黑小麥功能性低聚糖的分離與組成分析

孫元琳 儀 鑫 李云龍 陜 方 陳樹俊

(運城學院生命科學系1 ，運城 044000)(山西大學生命科學學院2 ，太原 030006)(山西省農科院農產品綜合利用研究所3，太原 030031)

黑小麥功能性低聚糖的分離與組成分析

孫元琳1儀 鑫2李云龍3陜 方3陳樹俊2

(運城學院生命科學系1，運城 044000)(山西大學生命科學學院2，太原 030006)(山西省農科院農產品綜合利用研究所3，太原 030031)

研究黑小麥麩皮功能性低聚糖的分離制備方法，并對其組成進行分析。采用木聚糖酶酶解黑小麥麩皮不溶性膳食纖維，所得酶解液經活性炭柱層析進行分離，并利用液相色譜和離子色譜對分離組分的單糖組成、低聚糖組成以及阿魏?；鶊F進行檢測。結果表明，活性炭柱層析的水洗組分(WO)、不同濃度醇洗組分(EO)的低聚糖均主要由阿拉伯糖和木糖組成，為阿拉伯低聚木糖。其中，WO含有結合態阿魏酸，為阿魏酰低聚糖。WO的低聚糖聚合度較高，為DP 4～7；醇洗組分EO的低聚糖聚合度較低，為DP 2～4。

黑小麥 阿魏酰低聚糖 阿拉伯低聚木糖 活性炭柱層析

黑小麥麩皮是黑小麥加工的主要副產物，其膳食纖維含量豐富，主要為阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖和纖維素等。黑小麥麩皮中還含有豐富的酚酸物質，如阿魏酸、芥子酸、香草酸等，其中阿魏酸的含量高于普通小麥麩皮中阿魏酸的含量[1]。利用木聚糖酶對麩皮不溶性膳食纖維進行可控性酶解，可作用于阿拉伯木聚糖鏈的β-1,4糖苷鍵，從而釋放出阿魏酰低聚糖和阿拉伯低聚木糖[2]。

阿魏酰低聚糖和阿拉伯低聚木糖都屬于功能性低聚糖，二者的主要區別在于，阿魏酰低聚糖還含有結合態阿魏酸。即在阿拉伯低聚木糖的基礎上，其側鏈阿拉伯糖基通過酯鍵與阿魏酸相連。低聚木糖是一種非消化性低聚糖，可直達大腸，能夠增殖雙歧桿菌，是一種有效的雙歧因子；阿魏酸具有降血脂、抗血栓、抗菌消炎等功能[3]，也是一種有效的抗氧化劑，其衍生物糖酯具有更強的抗氧化活性[4]。阿魏酰低聚糖兼具阿魏酸和低聚木糖的功能特性，且因結構中特殊的酯鍵，增加了阿魏酸的水溶性，更有利于發揮其抗氧化作用，同時具有增殖有益菌、調節腸道菌群的作用[5]。

目前，低聚糖多采用凝膠柱層析技術，利用分子體積排阻原理將低聚糖按相對分子質量的不同進行分離，常使用的凝膠有Sephadex LH-20、Bio-Gel P-2[6]。阿魏酸糖酯的分離純化普遍采用非極性大孔吸附樹脂，如Amberlite XAD-2、Amberlite XAD-8 HP等[7]。這類樹脂通過范德華力作用有效吸附酚酸類化合物，將含有苯環的阿魏酸糖酯與低聚糖進行分離。

活性炭作為一種非極性吸附劑，也可用于低聚糖的分離。從20世紀50年代，科學家開始進行活性炭層析吸附糖類的研究，Whistler等[8]研究得出聚合度高的糖需要更高濃度乙醇進行洗脫。石波等[9]也利用活性炭柱層析分離得到低聚木糖單一組分，但鮮有利用活性炭柱層析分離阿魏酸糖酯與低聚糖的相關報道。本試驗利用活性炭對阿魏酰低聚糖和阿拉伯低聚木糖吸附力的不同，以及不同洗脫液對阿魏酰低聚糖和阿拉伯低聚木糖解析能力的不同，將二者進行有效分離，從而實現從一種黑小麥資源中同時制備得到2種不同組成的高附加值益生元產品，為黑小麥特色谷物資源的有效增殖和綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑小麥麩皮：山西省農科院棉花研究所；木聚糖酶(EC3.2.1.8，酶活60 000 U/mg)：德國Ruibio公司；標準木糖、阿拉伯糖、阿魏酸：Sigma公司；標準低聚木糖(DP 2～7)：山東龍力生物科技有限公司；活性炭：天津市瑞金特化學品有限公司；50%氫氧化鈉溶液：Sigma-Alorich公司；醋酸鈉(固體)、氫氧化鉀：美國Thermo Fisher Scientific公司；甲醇、冰乙酸、異丙醇(色譜純)：天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

