體外擴增源于成人頭皮組織的真皮細胞具有多向分化潛能

周倩，張群，冷雪，俎廷建，秦靜，溫潔，吳訓偉,2（通訊作者）

（1.山東大學口腔醫院，山東 濟南 250000；2. 山東大學蘇州研究院，江蘇 蘇州 215000）

體外擴增源于成人頭皮組織的真皮細胞具有多向分化潛能

周倩1，張群1，冷雪1，俎廷建1，秦靜1，溫潔1，吳訓偉1,2（通訊作者）

（1.山東大學口腔醫院，山東 濟南 250000；2. 山東大學蘇州研究院，江蘇 蘇州 215000）

目的 探討來源于成人頭皮組織的真皮細胞經體外培養擴增后其向成脂、神經、成骨及成肌方向分化的潛能，為皮膚創傷修復種子細胞的新來源提供依據。方法 取胚胎及成人頭皮組織分離真皮細胞。利用維持細胞多功能性的培養基傳代培養，取第4代真皮細胞免疫熒光染色，通過檢測 波形蛋白和角蛋白的表達進行細胞鑒定。對真皮細胞進行定向分化誘導并用免疫熒光染色檢測各方向分化指標蛋白，通過和源于胚胎頭皮組織的真皮細胞比較，來分析其多向分化潛能。結果 原代細胞分離后24h貼壁，細胞形態多為梭形或多角形，可多次傳代且傳代后細胞形態均一穩定。免疫熒光染色結果顯示該細胞僅表達波形蛋白（vimentin）不表達角質蛋白（Pan-CK）；源于成人及胚胎頭皮的真皮細胞均能誘導向成脂、成骨、成神經及成肌細胞方向分化，盡管與源于胚胎組織的細胞相比，成人真皮細胞分化效率相對較低。結論 源于頭皮分離的成人真皮細胞經培養擴增后能誘導分化成不同組織細胞，因而具有多向分化潛能。由于成人頭皮組織相對容易獲得，其來源廣泛，因而可成為皮膚組織工程研究以及臨床應用的理想種子細胞。

成人皮膚組織；真皮細胞；波形蛋白；角蛋白；多向分化

0 引言

真皮細胞來源于胚胎中胚層間質細胞，具有增殖能力強、體外培養不易老化、易于傳代的特點，是人體分布最廣，參與組織修復最重要的一類細胞，被視為人體數量最大的“種子細胞庫”[1]。以往的研究認為，真皮細胞是終末分化細胞，不具備繼續向其他細胞方向分化潛能，而且，體外培養擴增的細胞往往喪失其多功能性。但是，近期有報道稱真皮細胞在特定的誘導條件下，可以向成骨、成軟骨、成脂、成胰島方向分化[2-5]。能夠表達間充質干細胞相關標志物CD71、CD73/SH3-SH4、CD90/Thy-1、CD105/SH2 和CD16/ALCAM[6-8]，通過病毒轉導相關轉錄因子到胚胎成纖維細胞誘導其多功能性，成纖維細胞能夠表達多功能性標志蛋白SSEA1、SOX2和NANOG等[9]。值得一提的是，郭常敏[3]對人的包皮細胞進行誘導后，可向成脂、成骨及成軟骨方向分化，但未報道向成神經及成肌方向的分化；Lee[10]等研究中，將神經相關因子轉入人真皮細胞中，發現轉染細胞表達神經相關蛋白及神經膠質細胞表面標志，證實相關神經因子的誘導分化功能，而真皮細胞自身分化潛能未知。這些報道主要是來自較年輕的包皮組織來源的真皮細胞的研究，而對成人組織真皮細胞研究較少。毛發組織一直被認為是分離高潛能干細胞的來源，因為毛囊中存在干細胞niche,另外毛乳頭細胞和毛囊真皮間鞘細胞具有多向分化潛能，然而毛囊來源的干細胞分離方法較繁瑣，而且得到細胞數也較少。本課題組已成功創建分離和培養皮膚多功能細胞體系，利用該體系培養的來源胚胎頭皮細胞移植到免疫鼠身上能再生帶有附屬器官的完整人類皮膚，表明培養擴增后細胞仍具有再生能力。為進一步探討成人皮膚組織來源細胞的多功能性，本文以成人的頭皮組織來源的真皮細胞作為研究對象，利用我們創建的簡便分離方法分離并培養擴增[11]，對傳代擴增后的真皮細胞進行多向誘導分化，并與胚胎細胞進行比較，來鑒定成人真皮細胞成脂、成骨、成神經及成肌多向分化潛能，為將來組織工程學種子細胞的來源提供依據。

