育肥豬真桿菌的分離與鑒定

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，合肥 230036）

育肥豬真桿菌的分離與鑒定

張乃嘉，胡 楨，吳華鍵，李 郁*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，合肥 230036）

本試驗(yàn)系對自安徽某豬場發(fā)病育肥豬膿腫脾臟中分離的一株細(xì)菌，通過形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)檢查，致病性和藥物敏感性試驗(yàn)，以及16SrRNA基因的擴(kuò)增和序列分析進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，分離菌為革蘭氏陽性短桿狀菌，在兔血瓊脂平板和牛血清胰蛋白胨大豆瓊脂平板有氧條件下生長良好，可致小鼠死亡，對頭孢類抗生素和喹諾酮類抗菌藥敏感，16SrRNA基因序列與豬真桿菌屬細(xì)菌的同源性最高，在91.2%～99.4%之間，遺傳進(jìn)化關(guān)系密切，與豬真桿菌屬細(xì)菌屬于同一分類群。結(jié)果表明，分離菌為豬真桿菌。

豬真桿菌；分離培養(yǎng)；生化反應(yīng)；16SrRNA；鑒定

棒狀桿菌屬(Corynebacterium)菌廣泛分布于自然界，多數(shù)為非病原菌，只有少數(shù)有病原性，能引起人和動物的急性和慢性傳染病。由于棒狀桿菌的種類不同，各種動物和人的臨診表現(xiàn)也不完全相同，但一般以某些組織和器官發(fā)生化膿或干酪樣的病理變化為特征。

豬棒狀桿菌病是由豬棒狀桿菌（Corynebacterium suis），現(xiàn)歸入真桿菌屬（Genus Eubacterium ）改稱豬真桿菌（Eubacterium suis）引起的疾病，主要引起豬的膀胱炎和腎盂腎炎，有的還引起豬的化膿性肺炎、支氣管炎、子宮內(nèi)膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、仔豬臍炎、皮下膿腫和乳腺膿腫等。豬真桿菌病遍布于世界各國，一年四季均可發(fā)生，雖然發(fā)病率較低，只引起小規(guī)模和個別的豬發(fā)病，但病原菌卻可在任何豬群中存在、也可在豬體各部位廣泛存在。我國也有該病的發(fā)生，但相關(guān)的報(bào)道甚少。

2016年7月，安徽某豬場150～160日齡的育肥豬發(fā)病，臨診表現(xiàn)為腹部皮膚發(fā)紺，體溫高達(dá)41 ℃，有呼吸道癥狀，排黃色稀便，并伴有血尿癥，發(fā)病率為10%，病死率達(dá)30%。剖解后可見心臟出血，心內(nèi)膜潮紅，肺臟出血，脾臟腫大呈深褐色，肝臟有出血點(diǎn)，腎臟腫大呈暗紅色，被膜下有細(xì)小的黃白色化膿灶，腸壁出血，全身淋巴結(jié)腫大出血，膀胱壁增厚。通過對病原的分離鑒定和致病性試驗(yàn)，確定該豬場有豬真桿菌感染，并根據(jù)藥敏試驗(yàn)篩選出敏感藥物，試驗(yàn)結(jié)果不僅為豬真桿菌感染的流行病學(xué)調(diào)查，而且為豬場防治豬真桿菌病菌提供了重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

采自安徽某豬場病死育肥豬（150～160日齡）的內(nèi)臟器官。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

營養(yǎng)瓊脂、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)購于紹興天恒生物科技有限公司，用于配制5%兔鮮血瓊脂平板、5%牛血清TSA平板和添加0.5%瓊脂的TSB半固體培養(yǎng)基；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MAC）、鼠李糖、半乳糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、乳糖、棉籽糖、枸櫞酸鹽、硫化氫、尿素、七葉苷、靛基質(zhì)、硝酸還原、VP-MR、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、苯丙氨酸脫氨酶生化發(fā)酵管、抗生素藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司；小牛血清購自杭州四季青有限公司；DNA Marker DL2000、2×Taq plus PCR MasterMix、細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、瓊脂糖均購自天根生化科技有限公司；DNA膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司。

