北冬蟲夏草副產物功能因子提取工藝研究

張斌，劉博華，溫祿云

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

北冬蟲夏草副產物功能因子提取工藝研究

張斌，劉博華，溫祿云

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

北冬蟲夏草副產物為成熟子實體采摘后的培養基殘基、菌絲體殘體，主要活性成分與子實體相近，為蟲草多糖、蟲草酸、蟲草素、腺苷類及蛋白質等。采用雙頻超聲波輔助提取技術、酶工程技術，對北冬蟲夏草副產物中的蟲草多糖、蟲草素、蟲草酸、多肽等功能因子進行提取。干燥提取物中多糖含量25.4%、蟲草素含量0.6%、蟲草酸含量5.2%、多肽含量23.7%。

北冬蟲夏草副產物；雙頻超聲波；酶工程

北冬蟲夏草又名北冬蟲夏草、北蟲草、蟲草花，拉丁學名為Cordycepsmilitaris，野生北冬蟲夏草是一種寄生于鱗翅目和鞘翅目昆蟲蛹提上的大型真菌，與傳統中藥材冬蟲夏草（Cordycepssinensis）同屬于子囊菌亞門，麥角菌目，蟲草菌屬[1]。北冬蟲草天然資源的世界性分布數量很少，由子座（草的部分）、核菌（蟲的尸體部分）組成，多以蛾蛹或蠶蛹為寄主[2]。既是一種珍稀的食用菌，又是一種珍貴的中藥材。2009年，經中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會批準，北冬蟲夏草可以作為新資源食品，可直接食用，也可作為食品原料，在酒類、罐頭、調味品、飲料中應用[3]，這為北冬蟲夏草資源的開發和利用起到了十分積極的作用。

1986年吉林省蠶業通過在家蠶和昨蠶上培養北蟲草成功獲得子實體[4]。90年代后，以大米培養基為主的固態培養基栽培法逐漸普及，這也是目前北冬蟲夏草最主要的人工培養方式。收獲北冬蟲夏草子實體后，培養基殘基通常被作為廢棄物處理，據統計可知栽培時北蟲草子實體干重與蟲草基干重之比為1∶3或1∶4，廢棄培養基勢必造成資源的極大浪費，堆積后發酸發臭對環境也產生一定的影響。隨著北蟲草栽培產業規模的不斷擴大，對北蟲草固體培養殘基如何進行產品加工開發、對活性成分的提取利用己成為迫切需要解決的問題。培養基殘基中仍含有部分蟲草子實體和大量菌絲體，目前己有利用北蟲草培養基殘基釀制功能型醋[5]、功能型保健醬油[6]等報道，但總體來說，剩余基質的利用率仍然較低。

經檢測，北蟲草培養基殘基中的營養成分與功能因子種類與子實體一致，均含有大量的蛋白質、氨基酸、蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖等[7]（見表1），雖含量較低，但其數量巨大，價格低廉，來源豐富，因此從剩余基質中提取營養物質和功能因子，具有一定的研究價值。

表1 北冬蟲夏草副產物中主要營養物質的含量對比Table 1 The content of main nutrients of Cordycepsmilitaris by-products

1 材料與方法

1.1 材料

人工培養北冬蟲夏草采收后的培養基殘基：天津東方中濱農業科技有限公司；中性蛋白酶（2×106U/g）、無水乙醇（均為食品級）：北方霞光食品添加劑有限公司；氫氧化鈉、硫酸鋁、苯酚、濃硫酸、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、L-鼠李糖、乙腈（均為分析純）：天津贏達稀貴化學試劑廠；蟲草素標品（色譜純）：國家標準物質中心。

1.2 主要儀器設備

酶解罐、雙頻超聲波發生器：天津市食品研究所有限公司自制；DZ-1AI電熱烘干箱、全波長紫外分光光度計、凱氏定氮儀：天津市泰斯特儀器有限公司；YLS-16A快速水分測定儀：上海精密科學儀器有限公司；LC-100高效液相色譜儀：日本島津公司；DGT-ZF-3雙效蒸發器：天津德固特科技有限公司；離心式噴霧干燥器：常州力馬干燥設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

培養基殘基→分選→破碎→雙頻超聲波輔助提取、酶解→滅酶→過濾→濃縮→噴霧干燥

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 分選

去除在運輸及貯藏過程中發生霉變或被污染的培養基。

1.3.2.2 破碎

加入培養基干基重量5倍～10倍的水，使用高剪切破碎機進行打漿破碎。破碎后的物料無明顯顆粒（≥0.2 cm3）。

1.3.2.3 雙頻超聲波輔助提取及酶解

將破碎的料漿置于加裝25 kHz和40 kHz雙頻超聲波裝置的提取罐，調節pH值至7.0～7.5，升溫至40℃～60℃，加入一定量中性蛋白酶，開啟攪拌，選擇超聲波功率200 W～400 W，處理20 min～60 min后，關閉超聲，繼續酶解2 h～5 h。