1 真皮細胞的分離與傳代

取人頭皮組織，70%乙醇消毒1-3min ,浸泡于含2%雙抗的PBS液中，手術刀刮除脂肪及血漬，PBS沖洗皮膚2次。混合法[11]分離細胞，接種于培養皿中，37℃，5%CO2及飽和濕度條件下培養。3天后換液，去除未貼壁細胞。每5天換液1次，當細胞融合至80%～90%時，進行傳代。取第4代細胞用于研究。

2 真皮細胞的體外定向誘導分化

取兩種來源的第3代真皮細胞，0.05%胰酶消化，細胞重懸。每種誘導方式均同時將兩種來源細胞分別接種到含滅菌蓋玻片的24孔板中，制備細胞爬片。接種細胞數為5×104-8.0×104個/孔，每種細胞設8個復孔，待細胞完全融合，取其中兩個孔做陰性對照組，另外六孔作為實驗組加入相應的誘導液進行培養（不同誘導液成分見表1）。均放置于37℃、5% CO2及飽和濕度條件下靜置培養。

2.1 成脂誘導及鑒定

細胞完全融合后，棄掉培養液，陰性對照組用正常培養基培養，實驗組用成脂誘導液誘導培養兩周，每3天換一次液，37oC、5% CO2及飽和濕度條件下靜置培養。兩周后進行免疫熒光染色，標記FABP-4蛋白的表達。

2.2 成骨誘導及鑒定

細胞完全融合后，棄掉培養液，陰性對照組用正常培養基培養，實驗組每孔加入500μL誘導液進行誘導培養。此后，每隔3天更換成骨誘導液1次，分化誘導3周后，免疫熒光染色標記骨橋蛋白（Osteopontin）的表達。

2.3 成肌分化誘導及鑒定

細胞完全融合后，棄掉培養液，陰性對照組用正常培養基培養，實驗組每孔加入500μL成肌誘導液，誘導48h后換為普通培養基。每3-4天換1次液，分化誘導2周后，免疫熒光染色檢測鈣調蛋白（Calponin）的表達。

2.4 向神經細胞分化誘導及鑒定

取第3代真皮細胞，胰酶消化后，將5×104個細胞接種于24孔板中，制備細胞爬片。當細胞達到80%融合時加入誘導液進行誘導，3周后分別檢測神經元及神經膠質細胞特異表達蛋白p75NTR和GFAP的表達。

表1 誘導液成分

3 免疫熒光染色檢測分化指標

誘導分化后，棄掉培養基，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定15min , PBS沖洗3次，5%BSA封閉1h，取出爬片，滴加一抗（Anti-CalponinRabbitmAb，ab46794，abcam，1∶250；Anti-OsteopontinMouse mAb，ab69498，abcam；2 μg/ml；FABP4 (D25B3) XPRabbit mAb，#3544S，CST，1：200；GFAP (GA5) Mouse mAb，#3678S，CST，1：300；p75NTR (D4B3) XPRabbit mAb，#8238S，CST，1：1600；Pan-CK，Mouse mAb，BD Biosciences，Cat：550951，1：500）4℃孵育過夜，熒光二抗（Dylight 594 Goat Anti-Mouse IgG（H+L），GAM5942，聯科生物，1：1000; Dylight 488 Goat Anti-Rabbit IgG（H+L），GAR4882，聯科生物，1：1000）室溫避光孵育1h，封片，鏡下觀察拍照。