BS-100A型自動部分收集、DHL-A型電腦恒流泵：上海滬西分析儀器廠；LC1200型高效液相色譜儀、Cary5000紫外-可見-近紅外分光光度計：美國Agilent公司；ICS-5000型離子色譜儀：美國Dionex公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑小麥阿魏酰低聚糖及阿拉伯低聚木糖酶解液的制備

將黑小麥麩皮粉碎，稱取800 g粉碎后的麩皮，在121 ℃下進行高壓蒸汽處理45 min。將處理過的黑小麥麩皮懸浮于6 000 mL水中，加入耐溫α淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶以去除淀粉和蛋白質，高溫滅酶后，離心(3 000 r/min，15 min)，棄去上清液，沉淀依次用熱蒸餾水、無水乙醇洗滌，棄去上清液，將沉淀真空干燥，得到黑小麥麩皮不溶性膳食纖維[10]。稱取10 g不溶性膳食纖維，加入200 mL pH 4.8醋酸-醋酸鈉緩沖溶液以及3.1 mg木聚糖酶，在46 ℃下酶解22 h。酶解結束后于沸水浴中滅酶10 min，加入3倍體積的無水乙醇，靜置過夜，于3 000 r/min離心15 min，得到富含阿魏酰低聚糖和阿拉伯低聚木糖的酶解液。

1.3.2 活性炭柱層析

將酶解液均勻地加在已平衡好的活性炭柱(2.6 cm×30 cm)層析，依次用蒸餾水、10%、20%、40%、60%、80%乙醇為洗脫液進行洗脫，洗脫速度為1.5 mL/min，每管4 mL分部收集，逐管檢測糖含量(苯酚-硫酸法A480 nm)，繪制洗脫曲線。分別收集水洗及不同濃度醇洗組分。

1.3.3 薄層層析

分別將木糖、低聚木糖標準品、洗脫組分用微量進樣器進行點樣，然后放于充滿展開劑蒸氣的層析缸中，采用上行法進行展開，展開結束后用噴霧器將顯色劑均勻噴灑在薄層板上，于105 ℃下顯色10 min。展開劑：V乙酸乙酯∶V甲醇∶V蒸餾水∶V氨水=5∶9∶1∶1.5；顯色劑：苯胺-二苯胺-磷酸[11]。

1.3.4 低聚糖組成分析

離子色譜條件：采用CarboPac PA200色譜柱，檢測器為安培檢測器，柱溫30 ℃，150 mmol/L NaOH等度洗脫，流速為0.4 mL/min，進樣量25 μL。樣品與標準品(阿拉伯糖、木糖、低聚木糖)進樣前用0.45 μm的微孔濾膜過濾。

1.3.5 單糖組成分析

稱取低聚糖樣品3～5 mg，水洗組分及不同濃度醇洗合并組分分別溶于2 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，在100 ℃下水解2 h，除盡過量的三氟乙酸，定容至30 mL[11]，進樣離子色譜。根據出峰時間判斷單糖種類，根據峰面積的比值確定各單糖間的比例關系。色譜條件：色譜柱為CarboPac PA20柱，檢測器為安培檢測器，柱溫30 ℃，10 mmol/L KOH等度洗脫，流速為0.4 mL/min，進樣量25 μL，樣品與標準品(阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖)進樣前用0.45 μm的微孔濾膜過濾。

1.3.6 紫外掃描

分別將標準品阿魏酸與樣品(水洗組分及醇洗合并組分)溶于100 mmol/L pH 6.0的MOPS緩沖液中，進行紫外光譜掃描，掃描波長范圍為190～400 nm。