1.3.2.4 滅酶

將物料升溫至85℃，保持20 min，滅酶、殺菌。

1.3.2.5 過濾

酶解后的料液使用40目濾布進行粗濾，濾液使用80目板框過濾機進行過濾。

1.3.2.6 濃縮

濾液使用雙效蒸發器濃縮至可溶性固形物≥25%。

1.3.2.7 噴霧干燥

使用離心式噴霧干燥器進行噴霧干燥，進風溫度150℃，出風溫度80℃，噴霧干燥后的粉末水分含量≤5%。取樣進行多糖、粗蛋白含量、多肽含量（5000Da～10 000 Da）、游離氨基酸含量、蟲草酸、蟲草素的測定。

1.3.3 超聲波輔助工藝提取正交分析

根據丘泰球、曾榮華等[8-10]的研究結果25 kHz與40 kHz的雙頻超聲波對于植物中功效成分的提取效果最佳，因此本研究采用超聲頻率為25 kHz與40 kHz雙頻超聲波進行輔助提取，以料液比1∶8（g/mL），超聲功率300 W、處理40 min、溫度55℃，pH7.0為基礎條件，進行料液比=1∶5、1 ∶6、1 ∶7、1∶8、1∶9、1∶10（g/mL），超聲波功率 200、250、300、350、400 W，處理 20、30、40、50、60、70、80、90 min，處理溫度 45、50、55、60、65 ℃等單因素的水平試驗。處理后直接取料液，6 000 r/min離心10 min后，取上清液，進行多糖檢測，通過與預先檢測的未提取前物料的多糖含量計算提取率，確定各因素最佳條件為料液比、超聲波功率、處理溫度、處理時間在各自因素水平上的最佳條件為：1∶8（g/mL）、300 W、50 min、60 ℃。

據此設計L9（34）正交試驗，因素包括：料液比、超聲波功率、處理溫度、處理時間，因素水平表見表2。

表2 雙頻超聲波輔助提取優化條件試驗因素和水平Table 2 Dual-frequency ultrasound assisted extraction optimization condition test factors and levels

1.3.4 酶解工藝正交分析

采用的中性蛋白酶活力為2×105U/g，建議使用量為0.2%～0.8%，pH值為6～8，酶解溫度45℃～65℃。在最佳雙頻超聲波輔助提取條件下，以中性蛋白酶0.5%、（以物料干基重計），pH7.0，酶解溫度50℃、酶解4 h為基礎條件，進行中性蛋白酶添加量0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%，pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，酶解時間 2、3、4、5、6、7 h，酶解溫度 40、45、50、55、60、65℃單因素的水平試驗。處理后直接取料液，6 000 r/min離心10 min后，取上清液，進行總氮及氨基酸態氮的檢測，通過計算水解度，確定各因素最佳條件為中性蛋白酶添加量、pH值、值酶解溫度、酶解時間為在各自因素水平上的最佳條件為：0.5%、7.0、55℃、4 h。

據此設計L9（34）正交試驗，因素包括：中性蛋白酶添加量、pH值、酶解時間、酶解溫度，因素水平表見表3。

表3 酶解工藝條件試驗因素和水平Table 3 Enzyme hydrolysis condition test factors and levels

2 結果與討論

2.1北冬蟲夏草副產物超聲波輔助提取工藝條件研究

北冬蟲夏草副產物超聲波輔助提取正交試驗結果見表4。

由正交試驗可知，所選各因素在試驗范圍內對北冬蟲夏草副產物功能因子的提取效果有不同的影響，各因素對提取率影響的順序為D＞B＞C＞A，最佳的提取條件為A2B2C2D3。即料液比為1∶8（g/mL），超聲波功率300 W，處理時間50 min，處理溫度65℃。在此條件下進行驗證試驗，提取率為91.7%，多糖提取效果優于正交試驗結果。

表4 北冬蟲夏草副產物超聲波輔助提取正交試驗結果Table 4 C.militaris by-product of ultrasonic assisted extraction of orthogonal test results

2.2 酶解工藝條件研究

酶解工藝條件研究正交試驗見表5。

表5 北冬蟲夏草副產物超聲波酶解正交試驗結果Table 5 The results of orthogonal test of C.militaris by-product ultrasonic enzyme

由表5可知，所選各因素在試驗范圍內對北冬蟲夏草副產物中蛋白質的酶解效果有不同的影響，各因素對水解度影響的順序為A＞B＞C＞D，最佳的酶解條件為A3B3C3D2，即中性蛋白酶添加量0.6%、pH7.5、酶解時間為5 h、酶解溫度為55℃。在此條件下進行驗證試驗，水解度為35.7%，優于正交試驗結果。

