兩種無(wú)孔強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜固定相的制備及色譜性能比較

卜春苗，龔波林

（1.寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，寧夏銀川750021；2.北方民族大學(xué)，寧夏銀川750021）

兩種無(wú)孔強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜固定相的制備及色譜性能比較

卜春苗1，龔波林2

（1.寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，寧夏銀川750021；2.北方民族大學(xué)，寧夏銀川750021）

針對(duì)基質(zhì)表面的化學(xué)修飾是分離材料性能的直接決定因素。本文對(duì)3.0 μm無(wú)孔單分散親水性交聯(lián)聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯樹(shù)脂（PGMA/EDMA）進(jìn)行不同的化學(xué)方法改性，制備得到兩種強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜填料（SCX-I和SCX-II），并對(duì)填料表面的磺酸基含量進(jìn)行測(cè)定。在相同的色譜條件下，詳細(xì)考察了這兩種填料對(duì)堿性蛋白的分離性能，親水性能考察，以及對(duì)溶菌酶的動(dòng)力學(xué)吸附容量。SCX-I和SCX-II填料的各項(xiàng)性能對(duì)比結(jié)果表明，SCX-I填料上磺酸基鍵合量高，分離堿性蛋白具有較好的選擇性，親水性好，能夠用于對(duì)雞蛋清中溶菌酶的快速分離純化。

無(wú)孔單分散親水性聚合物微球；強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜；對(duì)比；蛋白分離

Key words：non-porous monodiperse polymer beads；strong cation-exchange stationary phase；comparison；protein separation

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）已成為發(fā)展生命科學(xué)，材料科學(xué)和環(huán)境科學(xué)等重要學(xué)科研究必不可少的手段和工具[1，2]。色譜固定相是HPLC系統(tǒng)的核心，也是分離科學(xué)研究的重要課題[3]。目前離子交換色譜固定相在活性生物大分子的分離和純化中被廣泛應(yīng)用，但一般要分離的目標(biāo)產(chǎn)物常處于稀的水溶液或發(fā)酵液中，易使蛋白質(zhì)失活和構(gòu)型發(fā)生變化，因此減少分離和純化時(shí)間以保持蛋白的生物活性是非常必要的[4]，無(wú)孔類(lèi)型的快速離子交換色譜固定相應(yīng)運(yùn)而生。與多孔填料相比，其最主要的特點(diǎn)是，被分離的生物大分子只在表面進(jìn)行傳質(zhì)交換，消除了停滯流動(dòng)相傳質(zhì)帶來(lái)的峰加寬，故可用于蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的快速分離分析[5]。

相關(guān)離子交換色譜固定相的報(bào)道較多，但大多為硅膠基質(zhì)，大大限制了固定相在分離中的pH應(yīng)用范圍。本文采用自制的3.0 μm無(wú)孔單分散親水性的交聯(lián)聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯（PGMA/EDMA）樹(shù)脂[6]，同時(shí)解決多孔填料分離純化時(shí)間長(zhǎng)和硅膠pH應(yīng)用范圍窄的弊端。另外，對(duì)基質(zhì)進(jìn)行表面修飾是提高固定相分離性能和選擇性的決定因素，這也是研究者都致力于開(kāi)發(fā)新型制備方法和合成路線(xiàn)用于提高分離材料色譜性能的主要原因。基于以上原因，開(kāi)發(fā)兩種改性方法，對(duì)（PGMA/EDMA）樹(shù)脂進(jìn)行修飾用于制備強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜（SCX）固定相，詳細(xì)研究不同合成方法對(duì)離子交換色譜性能的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

（1）儀器：高效液相色譜儀（Agilent 1100），CGY－100型高壓氣動(dòng)泵，2003型電動(dòng)攪拌器，超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

（2）試劑：肌紅蛋白（Myo，馬心）；核糖核酸酶（RNase-A，牛紅細(xì)胞）；α-糜蛋白酶原-A（α-Chy-A，牛胰臟）；細(xì)胞色素-C（Cyt-C，馬心）；溶菌酶（Lys）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 強(qiáng)陽(yáng)離子交換填料的合成

1.2.1 SCX-I型填料的合成100 mL三頸瓶中加入4.0 g水解PGMA/EDMA樹(shù)脂（II）,再加入一定量的二氧六環(huán)和三氟化硼乙醚后,超聲分散5 min，在攪拌下滴加一定量環(huán)氧氯丙烷，80℃恒溫水浴反應(yīng)2.5 h，產(chǎn)物依次用水和丙酮洗滌后真空干燥。再取樹(shù)脂（III）3.0 g加入到250 mL的單口燒瓶中，加入16 mL無(wú)水乙醇和一定量NaHSO3水溶液，超聲分散5 min，90℃水浴反應(yīng)24 h。產(chǎn)物用水反復(fù)洗滌。抽濾，干燥，得SCX-I型填料。合成反應(yīng)（其中P代表聚合物）（見(jiàn)圖1）。