1.3.7 阿魏?；鶊F的檢測

用乙酸乙酯萃取洗脫液，重復萃取3次，合并有機相，揮干其中的有機溶劑后，用1 mL甲醇復溶，此樣品為洗脫液中的游離態阿魏酸。萃取后的水相用2 mol/L NaOH酯解后，用6 mol/L HCl調節pH至2.0，濃縮后用乙酸乙酯重復萃取3次，合并有機相，揮干有機溶劑，用1 mL甲醇復溶，此樣品為結合態阿魏酸[3]。將游離態和結合態阿魏酸樣品進行HPLC測定。

色譜條件：C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為甲醇-2%乙酸；梯度洗脫：0～10 min 0.5%→5.0%，10～20 min 5.0%→20.0%，20～40 min 20.0%→50.0%，40～48 min 50.0%→80.0%，48～55 min 80.0%→0.5%；柱溫為室溫；流速1.0 mL/min；檢測波長320 nm；進樣量20 μL。

2 結果與分析

2.1 活性炭柱層析洗脫曲線

不溶性膳食纖維酶解液的活性炭柱層析洗脫曲線見圖1。用蒸餾水、10%、20%、40%、60%、80%乙醇進行洗脫，可以得到6個洗脫峰。收集單一峰組分并濃縮，對其進行薄層層析、低聚糖組成分析、單糖組成分析、紫外全波長掃描及阿魏酰基團檢測。

圖1 酶解液的活性炭柱層析洗脫曲線

2.2 薄層層析

圖2為活性炭柱層析各洗脫組分的薄層層析結果。酶解液含有聚合度為DP 2～7的低聚糖，也含有部分聚合度大于7的低聚糖；酶解液經活性炭柱層析所得到水洗組分中低聚糖的聚合度較高，而不同濃度醇洗組分中低聚糖的聚合度較低。其中，EO-10和EO-20的低聚糖主要由DP 2和DP 3組成，EO-40、EO-60及EO-80的低聚糖除了DP 2和DP 3外，還含有DP 4、DP 5以及聚合度更高的低聚糖。水洗組分及不同濃度醇洗組分低聚糖的聚合度的不同，是由于在水溶液中，活性炭的吸附低聚糖的能力最強，此時水洗脫得到的是不能被活性炭吸附的低聚糖；在以乙醇溶液為洗脫劑時，可以將活性炭吸附的低聚糖洗脫下來，是因為活性炭的吸附能力隨著在乙醇溶液中會減弱，且吸附能力隨著乙醇濃度的升高而減弱，也就是說隨著乙醇濃度的升高，其洗脫能力隨之增強，將聚合度大的低聚糖洗脫下來的能力也增強，因此在40%、60%、80%的乙醇洗脫組分中高聚合度低聚糖的含量高于10%、20%乙醇洗脫組分。

注：1 木糖，2 低聚木糖(DP 2～7)，3 酶解液，4 WO，5 EO-10，6 EO-20，7 EO-4O，8 EO-60，9 EO-80。圖2 活性炭柱層析各洗脫組分的薄層層析圖譜

2.3 低聚糖組成分析

采用離子色譜對活性炭柱層析洗脫組分的低聚糖組成進行分析，其中水洗組分WO和60%醇洗組分EO-60的離子色譜如圖3所示。WO中低聚糖的聚合度較大(DP 4～7)，而不同濃度乙醇洗脫組分中低聚糖的聚合度較低(DP 2～4)，此結果與薄層層析結果一致。各洗脫組分中低聚糖的含量如表1所示。由表1可以看出，WO中低聚糖的聚合度主要為DP 4、DP 5和DP 7；醇洗組分中木糖質量分數隨著乙醇濃度的升高而逐漸降低，分別由33.94%降至2.71%，至EO-80中已不含木糖。而DP 2、DP 3、DP 4的含量均隨著乙醇濃度的升高而相對增加。其中，DP 2質量分數升至77.53%后有小幅降低，主要是由于其他組分DP 3、DP 4的含量在升高。

