對AFt結(jié)構(gòu)的影響，同時比較了復(fù)合物和游離PCs的熱穩(wěn)定性和抗氧化性。研究表明PCs與AFt相互作用導(dǎo)致AFt產(chǎn)生顯著熒光猝滅，同時產(chǎn)生一定量聚集態(tài)，導(dǎo)致AFt尺寸變大。復(fù)合物中PCs在紫外光、自然光和高溫處理條件下穩(wěn)定性都比游離PCs有顯著提高，同時，AFt-PCs復(fù)合物中PCs的抗氧化活性降低。食品是一個復(fù)雜的多組分體系，研究多組分之間的作用有助于探明其影響的結(jié)構(gòu)、功能、活性，具有一定的理論和實際意義。因此，該研究通過AFt與PCs復(fù)配制成復(fù)合物，為更好地解決PCs穩(wěn)定性提供一種途徑。

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Interaction between Apoferritin and Proanthocyanidins and Stability of Their Complex

ZHOU Zhongkai1,2, XU Jingjing1, LIU Yuqian1, YANG Rui1,2,*
(1. Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Ministry of Education, College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2. Institute for New Rural Development, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Proanthocyanidins (PCs) are a broad superfamily of bioactive substances, which belong to a class of flavonoids. However, because of their instability against wet, sunlight or high temperature, their application in food, medicine, and health products is restricted. In this paper, purified apoferritin (AFt) and PCs were prepared and used to prepare apoferritinproanthocyanidins complex (AFt-PCs). The interaction of AFt with PCs was studied by using fluorescence spectroscopy, circular dichroism (CD) spectroscopy, and transmission electron microscopy (TEM). Meanwhile, the stability of free PCs and PCs in AFt-PCs under different conditions of light and temperature was compared. It was found that PCs significantly quenched the fluorescence of AFt, and the binding number n of PCs to AFt through the model fitting was 0.07:1 (PCs/AFt, m/m), with an apparent binding constant K of (2.03 ± 0.08) ×104L/mol. PCs did not change the secondary structure of AFt to a significant extent. TEM results exhibited a certain degree of polymerization of Aft by the induction of PCs. In addition, the stability of PCs in AFt-PCs against light and temperature was higher than that of free PCs. This work provided a method to explore the multicomponent interaction in food and to improve the stability of PCs.

proanthocyanidins; ferritin; stability

10.7506/spkx1002-6630-201713006

TS201.2

A

1002-6630（2017）13-0034-07

周中凱, 徐晶晶, 劉玉茜, 等. 鐵蛋白-原花青素的相互作用及原花青素穩(wěn)定性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(13): 34-40. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713006. http://www.spkx.net.cn

ZHOU Zhongkai, XU Jingjing, LIU Yuqian, et al. Interaction between apoferritin and proanthocyanidins and stability of their complex[J]. Food Science, 2017, 38(13): 34-40. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201713006. http://www.spkx.net.cn

2016-05-23

天津市自然科學(xué)基金青年項目（16JCQNJC14500）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31501489）；國家自然科學(xué)基金面上項目（31471701）

周中凱（1964—），男，教授，博士，研究方向為谷物的營養(yǎng)與功能。E-mail：zkzhou@tust.edu.cn

*通信作者：楊瑞（1987—），男，講師，博士，研究方向為食品功能蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。E-mail：yangrui@tust.edu.cn