母豬流行性腹瀉返飼后免疫應答評估

簡義虎，李潤成，胡仕鳳，葛 猛，余興龍

（湖南農業大學動物醫學院, 湖南 長沙 410128）

母豬流行性腹瀉返飼后免疫應答評估

簡義虎，李潤成，胡仕鳳，葛 猛，余興龍*

（湖南農業大學動物醫學院, 湖南 長沙 410128）

當前，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）流行廣、危害嚴重。除進行疫苗免疫工作外，返飼常常做為豬場控制豬流行性腹瀉的重要手段。筆者用6頭育肥后期豬模擬母豬返飼（攻毒）實驗，研究母豬返飼后排毒情況與血清抗體消長變化，來探究母豬返飼最佳時機以及如何避免返飼帶來的風險。結果表明，試驗豬在返飼后第2、3天相繼發生腹瀉并檢測到PEDV，在返飼后11 d豬血清中IgG抗體明顯上升,并在攻毒后第20天IgA與IgG檢測值均達到峰值,在攻毒后第15天唾液與糞便均檢測不到病毒。說明，生產上在產前15 d到30 d之間返飼效果較好，病毒感染仔豬的風險最低。為臨床防控該病提供理論依據。

母豬；流行性腹瀉；返飼

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種嚴重的病毒性傳染病。該病具有極高的感染性，可引起豬群發生嚴重的腹瀉，特別是7日齡以內哺乳仔豬，致死率極高[1]。本病雖多發生于寒冷季節，但在夏季也存在感染發病的情況[2]。該病已經被加拿大、亞洲、及其他歐洲國家報道,2013在美國也報道過該疾病，并在一年的時間里對美國的養豬業造成高達9億～18億美元的經濟損失[3]。對于PED防治問題，仍然困擾著國內大多數豬場,現市場上對于防治PED的疫苗雖有很多,但是PEDV還是出現于免疫豬群中,說明疫苗免疫保護效果不佳。特別在2010年以后我國PED的發病趨勢更加嚴重,不同階段的豬群均出現嚴重的腹瀉、嘔吐與脫水,部分豬場初生仔豬的死亡率高達100%,對我國養豬業造成了巨大經濟損失[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要診斷試劑

PEDV檢測膠體金購自Bionovet公司；RNA提取試紙盒購自北京天恩澤基因科技有限公司；RNA反轉錄試紙盒購自美國Thermo Scientfic；PCR MIX購自北京擎科新業生物技術有限公司。檢測引物見參考文獻[2]，引物由上海鉑尚生物技術有限公司合成。

1.1.2 樣品

收集攻毒后實驗豬的腹瀉糞便與唾液，以及攻毒前后攻毒豬血清。

1.2 方法

1.2.1 返飼及采樣方案

1）返飼前病料處理：取PEDV陽性初生仔豬腸道以及內容物300 g，經病原檢測無豬瘟、豬偽狂犬和藍耳病病原后，加入300 mL含青鏈霉素各60萬單位的生理鹽水，用組織搗碎機勻漿，取1 mL勻漿后的病料于-80 ℃保存，配合熒光定量PCR[5]測定返飼病料中病毒的拷貝數，返飼病料及時保存于4 ℃，并在1 h內進行返飼。

2）返飼：豬舍提前3 d徹底消毒，并用大量清水將豬舍沖洗干凈，為了促進豬發生腹瀉，在生豬運輸前不控料、運輸到實驗室后馬上進行返飼，并且不進行控料和胃腸功能調理工作。用保定繩對豬上顎進行保定，并抬高豬的頭部，每頭豬緩慢灌服100 mL返飼病料，灌服時不斷輕輕揉捏豬喉頭，加快豬的吞咽動作避免浪費。

3）返飼后飼養管理：6頭豬分為3欄飼喂（欄舍寬2 m，長2.5 m），攻毒期間打開豬舍內兩個吊扇（美的牌屋頂式吊扇調至最高檔），返飼期間氣溫為19～25 ℃，返飼后每天早上8點到夜晚10點，每隔3 h用冷水沖洗豬舍與豬臀部，返飼后第4天停止對豬與豬舍涼水沖洗，并關閉豬舍內的吊扇。腹瀉期間讓豬只自由采食，腹瀉第2天在飼料中添加適量的紅糖與食用鹽，腹瀉好轉后每天分2次飼喂，并停止使用紅糖與食用鹽，攻毒后第6天給生豬飼喂含益生菌的飼料添加劑，調節胃腸道功能。

4）樣本采集：腹瀉期間每隔3 h收集一次腹瀉糞便并做好標記，腹瀉好轉后每隔7 d收集一次糞便和肛門拭子，并用唾液收集條采集唾液，樣本收集后全部保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.2 病原檢測