1.3 試驗(yàn)動物

清潔級18～22 g雌性昆明小鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.4 細(xì)菌的分離純化

無菌采集病死豬的肝臟、肺臟、脾臟、腎臟組織，分別劃線接種于兔血瓊脂平板和TSA平板（加5%血清），37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落性狀。挑取可疑菌落，進(jìn)行純化培養(yǎng)，并接種普通營養(yǎng)瓊脂平板、EMB、MAC、TSA平板（不加血清）、TSB肉湯（加5%血清）和TSB肉湯（不加血清）中，進(jìn)行培養(yǎng)特性鑒定。取純培養(yǎng)物涂片、革蘭氏染色、芽孢染色、鏡檢，挑取單菌落垂直穿刺接種TSB半固體培養(yǎng)基，觀察細(xì)菌形態(tài)特征。

1.5 生化鑒定

將分離純化的細(xì)菌接種到含5%小牛血清的TSB中，37 ℃培養(yǎng)18～20 h，取菌液接種微量生化反應(yīng)管，于37 ℃培養(yǎng)24～96 h，觀察記錄結(jié)果。

1.6 致病性試驗(yàn)

將分離純化的細(xì)菌用TSB肉湯（加5%血清）增菌培養(yǎng)24 h，取0.5 mL腹腔注射小鼠5只為試驗(yàn)組，另取5只小鼠腹腔注射等量TSB（加5%血清）為對照組。在適宜條件下隔離飼養(yǎng)，觀察小鼠發(fā)病及死亡情況。無菌采集對照組小鼠和病死小鼠肝臟、肺臟、脾臟、腎臟組織，分別劃線接種兔血瓊脂平板和TSA平板（加5%血清），于37 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行細(xì)菌分離，并將新分離的細(xì)菌進(jìn)行PCR檢測和測序比對。

1.7 分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)細(xì)菌16SrRNA通用引物合成擴(kuò)增引物。上游引物P1﹕5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'；下游引物P 2﹕5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA－3'。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度約為1 500 bp。

表1 25株豬真桿菌參考菌株的名稱與來源

表2 分離菌的生化鑒定結(jié)果

將分離純化細(xì)菌按照試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提取，進(jìn)行16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：總體積25μL，包括12.5μL 2×Taq plus PCR MasterMix，上下游引物(20μmol/L)各1μL，5μL模板DNA，5.5μL ddH2O。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃1 min，56 ℃1 min，72 ℃2 min，共35次循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。

反應(yīng)結(jié)束后，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，在紫外燈下觀察，用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。切膠回收陽性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。將測定的序列結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站中BLAST界面，與其基因庫中所有序列進(jìn)行相似性比對，再應(yīng)用DNAStar軟件中的MegAlign程序與GenBank登錄的豬真桿菌屬中25個不同種的菌株（表1）的16SrRNA基因序列進(jìn)行比對和同源性分析并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

1.8 藥物敏感試驗(yàn)

選用臨床上常用的頭孢類（頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢拉定、頭孢唑林、頭孢氨芐、頭孢噻肟）、氨基糖苷類（丁胺卡那、新霉素、卡那霉素、大觀霉素）、喹諾酮類（氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星）、青霉素類（氨芐西林、青霉素）、磺胺類（甲氧氨芐嘧啶、復(fù)方新諾明）和林可胺類（林可霉素）等21種抗生素藥物，采用紙片瓊脂擴(kuò)散法，對分離純化的細(xì)菌進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(CLSI/ NCCLS)2010版執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離純化

在兔血瓊脂平板和TSA平板（加5%血清）上，自病豬脾臟組織分離獲得一株細(xì)菌。

2.2 分離菌的培養(yǎng)特性

分離菌在兔血瓊脂平板和TSA平板（加5%血清）上形成滴露樣黃色細(xì)小菌落，光滑、圓潤、半透明，不完全溶血；在加血清的TSB中培養(yǎng)的細(xì)菌生長良好，呈均勻渾濁，無沉淀和菌膜形成；在普通營養(yǎng)瓊脂、不加血清的TSA和TSB、EMB、MAC上不生長。顯示該分離菌的生長需要血液或血清。