4 結果

4.1 細胞形態及生長特點

具有多向分化潛能的原代真皮細胞為貼壁生長的長梭型細胞，分離后24h貼壁，呈多角形集落樣生長，剛貼壁時體積小，類似圓形，3天后，體積變大，呈多角形，胞質豐富，胞核清晰。傳代后，細胞形態規則均一，呈長梭型，生長密度達70%左右時增殖明顯（圖1）。

圖1 第4代真皮細胞（×100）

4.2 Vimentin及Pan-CK的表達

免疫熒光法檢測原代真皮細胞特異性標志物vimentin的表達為陽性，Pan-CK為陰性（圖2）

圖2 第4代真皮細胞（×100）

4.3 分化誘導

源于胚胎及成人頭皮的真皮細胞向成骨方向誘導1周后開始出現鈣鹽及鈣化結節，并隨誘導時間的加長而增多，誘導3周左右，特異性標志蛋白骨橋蛋白（Osteopontin）染色呈陽性（圖3A，B），結果顯示胚胎組誘導效率高于成人組；在成脂誘導中，細胞體積隨誘導時間加長逐漸變大，1周左右出現脂滴，并逐漸增多，誘導3周時進行免疫熒光染色，FABP-4蛋白呈陽性表達（圖4A，B），結果顯示胚胎組FABP-4蛋白陽性表達率高于成人組；成神經分化誘導3周后，用免疫熒光染色法分別標記神經元及神經膠質細胞的標志性蛋白p75NTR和GFAP，胚胎組p75NTR和GFAP分別呈陽性，而成人組p75NTR表達不明顯，GFAP表達呈陽性，且表達強度高于胚胎組（圖5A，B，C，D）；成肌誘導第3周后，兩組細胞鈣調蛋白（Calponin）均呈陽性表達（圖6A，B）。

圖3 真皮細胞成骨誘導（免疫熒光染色，×100）

圖4 真皮細胞成脂誘導（免疫熒光染色，×100）

圖5 真皮細胞成神經誘導（免疫熒光染色，×100）

圖6 真皮細胞成肌誘導分化（免疫熒光染色，×100）

5 討論

再生醫學是利用人體的潛能，給其創造一個再生生理環境和激活因素，而后利用自身條件啟動再生程序。再生醫學涉及身體的各個器官的再生修復，皮膚再生是其中一種，對于大面積燒傷或者其他皮膚疾病需要皮膚移植治療的臨床疾病，提供種子細胞是組織再生的根本，通過體外培養擴增種子細胞，再生或重建組織來修復受損器官。作為種子細胞，至少具有以下兩個特性即容易獲得和培養擴增后保持多向分化潛能。通常情況下，皮膚組織容易得到，但是經體外培養的細胞往往喪失其多向分化能力而達不到再生相應組織的能力，所以，體外培養細胞的干性維持在皮膚再生過程中極其關鍵。以往研究顯示皮膚來源的祖細胞（SKP）具有多向分化潛能，然而SKP分離培養方法比較復雜，需要一定時間來擴增。毛囊組織周圍存在干細胞群包括毛乳頭細胞，從毛囊組織分離的干細胞在體外具有很強的分化潛能，因而比來源于皮膚其他部分更具有優越性。然而傳統的顯微解剖法分離毛囊來源的干細胞如毛乳頭，分離勞動強度大而且得到細胞較少等缺陷。本團隊創建了分離皮膚組織的簡單方法，分離的胚胎頭皮細胞經培養擴增后，移植到體內能再生帶有毛發等附屬器官的完整皮膚[11]，建議我們體外培養擴增的胚胎細胞具有多向分化潛能，然而胚胎組織在臨床上不可能來源于自體細胞，加上倫理問題以及成瘤的可能性，而限制其應用。本文選擇具有毛囊的成人頭皮組織作為研究對象，分離頭皮組織的真皮細胞，并經傳代培養擴增后來研究其是否和源于胚胎組織細胞一樣，具有多向分化潛能。