1)將攻毒后生豬第一次腹瀉的糞便進行收集，并用韓國金諾生產的膠體金PEDV檢測試劑盒按說明書進行檢測；

2)將攻毒后第3天與第6天6頭豬腹瀉糞便，以及攻毒后第15天6頭豬的唾液與肛門拭子。分別按照RNA提取試劑盒與RNA反轉錄試劑盒說明書，采用RT-PCR方法檢測PEDV，同時對攻毒后第3天的腹瀉樣品用熒光定量PCR測定病毒的CT值與拷貝數。

1.2.3 血清抗體檢測

攻毒后每隔4～7 d對豬耳緣靜脈采集一次血清，將采集的血清按本實驗室建立的方法[6]，進行PEDV IgG、IgA抗體檢測。

2 結果

2.1 攻毒后第一次腹瀉糞便PEDV膠體金檢測結果

在攻毒后第2天有5頭豬發生腹瀉，第3天6頭豬全部發生腹瀉，取攻毒后第一頭腹瀉豬的糞便進行PEDV檢測，結果在膠體金的質控帶與檢測帶都出現了陽性條帶，說明攻毒后第1頭腹瀉豬的糞便為PED陽性，部分檢測結果見圖1。

2.2 攻毒后第3天腹瀉糞便PEDV RT-PCR檢測結果

分別采取6頭豬攻毒后第3天的排泄物，經RT-PCR （30循環）檢測，各個樣品在477 bp處均有一條特異性條帶，說明6份樣本PEDV檢測均為陽性（圖2），攻毒后第6天的腹瀉糞便檢測帶信號稍弱一些，攻毒后第15天收集的唾液與糞便棉簽PEDV全陰性。

由圖1的結果可知，在第1頭腹瀉豬的糞便中可檢測到PEDV，故在圖2中沒有設置陽性對照樣品，攻毒后第3天豬腹瀉糞便經RT-PCR檢測中條帶很亮，可以說明6頭豬已全部感染PEDV并出現排毒；而攻毒后第15天的唾液與糞便棉簽檢測全陰，說明6頭豬體內已無PEDV。

2.3 返飼病料與部分腹瀉樣品熒光定量PCR檢測結果

利用熒光定量PCR檢測技術，分別對返飼病料與攻毒后第3天6頭豬的腹瀉糞便進行檢測，其病毒檢測的CT值與拷貝數如表1所示。

2.4 血清抗體IgA、IgG檢測結果

將攻毒前后6頭豬所采集血清分別進行PED抗體檢測,并求出血清中IgA與IgG平均 OD值，結果見表2、圖3。由表2和圖3可見在攻毒后11 d豬血清中IgG抗體明顯上升,并在攻毒后第20天IgA與IgG檢測值均達到峰值。

3 分析與討論

國外豬場在發生PED時，通常采用返飼技術控制了疫情，例如美國在2013年暴發PED，就是采取返飼措施及時控制了疾病[7]，而國內豬場很少有成功利用返飼的案例，可能主要有2個方面原因的影響，一方面說明部分豬場在返飼的技術上缺乏正確的指導方案；另一方面暗示著部分豬場擔憂返飼的安全性。

目前國內雖有上市的PEDV弱毒疫苗，但是效果仍在觀察中，并且不能口服免疫，在這種情況下，返飼可作為一種選擇。國外也有學者研究PEDV的攻毒實驗，例如：在De Arriba ML PEDV接種試驗中，仔豬的腹瀉持續時間平均時間為1.7 d，持續排毒時間平均為5.4 d[8]。由于本試驗為了模擬寒冷的天氣，對攻毒豬采取了沖涼水與風扇降溫，從而使本試驗豬腹瀉時間比De Arriba M L接種PEDV的試驗豬要長，根據各個豬場飼養管理的不同,腹瀉持續時間不等,一般在腹瀉一周以內逐漸好轉[9]。臨床上在促進豬群同期感染后，還需采取適當措施避免腹瀉過度，例如對母豬返飼后，可通過加強隔離與消毒，改善環境溫度與控制飼喂量，以及在飼料中添加一些微生態制劑，可以縮短母豬腹瀉與排毒時間，并且同樣能達到返飼效果。

圖2 攻毒后6頭豬第3天的排泄物RT-PCR檢測結果

表1 檢測返飼病料與攻毒后第3天腹瀉糞便的病毒CT值與拷貝數

表2 攻毒前后血清抗體檢測平均OD值

圖3 表2中數據對應的矩形圖

由于試驗動物是育肥后期豬，每次沖水就有豬站立排糞，能清楚的記錄腹瀉時間與對應豬編號，使數據更加準確。雖然本試驗不能確定母豬攻毒后第幾天停止排毒，但是可以明確母豬在攻毒后臨床表現腹瀉癥狀時，就開始向外界排毒，并且在攻毒后15 d的唾液與糞便中無PEDV。然而臨床上攻毒15 d后，對攻毒豬仍然不能掉以輕心，在4 ℃ pH=5～9的條件下，PEDV可在污染的泥土中至少存活28 d[10]，由表1可知，返飼后第3天腹瀉糞便中病毒的拷貝數與返飼病料相當，說明豬舍環境中可能有大量病毒粒子的存在，為了防止PEDV在豬場的傳播，母豬在攻毒后需對豬只體表與豬舍加強消毒，及時處理腹瀉糞便，可以降低病毒感染其他豬群的風險。