2.3 北冬蟲夏草副產物提取物營養成分及功能因子分析

取3個批次噴霧干燥后的提取物粉末進行多糖、粗蛋白、多肽、蟲草酸、蟲草素含量的測定。測定結果見表6。

表6 北冬蟲夏草副產物提取物功能因子含量Table 6 C.militaris by-product Extract function factor content%

由表6可知，北冬蟲夏草副產物提取物多糖含量少于北冬蟲夏草子實體，粗蛋白含量、多肽含量、蟲草酸、蟲草素均明顯高于干燥子實體。經酶解處理后的副產物提取物多肽含量是未經酶解處理子實體的近10倍，蟲草酸含量超過子實體含量近50%，蟲草素含量超過子實體含量1倍。通過將北冬蟲夏草培養基殘基進行提取與酶解，不僅將廢物綜合利用，同時營養價值大幅提升。

3 結論

通過研究，北冬蟲夏草副產物功能因子提取的最佳工藝為將采收后的北冬蟲夏草培養基殘基按干物質重量加入8倍凈化水，使用高剪切破碎機破碎，使用10目篩網過濾后加入至安裝25 kHz和40 kHz雙頻超聲波發生裝置的提取罐內進行提取，首先開啟攪拌，調節pH值至7.5，之后將物料升溫至65℃，加入干基重0.6%的中性蛋白酶，開啟超聲波發生裝置進行輔助提取。超聲波功率300 W，開啟50 min，處理溫度65℃。超聲波輔助提取結束后，將溫度降至55℃繼續進行酶解，酶解310 min后，將料液升溫至85℃并保溫20 min滅酶、殺菌。經檢測多糖提取率為91.7%，水解度為35.7%，干燥提取物中多糖含量為22.0%、粗蛋白含量45.6%、多肽含量23.7%、蟲草酸含量5.2%、蟲草素含量0.6%。

[1] 邵力平.真菌分類學[M].北京:中國林業出版社,1984:11091

[2] 張顯科,王玉柱,劉文霞,等.北冬蟲夏草與冬蟲夏草化學成分比較[J].遼寧大學學報(自然科學版),1996,23(4):79-82

[3]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.衛生部關于批準蛹蟲草為新資源食品的公告(2009年第3號)[EB/OL].(2009-03-18).http://www.nhfpc.gov.cn/zwgkzt/wsbysj/200903/39591.shtml

[4] 古恒生,梁漫逸．人工培育北冬蟲夏草研究[J]．藥學情報通訊,1987,5(3):51

[5] 曾洪斌,李泰輝,鐘月金,等.北冬蟲夏草營養保健醋的研制[J].食品科學,2009,30(2):289-291

[6] 岳春姬,鄂豫,黃達偉,等.利用北冬蟲夏草培養基生產保健醬油的研究[J].中國調味品,2007(3):24-37

[7] 范衛強,尹鴻萍,周長林.蟲草多糖的分離、純化和初步藥效活性研究[J].生物加工過程,2008,6(1):69-73

[8] 丘泰球,曾榮華,張曉燕．雙頻超聲強化提取的機理[J]．華南理工大學學報(自然科學版),2006,34(8):89-93

[9] 曾榮華,丘泰球．雙頻超聲空化效應強化提取中藥有效成分的實驗研究[J]．聲學技術,2005,24(4):219-222

[10]賁永光,丘泰球,曾榮華.雙頻超聲強化從海金沙中提取黃麗的實驗研究[J].聲學技術,2006,25(3):209-213

The Research of Cordycepsmilitaris By-products Function Factor Extraction Process

ZHANG Bin，LIU Bo-hua，WEN Lu-yun
（Tianjin Food Research Institute Co.，Ltd.，Tianjin 301609，China）

Cordycepsmilitaris by-products is medium after picked fruit bodyand mycelium.Main active ingredient is similar to fruiting body including Cordycepsmilitaris polysaccharide，cordyceps acid，cordycepin，adenosine，protein，etc.The research adopts the dual-frequency ultrasound assisted extraction technology，enzyme engineering technology，extract of Cordycepsmilitaris polysaccharide，cordycepin，cordyceps acid，polypeptide，from C.militaris by-products.In the dry extract，polysaccharide content was 25.4%，cordycepin content was 0.6%，cordyceps acid content was 5.2%，polypeptide content was 23.7%.

Cordycepsmilitaris by-products；dual-frequency ultrasound；enzyme engineering technology

2017-03-31

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.013

天津市科技計劃項目（16YFFCZ00170）

張斌（1984—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：保健、功能食品加工技術。