豬病毒性腹瀉的診斷和檢測技術研究

（華南農業大學獸醫學院，廣州 510640）

診斷與檢測

豬病毒性腹瀉的診斷和檢測技術研究

蘇丹萍，王 飛，賀東生

（華南農業大學獸醫學院，廣州 510640）

豬病毒性腹瀉類疾病是豬場常見疾病，目前已成為危害養豬業最大的一類疾病之一。腹瀉一般有明顯的季節性，尤其在秋冬、冬春換季，天氣驟變時易發且流行速度快。主要通過消化道及呼吸道進行感染，隨后誘發全群豬腹瀉。幾種病原混合感染比較常見，各年齡段的豬均可發病，發病后的死亡率與年齡密切相關，日齡越小，病程越短，死亡率越高，其對我國的養殖業造成了巨大的經濟損失,嚴重影響經濟效益。本文介紹該類疾病的可能病因、鑒別診斷方法和分子生物學檢測技術。

病毒性腹瀉 ；鑒別診斷；檢測技術

豬病毒性腹瀉的病原目前主要有豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬丁型冠狀病毒（PDCoV）、豬輪狀病毒（RV）、豬博卡病毒（PBoV）等，均可導致豬發病，以嘔吐、腹瀉、脫水為主要特征，仔豬的發病率和死亡率可高達50%～100%。另外豬的偽狂犬病毒（Pseudorabies，PRV）、圓環病毒、大腸桿菌和溫和型豬瘟病毒（classical swine fever，CSFV）也可以引起仔豬腹瀉，這需要我們逐一細致地分析病因，通過流行病學、臨床診斷和實驗室檢測進行綜合診斷。

1 病毒性腹瀉的臨床診斷

從臨床診斷上看，PEDV、TGEV、PDCov、RV、PBoV的癥狀比較相似，難以區分。但是PRV和CSFV與另外幾種病毒性腹瀉存在一定的區別。

1.1 PEDV、TGEV、PDCov

這3種疾病的病原都屬于冠狀病毒科，病毒特性、病豬發病特點、臨床癥狀和病理變化非常相似：1至3日齡發病，一周內病死或淘汰率可達到100%。乳豬和小豬嚴重腹瀉、水樣拉稀，部分豬有嘔吐，吃奶后發病更嚴重。部分中大豬和母豬嘔吐和腹瀉，但死亡率不高。病變一般只集中在胃腸道，胃腸黏膜菲薄、充血，腸系膜淋巴結充血。PDCov引發的病例不多，但是在國外和國內都有單純由該病毒引起的腹瀉大暴發的病例報道。

1.2 豬偽狂犬病

感染偽狂犬病毒的發病豬會整窩發病和死亡，表現為突然發病，體溫上升達41 ℃以上，精神極度委頓，發抖，運動不協調，痙攣，嘔吐，腹瀉。表現出明顯的神經癥狀、昏睡、嗚叫、嘔吐、腹瀉，一旦發病，1～2 d內死亡。剖檢主要癥狀是腎臟布滿針尖樣出血點，其他肉眼病變不明顯。中樞神經系統癥狀明顯時，腦膜明顯充血，腦脊髓液量過多，肝、脾等實質臟器常可見灰白色壞死病灶，肺充血、水腫和壞死點。

1.3 溫和型豬瘟

感染溫和型豬瘟病毒的仔豬會先后出現以下癥狀：體溫升高達41 ℃，仔豬常伴有厭食、腹瀉，眼結膜潮紅發炎，皮膚發炎，共濟失調，甚至后軀麻痹，糞便由褐色變黃色，后期肛門失禁，糞便沿著后腿淌下，惡臭異常。病豬迅速消瘦，腹下部及耳根皮膚呈紫紅色淤血。病豬體溫保持在40 ℃左右，癥狀時輕時重，食欲時好時壞，糞便時干時稀。病程長者皮膚出現淤血斑和壞死塊，以腹下部為常見。有時也出現紫耳朵、干尾巴、紫斑蹄。病豬的皮膚一旦破損或扎針后，局部淌血不止，血液凝固不良，也是該病的特征之一。

圖1 暴發PED的病豬

圖2 豬病毒性腹瀉的現場剖檢

圖3 豬病毒性腹瀉的病變

溫和型豬瘟的病理變化主要特征性病變是胃黏膜大面積脫落、充血，腎臟不腫大，呈土黃色，可見大小不等的出血點，以針尖大小居多，脾臟腫大，色暗，表面散在有米粒大小的紫紅色突起，質地較軟，邊緣有壞死灶，個別呈點狀出血，淋巴結腫脹、水腫或出血、重者出現化膿、壞死、潰瘍等病變，血液稀薄如水，流在地面上很少凝固，其他臟器病理變化不大。部分豬出現咽峽、軟腭處和扁桃腺有白色壞死點、出血或潰瘍，大腸回盲瓣可見鈕扣狀潰瘍。膽腫大，其邊緣出血，呈暗紅色。