由圖3可知﹕母豬在攻毒后抗體在11～30 d，血清中IgA與IgG的抗體滴度維持在較高的水平，結合試驗豬攻毒后第15天排泄物病原檢測結果。對于母豬的返飼工作，可在其妊娠期的84到99 d之間進行返飼，尤其是對于一些正在發生PED的豬場，可對所有處于產前15 ～30 d的妊娠母豬進行返飼，能夠及時地減少損失。這一觀點也與Olanratmanee E[11]得出的結果相符合，用7 201頭母豬在產前不同時期進行返飼，其中返飼對妊娠61～90 d母豬的流產率最低。

劉秋菊[6]用16頭60日齡左右的仔豬做攻毒試驗中，仔豬IgG抗體在攻毒后第16天達到最高，其檢測OD均值為1.0左右。根據圖3所示，在攻毒后第42天母豬的血清IgG抗體OD均值為0.98，盡管在PEDV防治措施中，主要靠腸道的黏膜免疫（IgA抗體），但初乳中若含有較高滴度的IgG抗體，對仔豬同樣具有保護作用[12]，由此推出：母豬在返飼后的第11～42天，初乳中的抗體對哺乳仔豬有一定的保護作用，為了延長返飼后抗體保護時間，可在返飼后30～42 d進行組織滅活苗的加強免疫。

在過去的十年里，泰國也推薦利用返飼來撲滅商業豬群暴發的PED[11]。返飼是一把雙刃刀，并不是所有場都適合返飼，必需在配合實驗室檢測的條件下，確定返飼病料中無豬瘟、偽狂犬與豬藍耳病病原，才可利用返飼控制PED在本場的流行。

[1] LI Z L,ZHU L, MA J Y, et al. Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) field strains in south China[J]. Virus genes, 2012, 45(1)﹕ 181-185.

[2] 簡義虎.胡仕鳳.李潤成,等.湖南省豬流行性腹瀉發病情況分析[J]. 豬業科學,2016,33,(11)﹕76-77.

[3] LANGEL S N,PAIM F C,LAGER K M,et al.Lactogenic Immunity and Vaccines for Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV)﹕ Historical And Current Concepts[J]. Virus research, 2016,226﹕93-107.

[4] LI Z L,ZHU L,MA J Y,et al. Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) field strains in south China[J]. Virus genes, 2012, 45(1)﹕ 181-185.

[5] 張田生.豬流行性腹瀉病毒SYBR Green Ⅰ和Taq-Man熒光定量PCR檢測方法的建立及應用[D] .南昌：江西農業大學,2015.

[6] 劉秋菊. 豬流行性腹瀉病毒IgG、IgA抗體檢測方法的建立及應用[D]. 長沙：湖南農業大學, 2016.

[7] 本刊編輯.加拿大豬流行性腹瀉生物安全控制的關鍵措施[J].豬業科學,2014,31(4)﹕29.

[8] DE ARRIBA M L, CARVAJAL A, POZO J, et al. Lymphoproliferative responses and protection in conventional piglets inoculated orally with virulent or attenuated porcine epidemic diarrhoea virus[J]. Journal of virological methods, 2002, 105(1)﹕ 37-47.

[9] WANG X, NIU B, YAN H, et al. Genetic properties of endemic Chinese porcine epidemic diarrhea virus strains isolated since 2010[J]. Archives of virology, 2013, 158(12)﹕ 2487-2494.

[10] JUNG K, SAIF L J. Porcine epidemic diarrhea virus infection﹕ Etiology, epidemiology, pathogenesis and immunoprophylaxis[J]. The Veterinary Journal, 2015, 204(2)﹕ 134-143.

[11] O L A N R A T M A N E E E, KUNAVONGKRIT A, TUMMARUK P.Impact of porcine epidemic diarrhea virus infection at different periods of pregnancy on subsequent reproductive performance in gilts and sows[J]. Animal reproduction science, 2010,122(1)﹕ 42-51.

[12] [美]齊默爾曼（Jeffrey J.Zimmerman）等主編，趙德明等主譯.豬病學[M].10版.北京：中國農業出版社，2014：531.

2017-03-03)

湖南省戰略性新興產業項目，編號2016GK4015

簡義虎(1989—)，男，河南信陽人，碩士研究生，1519780050@qq.com；

*通信作者：余興龍，男，教授，博導，研究方向：畜禽疫病防治，E-mail: 1364263406@qq.com