圖3 活性炭柱層析水洗組分(WO)與60%醇洗組分(EO-60)的低聚糖離子色譜圖

表1 活性炭柱層析洗脫組分的低聚糖組成/%

2.4 單糖組成分析

采用離子色譜對活性炭柱層析組分的單糖組成進行測定。從圖4可以看出，WO、EO均由阿拉伯糖和木糖組成，此外，還含有少量葡萄糖和半乳糖。由表2可知，WO中各單糖的物質的量比為阿拉伯糖∶木糖∶葡萄糖∶半乳糖=1∶1.89∶0.12∶0.05，EO中各單糖的物質的量比為阿拉伯糖∶木糖∶葡萄糖∶半乳糖=1∶3∶0.33∶0.03。WO、EO的分支度(A/X)分別為0.53和0.33，其中WO 的A/X較高，可以為阿魏酸基團的連接提供更多的取代位點。

圖4 活性炭柱層析水洗組分(WO)與醇洗組分(EO)的單糖離子色譜圖

表2 活性炭柱層析洗脫組分的單糖組成

2.5 紫外光譜分析

分別對MOPS緩沖液中的標準品阿魏酸、活性炭水洗組分WO及醇洗組分EO進行紫外波長掃描，結果如圖5所示。圖5顯示，在MOPS緩沖液中，標準阿魏酸和水洗組分WO均在286和325 nm附近有強吸收。其中，標準品阿魏酸在286 nm處有最大吸收，而WO在325 nm處有最大吸收，由此推斷活性炭水洗組分中有酯化的阿魏酸存在[12]。圖5顯示，活性炭醇洗組分EO在紫外區無吸收，說明EO中不含阿魏酸。

圖5 活性炭水洗組分(WO)和醇洗組分(EO)的紫外光譜

2.6 阿魏?；鶊F檢測

對活性炭柱洗脫組分中的游離態、結合態阿魏酸進行高效液相色譜檢測。由圖6可知，水洗組分WO中的阿魏酸主要以結合態形式存在，而游離態阿魏酸未檢出(圖略)，因此，其低聚糖為阿魏酰低聚糖。醇洗組分EO中的游離態、結合態阿魏酸均未檢出(圖略)，表明EO低聚糖中不存在阿魏酰基團。經計算，WO中的阿魏酰基團含量為42.78 mg/g。

圖6 活性炭柱水洗組分(WO)中結合態阿魏酸的HPLC圖譜

3 結論

采用木聚糖酶酶解黑小麥麩皮不溶性膳食纖維，所得酶解液經活性炭柱層析得到水洗組分(WO)和不同濃度醇洗組分(EO)。WO的低聚糖聚合度較高，為DP 4～7。不同濃度EO的低聚糖聚合度主要為DP 2～4，其含量隨著乙醇濃度的升高而相對增加。對水洗組分及醇洗合并組分的阿魏酰基團及單糖組成進行分析，WO中含有結合態阿魏酸，是阿魏酰低聚糖，其中阿魏?；鶊F含量為42.78 mg/g。EO中不存在結合態阿魏酸，是阿拉伯低聚木糖；WO和EO的低聚糖均主要由阿拉伯糖和木糖組成，WO分支度(A/X=0.53)高于EO(A/X=0.33)，這也為阿魏酰基團的連接提供了更多的取代位點。

[1]孫元琳, 崔璨, 顧小紅, 等. 黑小麥麩皮酚酸物質的定性分析與阿魏酸含量測定[J]. 中國糧油學報, 2014, 29(11): 113-117. Sun Yuanlin, Cui Can, Gu Xiaohong, et al. Qualitative analysis of phenolic acids and content determination of rerulic acids from black-grained wheat bran[J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2014, 29(11): 113-117

[2]Muralikrishna G, Rao M V. Cereal non-cellulosic polysaccharides structure and function relationship—an overview[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2007, 47(6): 599-610

[3]王金, 吳向陽, 仰榴青, 等. 堿解小麥麥麩制備阿魏酸的工藝條件研究[J]. 食品科技, 2008, 33(4): 107-109 Wang Jin, Wu Xiangyang, Yang Liuqing, et al. Study on preparative condition of ferulic acid from alkalihydrolysis of wheat bran[J]. Food Science and Technology, 2008, 33(4): 107-109

[4]Ishii. Structure and function of feruloylated polysaccharides[J]. Plant Science, 1997, 127(2): 111-127