2 病毒性腹瀉的生物學檢測技術

豬被PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV、PBoV感染后，都會出現嘔吐和水樣腹瀉，致使發病豬脫水、生長不良、體重減輕，死淘率高達 90%以上。剖檢病變主要在小腸，可以發現腸壁變薄并且呈半透明狀，彈性不足，黏膜充血，腸管內含大量液體，腸系膜淋巴結有水腫、充血等病變。胃內充滿著白黃色的固體乳狀物，胃黏膜充血。排出的稀糞中會含有沒有完全消化的白黃色凝乳塊，具有腥臭氣味。

臨床上很難鑒別這幾種病毒病，所以鑒定需要進行實驗室相關的分子生物學技術進行鑒別診斷，通常有以下幾種檢測方法：

2.1 RT-PCR

PCR技術以其快速、敏感、易于操作等優點在近年來被廣泛應用。根據 Genbank中選定病毒的一個基因保守區域基因序列設計引物，合成特異引物，然后從感染病毒的糞便或腸道組織中提取總RNA，以此總RNA 為模板，用下游特異引物將RNA 反轉錄為cDNA，然后在2個特異引物存在的情況下用Taq DNA 聚合酶進行擴增，合成特異的雙鏈DNA 目的片段。對擴增的DNA片段用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，然后進行測序分析，從而對患病動物進行確診。PCR能同時檢測大批量的樣品，并且能進行活體檢測，適合于臨診診斷。

2.2 實時熒光定量PCR方法

實時熒光定量PCR方法是在PCR技術基礎上發展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術，融匯了傳統技術靈敏、快速、特異的特點及光譜技術高敏感性和高精確定量的優點，具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優點。根據病毒設計特異性引物和Taqman探針，采取含病毒多的發病豬的器官組織部位，建立Taqman實時定量RT-PCR檢測病毒的方法。不僅適合病毒的臨床樣品的早期檢測，也適用于疫苗生產過程中的質量控制及疫苗制品的效價評估。

2.3 酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）診斷方法具有敏感性和特異性強、操作簡單、檢測快速、高通量、無輻射、價格低廉等特點，是當前動物傳染病檢疫、流行病學調查等廣泛采用的免疫學診斷技術，可用于規模化豬場大批樣品的抗體檢測。抗原：應用推薦的毒株的病毒或相應蛋白制備。用于制備抗原的細胞應沒有任何其他腹瀉病毒感染。抗血清：用于競爭或阻斷試驗的多克隆抗血清可通過試驗推薦的毒株來制備，單克隆抗體則可采用相應的病毒免疫顯性蛋白直接法制備。間接法采用的抗豬免疫球蛋白試劑應能檢測到豬IgG和IgM。根據ELISA 的基本原理，發展出了間接ELISA、Dot- ELISA、微波快速ELISA、競爭ELISA 以及抗原捕獲ELISA。

2.4 免疫熒光法

采取病豬的腸道或其他組織，做成冷凍切片，進行直接免疫熒光法檢測抗原。這個方法是活體診斷，可以迅速做出判斷。或者利用已研制的抗病毒蛋白的單克隆抗體，采用間接免疫熒光試驗對接種病毒的細胞培養物進行了病原檢測，并與全病毒制備的抗血清進行比較，以評價抗病毒蛋白單克隆抗體快速檢測的潛在應用價值。

2.5 免疫電鏡法

這幾種腹瀉冠狀病毒，形狀非常相似，在普通電鏡下無法區別，為此需用免疫電鏡法(IEM)。同時免疫電鏡在進行臨床樣品或細胞培養樣品中病毒的血清學鑒定上顯示出了更大的優勢。利用A蛋白和抗病毒的特異性血清包被電鏡網格而制作的固相免疫電鏡檢查法，能提高檢測的靈敏度，其效力至少提高100倍。此方法不單可用于發病時的診斷，也可以用于發病的潛伏期診斷。

2.6 環介導等溫核酸擴增技術

環介導等溫核酸擴增技術（LAMP）是一種新型的核酸擴增技術，依賴4條特異設計的引物和一條具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。不需要模板的熱變性、長時間溫度循環、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程。近年來該法被廣泛應用于病原體的檢測。LAMP檢測試劑盒不需要先進的儀器，并且具有特異性強、敏感度高、檢測周期短、操作簡便以及易于推廣等優點。不過LAMP也有缺點，就是因為靈敏度高，一旦開蓋容易形成氣溶膠污染，加上目前國內大多數實驗室不能嚴格分區，因此需要避免假陽性的問題。

3 總結

雖然當前出現腹瀉癥狀的疾病種類相對較多，但在全國范圍內，以流行性腹瀉（PED）為主的病毒性腹瀉危害最為嚴重，且自2010年以來疫情持續不斷。各種病毒性腹瀉病的臨床癥狀和解剖病變十分相似，給臨床快速診斷帶來不少困難。為了及時對癥防控和治療，減少經濟損失，需要及時正確采取病料送至實驗室做相關的實驗室確診。同時，在日常的豬場管理中，注意生物安全防控，控制產房的溫度和濕度，做好產房的全進全出措施，并注重消毒空欄，切斷一切可能的傳染源，才能更好地控制該病。免疫防控時一定要選用高質量的腹瀉疫苗，最好選用高抗原含量的變異株PED+TGE疫苗。

2017-04-28）

賀東生，教授、博士生導師，傳染病研究方向。479905817@qq.com