2.3 分離菌的形態(tài)特性

分離菌革蘭染色陽性，形態(tài)多樣，菌體直或微彎，大多為一端或兩端膨大的桿狀，單在或成柵狀或成叢排列，無芽胞，無鞭毛，不運(yùn)動。

2.4 分離菌的生化特性

生化試驗(yàn)結(jié)果表明，此分離菌能發(fā)酵蔗糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖;不能發(fā)酵棉籽糖、蕈糖、阿拉伯糖、乳糖、甘露糖、鼠李糖;靛基質(zhì)試驗(yàn)、硫化氫、硝酸鹽還原、M R－VP試驗(yàn)為陰性、不能與尿素、馬尿酸、七葉苷發(fā)生反應(yīng);不能利用枸櫞酸鈉;接觸酶陰性。見表2。

2.5 分離菌的致病性鑒定

試驗(yàn)組小鼠在攻毒14 h左右開始出現(xiàn)精神萎靡、行動遲緩并伴有腹式呼吸的癥狀，其中4只小鼠于30 h內(nèi)死亡，1只存活；對照組小鼠均健活。剖檢小鼠分離細(xì)菌，對照組各內(nèi)臟器官均沒有細(xì)菌生長，試驗(yàn)組自肝臟組織中獲得細(xì)菌，經(jīng)PCR檢測及測序比對，證實(shí)分離菌為試驗(yàn)攻毒菌。

2.6 16SrRNA基因的擴(kuò)增及基因同源性分析

以提取的分離菌基因組為模板，用16SrRNA上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出一條約1 500 bp的條帶，見圖1。

同源性分析結(jié)果顯示，分離菌與25株豬真桿菌參考菌株的同源性在91.2%～99.4%之間（表3），與C.amycolatum CIP103452同源性達(dá)99.4%；在建立的遺傳進(jìn)化樹中，分離株與25株豬真桿菌參考菌株位于同一大的分支上，其中與C.amycolatum CIP103452位于同一個小分支上，遺傳關(guān)系最為親密（圖2）；確定本次分離菌為豬真桿菌，并命名為FN株。

2.7 分離菌的藥物敏感性

圖1 分離菌株 PCR產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果

表3 16SrRNA基因序列同源性分析%

圖2 基于16Sr R NA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

分離菌對丁胺卡那、頭孢曲松、頭孢呋辛、氨芐西林、氧氟沙星、頭孢拉定、頭孢唑啉、頭孢氨芐、恩諾沙星、頭孢噻肟等10種藥物敏感；對青霉素、環(huán)丙沙星、新霉素等3種藥物中度敏感；對卡那霉素、林可霉素、大觀霉素、甲氧氨芐嘧啶、復(fù)方新諾明等其他8種藥物均耐藥。

3 討論

棒狀桿菌廣泛分布于動物機(jī)體、環(huán)境、水體和食品等中，屬于條件致病性病原菌。報(bào)道顯示，多種醫(yī)學(xué)相關(guān)的棒狀桿菌都是人類皮膚常在菌群之一，其中部分棒狀桿菌具有廣泛的耐藥性，并且能引起嚴(yán)重的乃至致命性疾病，尤其對免疫抑制的病人危害更重。因此，對棒狀桿菌致病性的研究越來越引起廣泛關(guān)注[1]。豬棒狀桿菌即豬真桿菌是定殖于上呼吸道、生殖道的常在菌，約有80%健康豬正常帶菌，正常情況下并不會引起豬體發(fā)病，但在母豬生產(chǎn)時，由于胎兒的擠壓或人工助產(chǎn)則易導(dǎo)致生殖道黏膜損傷，定殖的豬真桿菌即可在受損黏膜處大量繁殖并分泌毒素從而引發(fā)炎癥。所以引起豬的真桿菌病主要集中在生殖道和呼吸道，由這些部位分離到真桿菌均有相關(guān)報(bào)道[1-3]，而從其他部位分離到豬真桿菌的則尚未見報(bào)道。此外當(dāng)機(jī)體抵抗力下降，或感染豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）等免疫抑制性疾病病原，或黏膜損傷后，也容易繼發(fā)感染細(xì)菌。棒狀桿菌能引起犢牛、綿羊、波爾山羊、廣西黑山羊、豬、柴達(dá)木雙峰駝、林麝、鼠等多種動物發(fā)病，導(dǎo)致發(fā)病動物肺臟大面積肉變并形成化膿結(jié)節(jié)灶，肺門淋巴結(jié)水腫，脾臟表面有出血點(diǎn)，肝臟腫大，腎臟表面大量出血[4-7]。