[5]曾鳳彩. 酶解玉米麩皮制備阿魏酰低聚糖及其抗氧化性質的研究[D]. 齊齊哈爾：齊齊哈爾大學, 2012 Zeng Fengcai. Enzymic production and antioxidation activity of feruloylated oligosaccharides from corn bran[D].Qiqihaer：Qiqihaer University, 2012

[6]Allerdings E, Ralph J, Steinhart H, et al. Isolation and structural identification of complex feruloylated heteroxylan side-chains from maize bran[J]. Phytochemistry, 2006, 67(12): 1276-1286

[7]Savolainen O I. Isolation and structural elucidation of phytochemicals from rye bran fractions[D]. Finland: University of Eastern Finland, 2012

[8]Whistler R L. Tu C C. Isolation and properties of a series of cristalline oligosaccharides from xylan[J]. Journal of the Amenrican Chemists Scociety, 1952, 74(14): 3609-3612

[9]石波, 李里特. 低聚木糖的制備與分離[J]. 食品工業科技, 2004, 25(7): 113-114 Shi Bo, Li Lite. Preparation and isolation of xylooligosaccharides[J]. Science and Technology of Food Industry,2004, 25(7): 113-114.

[10]Bunzel M, Ralph J, Marita J M, et al. Diferulates as structural components in soluble and insoluble cereal dietary fiber[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2001, 81(7): 653-660

[11]洪楓, 勇強, 趙林果, 等. 木低聚糖的分離提純和定性分析[J]. 食品與發酵工業, 1999, 25(2): 35-38 Hong Feng, Yong Qiang, Zhao Linguo, et al.Isolation and purification of xylo-oligosaccharides[J]. Food and Fermentation Industries, 1999, 25(2): 35-38

[12]陳小娥, 方旭波, 余輝, 等. 殼寡糖的薄層層析[J]. 浙江海洋學院學報(自然科學版), 2008, 27(4): 361-365 Chen Xiao’e, Fang Xubo, Yu Hui, et al. TLC of analysis of chitooligosaccharides[J]. Journal of Zhejiang Ocean University(Natural Science), 2008, 27(4): 361-365

[13]Kroon P A, Conesa M T G, Colquhoun 2 J, et al. Process for the isolation of preparative quantities of [2-O-(trans-feruloyl)-α-L-arabinofuranosy]-(1-5)-L-arabinofuranose from sugarbeet[J]. Carbohydrate Research, 1997, 300(4): 351-354

[14]Sun Y L, Cui S, Gu X H, et al. Isolation and structural characterization of water unextractable arabinoxylans from Chinese black-grained wheat bran[J]. Carbohydrate Polymers, 2011, 85(3): 615-621.

Isolation and Composition Analysis of Functional Oligosaccharides from Black-Grained Wheat

Sun Yuanlin1Yi Xin2Li Yunlong3Shan Fang3Chen Shujun2

(Department of Life Science,Yuncheng University1, Yuncheng 044000)(College of Life Sciences,Shanxi University2, Taiyuan 030006)(Institute of Farm Products Comprehensive Utilization，Shanxi Academy of Agricultural Sciences3, Taiyuan 030031)

Functional oligosaccharides from black-grained wheat were isolated and composition analyzed. The insoluble dietary fiber (IDF) of black-grained wheat was hydrolyzed by xylanase, and the hydrolyzate was isolated by activated charcoal column chromatography. The oligosaccharide, monosaccharide composition and ferulic acid group of the fractions were analyzed with liquid chromatography and ion chromatography. The results showed that the water elution fraction WO and the different concentration of ethanol elution fraction EO were mainly composed of arabinose and xylose, which were arabinoxylooligosaccharides. WO was feruloylated oligosaccharides containing conjugated ferulic acids. WO has a high degree of polymerization with 4～7, while the DP of EO was lower with 2～4.

black-grained wheat; functional oligosaccharides; activated charcoal column chromatography

國家自然科學基金(31101244)，山西省自然科學基金(2012011031-1),山西省高校研究生教改項目(2015JG16)

2015-09-08

孫元琳，女，1971年出生，教授，農產品加工與綜合利用

S38

A

1003-0174(2017)05-0007-06