姜黃素對人宮頸癌細胞放療增敏的作用研究

【中圖分類號】R97 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-3783（2013）12-0184-01

【摘要】本文探討了姜黃素（Cur）對人宮頸癌Hela細胞放射增敏的可能作用機制。采用免疫細胞化學法檢測細胞處理后P21和Bcl-2蛋白表達情況，結果顯示姜黃素和射線單用均能升高P21蛋白表達和降低Bcl-2蛋白的表達（P﹤0.05），二者聯用則變化更明顯（P﹤0.01）。說明姜黃素對人宮頸癌Hela細胞具有放射增敏作用可能與其上調P21和下調Bcl-2蛋白表達有關。

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，放療是其主要的治療手段，但宮頸癌單純放療5年生存率只有50%左右，故提高宮頸癌放療敏感性在臨床上有著極其重要的意義。目前臨床上放療增敏劑主要是一些化療藥物，如順鉑、泰素等，但由于這些藥物對正常細胞的毒性作用較大，而且其與放療的毒性作用有協同作用，病人一般難以耐受。姜黃素是從姜黃屬植物姜黃、郁金、莪術等植物的根莖中提取出來的多元酚，其對慢性粒細胞白血病有獨特的療效[1]，本課題組前期發現其尚對體外培養的人宮頸癌Hela細胞具有放射增敏作用[2]，但其作用機制不詳，本文對此進行了探討。

1 實驗部分

1.1 試驗材料 人宮頸癌HeLa細胞（湖北醫藥學院臨床研究所）；姜黃素（HPLC>98%，成都思科華生物技術有限公司，用DMSO溶解配成1mg/mL的母液備用，使用前用10%RPMI1640培養液稀釋至所需濃度）；小鼠抗人Bc1-2、P21、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG均為美國Santa Cruz公司產品；Clinac 600C/D加速器（ 美國Varian 公司）。

1.2 細胞培養及照射條件 人宮頸癌Hela細胞培養于含10%新生牛血清RPMI-1640培養基中，并置于含5%CO2的37℃溫箱中培養，所有照射均為室溫下照射，射線劑量率為40cGy/min。

1.3 免疫細胞化學法檢測P21、Bcl-2蛋白 將Hela細胞接種于加有蓋玻片的2個6孔板中，分為空白組、As2O3組、單放組、藥放組，每個組設3個復孔，待細胞貼壁后姜黃素組和藥放組加藥， 終濃度2umol/L，給藥24小時后單放及藥放組接受2Gy放療，24小時后取出蓋破片，以PBS（pH=7.5）沖洗，3min/次，沖洗三次后，放入4%多聚甲醛中固定20min，以PBS （pH=7.5） 沖洗， 3min/次，沖洗三次后，0.1%Triton X-100（ PBS緩沖液中含檸檬酸鈉0.1%）

透膜5min，以PBS （pH=7.5）沖洗，3min/次，沖洗三次后， 3%H2O2-甲醇溶液室溫孵育10min以封閉內源性過氧化物酶，按免疫試劑盒操作說明逐步進行，一抗工作濃度1：100，DAB室溫顯色15-20 min（顯微鏡下控制），自來水沖洗，中性樹脂封片，顯微攝影計算陽性細胞數。

1.4 統計學方法 所得數據以x±s形式表示，SPSS13.0軟件進行單因素方差分析， P<0.05為差別有統計學意義， P<0.01為差別有顯著性統計學意義。

2 結果

2.1 免疫細胞化學法檢測Bcl-2蛋白 鏡下可見，Bcl-2主要位于細胞質中，少許分布于胞膜中，為粗細不等的棕黃色顆粒，放射及姜黃素均能降低Bcl-2的表達，二者聯合效果更明顯（P〈0.01），見表1。

3 討論

姜黃素是植物姜黃中的主要活性成分，具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗血管新生以及抗腫瘤等多種生物學功能。本課題組前期將姜黃素同步放射線照射用于體外觀察對宮頸癌Hela細胞增殖的影響，結果發現，單純應用姜黃素，細胞增殖抑制率與藥物濃度的增加成正比；單純應用放射線照射，細胞抑制率也隨射線劑量的增加而增加，但當輻射劑量達到12Gy時細胞增殖抑制率達到坪臺期，不再隨射線劑量的加大而增加，在單純輻射劑量已達到“閾值”的情況下，聯用姜黃素可使細胞增殖抑制效果得到進一步的提高，且對細胞增殖的抑制率高于單純放射組和單純藥物組，說明同步應用姜黃素確實可對宮頸癌細胞放療產生增效的作用，這與常萍等人觀察的順鉑對宮頸癌放療增敏作用特點相一致[3]。

為進一步探索其作用機制，本研究進一步檢測了細胞內p2l和Bcl-2兩蛋白的改變，p2l蛋白是細胞周期依賴性激酶抑制蛋白家族成員，其功能主要是通過抑制細胞周期調控因子與細胞周期蛋白形成復合物，從而發揮細胞增殖抑制作用，同時p2l又能抑制增殖細胞核抗原活性，從而直接抑制DNA的合成，有研究表明p2l基因的表達上調與放射敏感性增高密切相關。Bcl-2即B細胞淋巴瘤/白血病-2，是第一個被發現的能抑制多種細胞凋亡的原癌基因，也是最重要的凋亡調節因子之一，可通過調節線粒體的功能來調節凋亡，有文獻報道Bcl-2基因的表達下調與放射敏感性增加密切相關[5]。本實驗通過免疫細胞化學法檢測發現放射及藥物均能提高p21表達，下調Bcl-2表達，放射和藥物聯合作用效果更強。由此可推測，姜黃素放射增敏的機制可能是通過抑制Hela細胞的亞致死性損傷的修復、調整細胞周期的分布、上調p2l蛋白及下調Bcl-2蛋白的表達而實現的。[基金項目]湖北醫藥學院第三臨床學院資助項目（201201）；湖北省十堰市科技局基金資助項目（ZD2012026）

參考文獻

[1]饒佳，黃仁魏.姜黃素抗腫瘤作用及機制的研究進展[J].新醫學，2011，42（2）： 127-130.

[2]張莉，鄧守恒，李芳，等. 姜黃素體外同步放療對宮頸癌細胞增殖影響的實驗研究[J].山西醫藥雜志，2013，42（4）：369-371.

[3]常萍，劉孜，王娟，等.順鉑對Hela細胞輻射增敏的體外實驗觀察[J].西安交通大學學報（醫學版），2011，32（4）：462-465.

[4]湯繼英，潘東風，石小燕，等.三氧化二砷對人宮頸癌Hela細胞的放射增敏作用[J].鄖陽醫學院學報，2008，27（2）：109-111.

[5]Satoshi A，Steve G，Kathleen S， et al.Knock-down of Bcl-2 by antisense oligodeoxynucleotides induces radiosensitization and inhibition of angiogenesis in human PC-3 prostate tumor xenografts[J].Mol Cancer Ther ，2007，6（1）：101–11.