1.2.2 SCX-II型填料的合成將3.0 g無(wú)孔PGMA/EDMA（I）樹(shù)脂加入一定量的稀鹽酸中，在30℃水浴中反應(yīng)2.5 h。產(chǎn)物用水，乙醇，丙酮反復(fù)洗滌數(shù)次，真空干燥，即得微球（II）。再加入一定量NaHSO3水溶液，超生分散后80℃水浴中反應(yīng)24 h，再用水，乙醇和丙酮反復(fù)洗滌即得到強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜填料（SCX-Ⅱ）。合成路線(xiàn)（見(jiàn)圖2）。

1.3 色譜填料的裝填

將自制的SCX-I和SCX-II填料，以蒸餾水為勻漿液和頂替液，在30 MPa壓力下以勻漿法裝柱，不銹鋼柱管：5.0×0.46 cm I.D。

圖1 SCX-I型填料合成路線(xiàn)

圖2 SCX-II型填料的合成路線(xiàn)

1.4 磺酸基含量的測(cè)定

按照文獻(xiàn)[7]報(bào)道的方法測(cè)定填料表面磺酸基的含量。

1.5 動(dòng)態(tài)吸附容量測(cè)定

動(dòng)態(tài)吸附容量的測(cè)定采用迎頭分析法[8]，含有2 mg/mL Lys的PBS的緩沖溶液測(cè)定其穿透曲線(xiàn)，根據(jù)下式計(jì)算動(dòng)態(tài)吸附容量：

式中：q5-達(dá)到5%穿透時(shí)的動(dòng)態(tài)吸附容量（mg/mL）；c-入口Lys的濃度；F-Lys的體積流速（mL/min）；t5-出口濃度達(dá)到5%的保留時(shí)間（min）；t0-死時(shí)間（min）；V-柱體積（mL）。

1.6 應(yīng)用研究

雞蛋清樣品的處理：取新鮮的蛋清液20 mL，向其中加入80 mL 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=8.5），超聲15 min后加入一定量的NaCl使其濃度為1.0 mol/L，離心除去雜質(zhì)，得到的上清液用所制備的SCX柱進(jìn)一步分離純化溶菌酶。

2 結(jié)果及討論

2.1 SCX填料的合成及評(píng)價(jià)

同苯乙烯微球相比，PGMA/EDMA微球表面的疏水性弱，但此微球制備時(shí)以聚苯乙烯（PSt）為種子，采用一步溶脹聚合法得到，其疏水性主要來(lái)源于碳?xì)渲麈満统樘岵煌耆腜St種子，所以將該樹(shù)脂作為生物大分子的分離材料，對(duì)其進(jìn)行表面親水性改性是非常必要的。本實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)合成兩種改性方法用于制備SCX填料。SCX-I填料制備（見(jiàn)圖1），首先將PGMA/EDMA微球水解為具有一定親水性的鄰二醇，再進(jìn)一步與環(huán)氧氯丙烷反應(yīng)，后與含有氯的樹(shù)脂與NaHSO3反應(yīng)得到帶有磺酸基的陽(yáng)離子填料。改性方法大大增加了PGMA/EDMA樹(shù)脂表面的親水性，測(cè)定其磺酸基含量為0.37 mmol/g。SCXII填料的改性方法相對(duì)簡(jiǎn)單（見(jiàn)圖2），將PGMA/EDMA微球先與稀鹽酸反應(yīng)，后與NaHSO3反應(yīng)即可得到，此方法簡(jiǎn)單，但其親水性不如SCX-I填料，測(cè)定其磺酸基含量?jī)H為0.19 mmol/g。

2.2 SCX柱對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分離性能

標(biāo)準(zhǔn)蛋白在兩種SCX柱上的分離圖（見(jiàn)圖3）。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)蛋白在兩種SCX柱上的分離圖

2.3 SCX填料表面親水性能考察

無(wú)孔PGMA/EDMA樹(shù)脂的疏水性主要源于聚合物的碳?xì)渲麈湥虼耍瑧?yīng)對(duì)改性后的SCX-I和SCX-II填料表面的親水性進(jìn)行考察。采用在流動(dòng)相中加入5%（v/v）的異丙醇（IPA）溶液，與不加入IPA時(shí)的結(jié)果相比較（見(jiàn)表1）。