本試驗(yàn)針對安徽某豬場150～160日齡育肥豬出現(xiàn)的病情，首先進(jìn)行發(fā)病情況的了解、臨診癥狀和病理變化的觀察，然后采取病料組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、相關(guān)病毒檢測，利用形態(tài)與染色、培養(yǎng)與生化特性、動物致病性試驗(yàn)等常規(guī)病原菌鑒定方法，最終通過16SrRNA基因的擴(kuò)增及基因同源性分析，確定該發(fā)病育肥豬的病原菌為豬真桿菌，尤其值得關(guān)注的是病原分離菌源自脾臟組織。傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法項(xiàng)目繁多且持續(xù)周期長，常不能滿足獸醫(yī)臨床對疾病診斷和病原鑒定的快速需求，而PCR技術(shù)則因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便、快速的特點(diǎn)得到了廣泛應(yīng)用。16SrRNA基因是細(xì)菌上編碼rRNA相對應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的基因組中，其保守區(qū)能反映生物物種的親緣關(guān)系，可變區(qū)具有揭示生物物種的核酸序列特征。目前16SrRNA序列分析是對細(xì)菌進(jìn)行分類學(xué)研究中較精確的一種技術(shù)，16SrRNA基因檢測技術(shù)已成為病原菌檢測和鑒定的一種強(qiáng)有力工具。

篩選出丁胺卡那、頭孢曲松、頭孢呋辛、氨芐西林、氧氟沙星、頭孢拉定、頭孢唑啉、頭孢氨芐、恩諾沙星、頭孢噻肟等10種抗菌藥物，可作為本次育肥豬真桿菌感染的首選治療藥物，可見該分離菌主要對頭孢類和喹諾酮類敏感，這與已報(bào)道的廣西株（1999年）[2]、四川SCYAN1株（2010年）[5]、廣西GX-A株（2016年）[8]等的藥敏結(jié)果不完全一致，顯示出時間上和地域性差異。不同地區(qū)、不同養(yǎng)豬場，即使同一養(yǎng)豬場在不同的時間，其用藥方法都會存在一定的區(qū)別，從而導(dǎo)致豬真桿菌分離菌對藥物敏感性的不同。此外，已有報(bào)道，一些地區(qū)雖然根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果篩選出多種高敏的抗豬真桿菌藥物，但對感染后期患豬的治療效果卻不佳，原因是豬真桿菌在感染部位形成了厚包囊，導(dǎo)致藥物不能進(jìn)入抑制或殺滅細(xì)菌。因此，對于豬真桿菌感染的防治，一是要早治療，二是要對尚未出現(xiàn)癥狀的豬群進(jìn)行藥物預(yù)防，才能達(dá)到有效的防治效果。通過病因確定、防治方案制定與實(shí)施，安徽某豬場育肥豬群的病情得到了有效控制并轉(zhuǎn)歸。

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2017-03-15）

國家星火計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2014GA710002)；安徽省質(zhì)量工程項(xiàng)目(2013sxzx008)；安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(XJ2015093)；安徽省生豬產(chǎn)業(yè)體系基金

張乃嘉(1991-), 女，山東煙臺人，碩士研究生，主要從事動物傳染病學(xué)研究

*通信作者：E-mail：liyouer@163.com