首先，利用本實驗室細胞創建的分離培養體系[11，15]，分離后的真皮細胞24h貼壁，初期，細胞呈圓形，貼壁4到5天傳代后，細胞形態均勻穩定，變大變飽滿，成偏長的三角形。免疫熒光染色標記間充質細胞的特異性表達蛋白vimentin 呈陽性，而表皮細胞特異表達標志蛋白Pan-CK表達為陰性，說明分離出的細胞為真皮細胞，未有表皮細胞污染。以往的分離方法大多數是利用兩步酶消化法[12，13]，本實驗結合傳統的細胞分離方法，改良為一步法，能簡單有效地從成人皮膚組織分離表皮和真皮細胞[15]。然后，分離的細胞進行培養擴增和傳代，取第4代的真皮細胞進行分化誘導，免疫染色分化指標顯示來自成人頭皮組織真皮細胞不僅能向成脂、成肌、成骨方向分化，并且能分化成神經元及神經膠質細胞。 與胚胎頭皮的真皮細胞相比，盡管誘導分化效率相對較低，但來源于成人組織的真皮細胞具有很強的多向分化潛能。比較不同發育時期真皮細胞分化潛能的差異性，顯示：這種培養體系下兩種來源的真皮細胞均具有多向分化潛能，Junker等人已經證實，真皮成纖維細胞具有向成脂、成肌、成骨及成軟骨方向分化的潛能，但向神經細胞的分化能力報道較少，而且成人組織來源的細胞也研究較少[2-3，6-9，14，16]。本研究比較全面的顯示來源成人頭皮組織真皮成纖維細胞能向不同胚層包括外胚層的神經細胞分化。該結果我們分離培養體系能培養擴增多向分化潛能的皮膚真皮細胞。 考慮到胚胎來源細胞的倫理性及成人來源皮膚的廣泛性，成人組織來源的皮膚細胞實用價值更高，可作為皮膚再生基礎研究和自體細胞移植治療皮膚創傷成為的種子細胞。

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Culture-expanded adult dermal cells derived from scalp tissue are multi- differentiation potential

ZHOU Qian1, ZHANG Qun1, LENG Xue1,ZU Ting-jian1,QING Jing1, WEN Jie1, WU Xun-wei1,2
(1.Stomatological Hospital of Shandong University, Jinan, 250000;2. Su Zhou research institute of Shandong University Suzhou, 215000)

Objective The study was to explore that he potential of culture-expanded dermal cells derivedfrom adult scalp tissue in vitro differentiating into adipoblasts, nerve, osteoblasts and myofibroblasts, and it would provide a basis for the new source of seed cells for skin wound repair. Methods The dermal cells derived from adult and embryonic scalp tissues were respectively isolated and cultured in the media that could maintain cell multipotential. After 4th passage, the dermal cells were identified by detecting the expression of vimentin and pan-CK b y immunofluorescence staining. Thedirectional differentiation of dermal cells was induced by different conditioned media and the difference of multi-differentiation potential between adult and embryonic dermal cells was analyzed with detecting the expression of differentiation markers by immunofluorescence staining. Results The primary cells completely attached to the culture-dish within 24h after isolation and the cell shapes were irregular, most of which were spindle or polygonal shape. The cellular morphology became uniform after passages. Theimmunofluorescent staining results showed that these cells expressed mensenchymal marker vimentin, but didn’t express epidermal cell marker pan-CK . After cultured in inducing differentiation medium, both adult and embryonic cells were able to differentiate into osteoblasts, adipoblasts, nerveand myofibroblasts, although that the differentiation efficiency of adult dermal cell wass relatively lower compared to that of embryonic cells. Conclusion The adult dermal cells after culture-expanded in vitro were able to differentiate into different cell types and could maintain multi-differential potential. The adult issues are easy to access and obtain, therefore our results suggest the adult dermal cells are the ideal source cells for both basic research and clinical application in the field of skin tissue engineering and regeneration.

Embryo Adult； Dermal cell； vimentin； keratin； Multi-directional differentiation

10.19335/j.cnki.2096-1219.2017.03.01

蘇州市科技計劃項目（ZXY201441），江蘇省科技計劃項目（BK20161241）

周倩，女，碩士研究生；山東大學口腔醫院，助理工程師。研究方向：毛發再生新技術。吳訓偉，男，研究員，博導；山東大學口腔醫院；研究方向：皮膚和毛發再生新技術及其應用研究。