表1 SCX-I和SCX-II柱上未加IPA和加5%IPA對(duì)蛋白保留的影響

從表1中可以看出，加入異丙醇后四種蛋白在SCX-I和SCX-II柱的保留時(shí)間都有不同程度地減小，但SCX-I柱減小量較小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明SCX-I柱上僅存在弱的疏水性，蛋白質(zhì)的保留行為主要取決于與固定相之間的靜電相互作用，這也說(shuō)明了SCX-I柱的改性方法優(yōu)良，增強(qiáng)了固定相表面的親水性，大大抑制了蛋白與微球間的非特異性吸附。

2.4SCX填料動(dòng)力學(xué)吸附容量的測(cè)定

動(dòng)態(tài)吸附曲線(xiàn)能夠?yàn)榉蛛x介質(zhì)的動(dòng)力學(xué)鍵合量提供有價(jià)值的信息。在本工作中，分別測(cè)定了SCX-I和SCX-II柱對(duì)溶菌酶（Lys）的動(dòng)力學(xué)吸附容量，測(cè)試流動(dòng)相組成為20 mmol/LPBS+1.0 mol/LNaCl+0.5 mg/mLLys，流速為0.5 mL/min條件下獲得的前沿突破曲線(xiàn)。根據(jù)公式（1）得到SCX-I和SCX-II的動(dòng)力學(xué)吸附容量分別為：20.5 mg/g和15.6 mg/g。磺酸基含量較高的SCX-I柱具有較高的吸附容量，進(jìn)一步表明，SCX-I填料的改性方法更適用于分離純化堿性蛋白。

圖4 雞蛋清樣品中溶菌酶與標(biāo)準(zhǔn)樣品中溶菌酶對(duì)比

2.5 SCX柱應(yīng)用于分離純化雞蛋清中溶菌酶

目前，離子交換色譜是制備高純度溶菌酶最常用的方法。本文采用合成的SCX-I柱對(duì)所處理的雞蛋清樣品進(jìn)行分離，與標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶樣品進(jìn)行對(duì)照（見(jiàn)圖4），在2 mL/min的流速下，6 min內(nèi)可對(duì)雞蛋清中的Lys進(jìn)行快速分離純化。圖4中的第一個(gè)峰為雜蛋白，標(biāo)*的峰為L(zhǎng)ys。由圖4可以看出，Lys與其他雜蛋白得到了較好的分離，收集Lys組分，測(cè)定其純度大于92%。這表明所合成的無(wú)孔SCX-Ⅰ柱具有較高的選擇性，具備實(shí)際分離純化能力。

3 結(jié)論

本文主要針對(duì)不同的表面修飾方法直接決定分離材料的色譜行為。以3.0 μm無(wú)孔單分散親水性交聯(lián)聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯樹(shù)脂為基質(zhì)，采用兩種不同改性方法，制備得到兩種強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜填料：SCX-I和SCX-II，首先測(cè)定SCX填料表面的磺酸基鍵合量，結(jié)果顯示SCX-I填料上的磺酸基含量大大高于SCX-II。進(jìn)一步驗(yàn)證兩柱的色譜行為，結(jié)果顯示，SCX-I柱對(duì)堿性蛋白的分離表現(xiàn)出更好的選擇性，具有優(yōu)良的親水性能和較高的動(dòng)態(tài)吸附容量，最后應(yīng)用于雞蛋清中溶菌酶的分離純化中取得了滿(mǎn)意的效果。

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Preparation of two types of non-porous strong cation-exchange stationary phases and comparison with their performance

BO Chunmiao1，GONG Bolin2
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Ningxia University，Yinchuan Ningxia 750021，China；2.Beifang University of Nationalities，Yinchuan Ningxia 750021，China）

The chemical modification on the surface of substrate is the critical factor on the performance of separation material.In this work,two kinds of strong cation-exchange（SCXI and SCX-II）stationary phases have been synthesized by the different chemical modification of the 3.0 μm non-porous monodiperse poly（glycidymethacrylate-co-ethylenedimethacrylate）（PGMA/EDMA）resin,and determined the percent of sulfonate groups on the two prepared SCX materials.Under the same chromatographic conditions,the performance for the separation of basic proteins,hydrophilicity,dynamicn loading capacity of the two SCX columns were investigated in detail.In comparison with the performance of SCX-I and SCX-II packings,the results indicated that the higher bonded content of sulfonate groups,the better selectivity on the separation of basic proteins and hydrophilicity were all achieved on SCX-I stationary phase.Finally,the application in rapid separation and purification of Lys from egg white by SCX-I column obtained satisfactory results.

O657.75

A

1673-5285（2017）06-0137-04

10.3969/j.issn.1673-5285.2017.06.030

2017－05-12

卜春苗，女（1980-），中級(jí)，碩士，主要從事色譜固定相的制備及應(yīng)用研究的工作。